还原条件下PH-MMAE形成多条条带，其中150KDa左右处的条带根据理论分 子量推测为完整抗体〇121^) ;1251((1&、1001((1&、751((1&、501((1 &和251(0&处的条带分别对应抗 体的（H2L)、（H2)、（HL)、（H)和（L)。与还原电泳的结果一样，PH-MMAE在不同位置的条带 都略高于抗体条带，说明分子量略大于抗体，表明这些片段均偶联上MMAE。
[0096] 3. 2HPLC 检测
[0097] MMAE含有较多的疏水基团，在高盐条件下，疏水基团暴露，与疏水纯化柱上的介质 结合，从而将带有偶联上MMAE的PH-MMAE分离出来。由于偶联的分子数不等，PH-MMAE中各 组分的疏水性能会有所差异，根据这一特点将PH-MMAE中各组分分离开。制备的PH-MMAE为 含有偶联不同数量MMAE的抗体混合物，其组成成分应为含有0-8个MMAE分子的抗体。HPLC 检测PH-MMAE共有5个峰，而抗体（PH)仅有1个峰。表明毒素分子确实偶联到抗体上，但 形成了小分子数量不同的不同组分。通过积分分析，在最适的还原条件和偶联条件下，偶联 率达80%以上，与巯基检测方法得出的结果一致。
[0098] 4、PH-MMAE抑制乳腺癌细胞的检测
[0099] 方法：
[0100] 4. 1不同细胞株HER2表达量测定
[0101] 为了检测不同的乳腺癌细胞株HER2的表达情况，选用抗HER2的荧光标记抗体与 之结合，抗体与HER2结合后细胞会带上荧光。利用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度，根 据荧光的强弱判断HER2表达量的多少。
[0102] ①用（λ25%胰酶（含(λ53mMEDTA)消化BT-474、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞株 ；
[0103] ②PBS离心洗涤细胞两次，加入20 μ 1的荧光标记流式抗体（抗HER2的阳性抗体） 到IO6个肿瘤细胞（〇. 5ml体积）充分混匀，20-25°C避光孵育20分钟，选用和不与HER2结 合的阴性抗体作为阴性对照；
[0104] ③用PBS洗涤2遍；
[0105] ④加入0.5ml的PBS溶液（1 %多聚甲醛）充分混匀，上流式细胞仪分析细胞表 HER2的表达。
[0106] 4. 2抗体药物偶联物亲和力测定
[0107] ①接种：取对数生长期的BT-474细胞计数，用含体积百分比10%胎牛血清的1640 培养基重悬密度至IX IO6细胞/ml，接种于96孔板，IX 10 4细胞/孔，细胞贴壁后，使其丰 度为70-90%，细胞过夜生长。
[0108] ②固定：次日弃掉培养基，200 μ1/孔加入0.25%戊二醛RT 25min加0· lmol/L甘 氨酸，200 μ1/孔，RT 30min。
[0109] ③封闭：用PBST洗涤液洗板3次，300 μ 1/孔加入0. 1%BSA封闭液封闭，RT60min。
[0110] ④样品处理
[0111] 用0. 1% BSA样品稀释液将待检样品、阴性和阳性对照品从起始浓度5. 0 μ g/ml，2 倍比稀释5个浓度，终浓度为0. 15625 μ g/ml。
[0112] 用洗涤液将封闭好的96孔板洗板2次，每孔加入100 μ 1稀释好的待检定样品、阴 性和阳性对照品。空白对照仅加入等体积样品稀释液，每个样品设3个复孔。轻拍板子使 样品混匀，室温放置60min。
[0113] ⑤二抗：用洗涤液将加样的96孔板洗板2次，加入稀释比例为1:1000的三羊抗人 IgG(H+L)/AP IOOul/ 孔，室温放置 60min。
[0114] ⑥显色：PBS洗板3次，显色液200 μ1/孔，避光RT 20min。
[0115] ⑦终止：终止液100 μ 1/孔。
[0116] ⑧检测：酶标仪405nm处读数。
[0117] 4. 3竞争性抑制
[0118] 竞争性抑制实验是为了验证抗体药物偶联物与抗体是否共同竞争HER2靶点，改 造后的抗体药物偶联物是否仍具有抗体活性，同时也可以间接证明抗体药物偶联物具有靶 向性。
[0119] 取对数生长期的SK-BR-3细胞，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗残留培养基，0. 5ml 胰酶消化，随后用4ml含10%胎牛血清的1640培养基终止消化，吹打均匀。
