抑制 剂也已在临床使用，其安全性、药物代谢特性、毒副作用已经明确。而此次发现运两个药物 抗埃博拉病毒的新用途将可快速使其应用于高危病毒感染，缓解疫情。
【附图说明】 阳153] 图1.阿奇霉素阻断埃博拉病毒感染活性。 阳154] 图2.泰利霉素阻断埃博拉病毒感染活性。 阳155] 图3.克拉霉素阻断埃博拉病毒感染活性。 阳156] 图4.螺旋霉素阻断埃博拉病毒感染活性。 阳157] 图5.替米考星阻断埃博拉病毒感染活性。
[0158] 图6.两性霉素 B阻断埃博拉病毒感染活性。
[0159] 图7.他克莫司阻断埃博拉病毒感染活性。
[0160] 图8.阿奇霉素阻断马尔堡病毒感染活性。 阳161] 图9.泰利霉素阻断马尔堡病毒感染活性。 阳162]图10.醋竹桃霉素阻断马尔堡病毒感染活性。 阳163] 图11.螺旋霉素阻断马尔堡病毒感染活性。
[0164] 图12.他克莫司阻断马尔堡病毒感染活性。 阳1化]图13.丝状病毒基因进化树。
【具体实施方式】 阳166] 实施例1.筛选模型的原理
[0167] 丝状病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒 感染。丝状病毒包膜表面的糖蛋白（Glycoprotein, G巧是丝状进入过程的关键蛋白。
[0168] 我们合成了扎伊尔型埃博拉病毒的包膜GP基因（邸OV-Zaire GP，Gene Accession No. Ll 1365)、苏丹型埃博拉病毒包膜GP基因（邸OV-Sudan GP, Gene Accession No. FJ968794.1)和马尔堡病毒包膜 GP 基因 （Marburg GP, Gene Accession No. NC_001608. 3)。通过共转染表达GP蛋白质粒和抑L4-3-LUC-R E，可获得丝状 病毒GP为外壳包裹HIV核屯、的邸OV重组病毒邸V-GP/HIV [Manicassamy B, Wang J,Jiang H,民ong L.Comprehensive analysis of ebola virus GPl in viral entry. J Virol. 2005 :79:4793-805.]和 Marburg 重组病毒 MGP/HIV[Manicassamy B，Wang J，et al.Characterization of Marburg virus glycoprotein in viral entry. Virology. 2007 :358:79-8引。该病毒颗粒具有W下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决 于GP的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿 主细胞并且不能复制，所W该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个巧光素酶报告基因， 因此被感染的细胞会表达巧光素酶，通过检测巧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程 度。同时，我们还制备了 W水瘤性口膜炎病毒VSV的糖蛋白（VSV-G)为外膜蛋白的VSV-G/ HIV重组病毒作为模型对照组。当化合物可抑制邸V-GP/HIV病毒的进入，而对VSV-G/HIV 病毒的进入无显著抑制时，视为特异性丝状病毒进入抑制剂。 阳169] 实施例2.实验方法
[0170]在本发明中应用了邸OV-Zaire (Gene Accession No. Ll 136f5)、邸OV-Sudan (Gene Accession No. FJ968794. I)和 Marburg(Gene Accession No. NC_001608. 3)对大环内醋类 药物抗丝状病毒感染进行药理活性评价： 阳 171]重组病毒制备[Manicassamy B, Wang J, Jiang H, Rong L Comprehensive analysis of ebola virus GPl in viral entry. J Virol. 2005;79:4793-805.]:共转 染 2 y g pcDNA3. I/邸OV-Zaire GP 质粒（或 2 y g pcDNA3. I/邸OV-Sudan GP 质粒或 2 y g PCDNA3. 1/Marburg GP 质粒）和 2 y g P化4-3-Luc-R E 质粒至 293T 细胞，转染后 48 h 收 集上清，上清液经0.45 ym滤膜过滤，该上清中含有邸OV-Zaire GP/HIV病毒颗粒（或 邸OV-Sudan GP/HIV病毒颗粒或Marburg GP/HIV病毒颗粒），该重组病毒可用于感染。按 照同样方法制备VSV-G/HIV重组病毒。 阳 172] 感染[Manicassamy B, Wang J, Jiang H, Rong L. Comprehensive analysis of ebola virus GPl in viral entry. J Virol. 2005 ;79:4793-805.]:感染前一天，按每孔 6 X IO4个细胞的密度将A549细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛 选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，WDMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的 病毒液感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50 y 1细胞裂 解液（Promega)裂解细胞，将30 y 1巧光素酶底物（Promega)与20 y 1细胞裂解液混合后 用FB15巧光检测器（Sirius)仪器测定细胞巧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病 毒的感染的水平。结果显示，大环内醋类药物可有效抑制丝状病毒对宿主细胞的感染，结果 见表1、表2和表3,部分量效曲线见图2-12。
[0173] 表1大环内醋类药物对邸OV-Zaire重组病毒感染的作用
阳1巧]表2大环内醋类药物对邸OV-Sudan重组病毒感染的作用 阳 176]
[0177] 表3大环内醋类药物对Marburg重组病毒感染的作用
势化霉薰 21.5 身4 % 唾红霉素 化7 明％ 他克莫司 10.身 95 3% 化美莫司 化5 貌％ 阳180] 实施例3.细胞毒性试验 阳1川应用MTS法测定了所有设及的药物对A549和293T细胞的细胞毒性，结果显示阿 奇霉素、泰利霉素、克拉霉素、碳霉素 A、交沙霉素、北里霉素、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉 素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、±拉霉素、氣红霉素、替米考星、罗他霉素、哇红霉素、两性霉素 B、他克莫司、化美莫司、西罗莫司在10 y M的终浓度下均无细胞毒性。
【主权项】
1. 具有大环内酯类结构特征的药物在制备预防或治疗抗丝状病毒的药物中的应用。2. 根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的具有大环内酯类结构特征的药物选自 阿奇霉素、泰利霉素、克拉霉素、碳霉素A、交沙霉素、北里霉素、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉 素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、土拉霉素、氟红霉素、替米考星、罗他霉素、喹红霉素、他克莫司、 吡美莫司、西罗莫司、两性霉素B中至少一种。3. 根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述的丝状病毒为埃博拉病毒。4. 根据权利要求3中任一项的应用，其特征在于，所述的埃博拉病毒为扎伊尔型、苏丹 型、莱斯顿型、科特迪瓦型和本迪布焦型。5. 根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述的丝状病毒为马尔堡病毒。
【专利摘要】本发明公开了大环内酯类药物的在抗丝状病毒感染方面的应用。本发明包含大环内酯类药物对丝状病毒感染的预防或治疗中的应用，所述的具有大环内酯类结构特征的药物选自阿奇霉素、泰利霉素、克拉霉素、碳霉素A、交沙霉素、北里霉素、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、土拉霉素、氟红霉素、替米考星、罗他霉素、喹红霉素、他克莫司、吡美莫司、西罗莫司、两性霉素B中至少一种。
【IPC分类】A61K31/7052, A61K31/7048, A61P31/14, A61K31/706, A61K31/436
【公开号】CN105477007
【申请号】CN201410468560
【发明人】郭颖, 陈勍, 霸明宇, 王丽丽, 唐克
【申请人】中国医学科学院药物研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月15日