[0120] 血球计数板法进行细胞计数，1000 rpm离心5min，含10%胎牛血清的1640培养基 重悬。10000个/孔接种于96孔板，37°C 5% CO2细胞贴壁生长过夜。
[0121] SK-BR-3乳腺癌细胞在100ng/ml PH-MMAE作用同时，分别添加1-5倍浓度的PH作 用于细胞，37°C、体积分数为5%的CO2条件下进行常规贴壁培养72h。
[0122] WST-8能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色甲臢染料，颜色的深浅与细胞的 增殖成正比，而与细胞毒性成反比，其在450nm处有特异性吸收。其准确度和灵敏度远高于 MTT 法。
[0123] 样品作用结束后，IOul/孔加入WST-8显色液，作用2小时后，酶标仪在450nm处读 数。
[0124] 4. 4细胞毒性实验
[0125] 为了检测抗体药物偶联物对HER2表达量不一样的肿瘤细胞生长抑制情况，同 时对比两种不同连接子所偶联的抗体药物偶联物的生物活性差异，选用HER2高表达的 BT-474、中表达的SK-BR-3、低表达的MDA-MB-231细胞作为研究对象，通过CCK法检测其对 细胞生长的抑制作用。
[0126] 取对数生长期的BT-474、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞，弃去培养基，用PBS缓冲液清 洗残留培养基，0. 5ml胰酶消化，随后用4ml含10%胎牛血清的1640培养基终止消化，吹打 均勾。血球计数板法进行细胞计数，1000 rpm离心5min，含10%胎牛血清的1640培养基重 悬。10000个/孔接种于96孔板，37°C 5% CO2细胞贴壁生长过夜。
[0127] 取PH、PH-MMAE溶液，用含10%胎牛血清的1640培养基稀释。添加不同浓度的药 物，作用于含有细胞的96孔板，37°C、体积分数为5%的CO 2条件下进行常规贴壁培养72h。
[0128] WST-8显色，450nm吸光值读数，方法同竞争性实验。
[0129] 4. 5细胞凋亡检测
[0130] (1)接种：取对数生长期的BT-474细胞计数，以2 X IO5细胞/孔接种到六孔板中， 体积为I. 8ml，细胞贴壁后，细胞过夜生长。
[0131] (2)给药：分别将PH、PH-MMAE用含10%胎牛血清的1640培养基稀释至终浓度为 2.5ug/ml。将PH、PH-MMAE加入各孔，空白对照添加等体积的含10%胎牛血清的 1640 培养 基，终体积为2ml。在37°C、体积分数为5%的C02条件下进行常规贴壁培养24h、48h、72h。
[0132] (3)细胞处理
[0133] ①取给药后的细胞，收集上清，用PBS缓冲液清洗残留培养基，用不含EDTA的胰酶 消化细胞，收集消化下来的细胞。
[0134] ② 1000 rpm 离心 3min。
[0135] ③弃上清，用PBS缓冲液重悬细胞，1000 rpm离心3min，重复两次。
[0136] 细胞计数，用AnnexinV Binding Solution调整细胞浓度为I X IO6细胞/ml 〇
[0137] ④从IX IO6细胞/ml的细胞悬液中取100 μ 1加入到EP管中，每管分别添加5 μ 1 凋亡早期染料Annexin V-FITC和凋亡晚期染料PI solution。
[0138] ⑤室温下避光孵育15min。
[0139] ⑥孵育结束后每管添加300 μ I AnnexinV Binding Solution终止染色。
[0140] (4)流式细胞仪检测
[0141] ①开机，连接系统，用清洗液清洗管道，然后用CldH2O冲洗管道。
[0142] ②选择模板，调节电压和电流。
[0143] ③进样检测。
[0144] ④软件分析。
[0145] 4. 6细胞周期检测
[0146] (1)接种：取对数生长期的BT-474细胞计数，以2X IO5细胞/孔接种到六孔板中， 体积为I. 8ml，细胞贴壁后，细胞过夜生长。
[0147] (2)给药：分别将PH、PH-MMAE用含10%胎牛血清的1640培养基稀释至终浓度为 2.5μg/ml。将PH、PH-MMAE加入各孔，空白对照添加等体积的含10%胎牛血清的 1640培养