即不同剂量给予EGCG灌胃预处理3d后，给 予LPS处理。表1和表2说明：LPS对照组化后CD14、CD14-化R复合物显著升高（与Control组比 较）;EGCG预处理组的3个不同剂量组，CD14、CD14-TLR4复合物水平不同程度的被抑制，其中 EGCG IOOuM组效果最明显。EGCGlmM组的CDHXDM-llJM复合物被抑制的效果与EGCGlOOuM 相似，但EGCGlmM组的EGCG使用剂量过大，所W综合因素，EGCG 1 OOuM组的效果最好。
[0027] 外周血中IL-6、TNF水平显著下降，见表3 EGCG对外周血IL-6水平的影响(mean± S，ng/ml)和表4 EGCG对外周血TNF水平的影响(mean± S，ng/ml); 表3 EGCG对外周血比-6水平的影响(mean±s，ng/ml)_
表4 EGCG对外周血TNF水平的影响(mean±S，ng/ml)
表3和表4说明：正常BALB/c小鼠随机分组，每组10只，分组情况：con化〇1即正常对照 组，无任何药物干预;LPS组即WS对照组，即给予LPS(IOmgAg)制作小鼠脈毒症模型;EGCG+ LPS分为3个剂量组：IOuM组，IOOuM组W及ImM组，即不同剂量给予EGCG灌胃预处理3d后，给 予LPS处理。表3和表4说明：LPS对照组化后外周血中IL-6、TNF水平显著升高（与Control组 比较）;EGCG预处理组的3个不同剂量组，比-6、TNF水平不同程度的被抑制，其中EGCG IOOuM 组效果最明显，EGCGlmM组的化-6、TNF被抑制的效果与EGCGlOOuM相似，但EGCG使用剂量过 大，所W综合因素，EGCG 1 OOuM组的效果最好。
[002引小鼠肺组织中化R4水平显著降低，见表5 EGCG抑制小鼠肺组织中化R4的表达 (mean±s)； 表5 EGCG抑制小鼠肺组织中化R4的表达(mean ± S)
表5说明：正常BALB/c小鼠随机分组，每组10只，分组情况:contro 1即正常对照组，无任 何药物干预;LPS组即WS对照组，即给予LPS (1 Omg/kg)制作小鼠脈毒症模型;EGCG+LPS分为 3个剂量组：IOuM组，IOOuM组W及ImM组，即不同剂量给予EGCG灌胃预处理3d后，给予WS处 理后，按照时间点分别提取小鼠的肺组织，检测化R4的表达水平。表5说明：LPS对照组化后 化R4表达显著升高（与Control组比较）;EGCG预处理组的3个不同剂量组化后化R4水平不同 程度的被抑审Ij，其中EGCG 1 OOuM组效果最明显，EGCG ImM组的TLR4被抑制的效果与 EGCGl OOuM相似，但EGCG使用剂量过大，所W综合因素，EGCG 1 OOuM组的效果最好。
[0029]小鼠肺血管内皮细胞巧离子内流被显著抑制，如图1所示，小鼠肺血管内皮细胞的 巧离子曲线。Vehicle组为基线水平的巧离子曲线，即肺血管内皮没有受到刺激时的巧曲 线;LPS组为WS刺激后的细胞巧离子曲线;LPS+EGCG是WS刺激的同时给予EGCG处理的巧离 子曲线。结果显示:Vehicle的巧离子曲线为基线水平，没有浓度波动;LPS处理过的巧离子 流动显著升高，而经EGCG处理后，LI^刺激的巧离子流动显著被抑制。
[0030] 而TLR4 (-/-)组小鼠外周血中虽然CD 14也被EGCG抑制，但IL-6、TNF的水平被抑制 的不显著，见表6TLR4(-/-)基因敲除小鼠外周血中CD14水平的变化、表7TLR4(-/-)基因敲 除小鼠外周血中IL-6水平的变化和表8TLR4 (-/-)基因敲除小鼠外周血中TNF水平的变化， 因此证明EGCG特异性抑制CD14、TLR4复合物，从而阻断LPS对LTR4信号的活化，抑制了化R4 信号介导的炎症反应介质的释放，W及巧超载损伤。EGCG对LPS介导的炎症介质释放和巧超 载的抑制与EGCG特异性阻断CD14-TLR4信号密切相关。
[0031] 表6 TLR4(-/-)基因敲除小鼠外周血中CDl4水平的变化
表7化34(-/-)基因敲除小鼠外周血中比-6水平的变化
表8化R4 (-/-)基因敲除小鼠外周血中TNF水平的变化
表6、表7、表8说明：利用化R4(-/-)基因敲除鼠重复化R4基因正常小鼠的实验，采用相 同剂量和实验条件给予LPS，W及EGCG处理。结果表明，TLR4(-/-)基因敲除小鼠给予EGCG预 处理后，再给予LPS刺激，其外周血中CD14的水平被显著的抑制（与单纯LPS刺激对照组比 较）；而外周血中IL-6的水平，W及TNF的水平没有被显著的抑制（与单纯LPS刺激对照组比 较)。
[0032] 2、EGCG预处理的脈毒症小鼠模型的死亡率显著下降，如图2所示，EGCG对内毒素 血症小鼠生存率（Survival%)的影响。LPS 10mg/kg，EGCG IOOuM/只，EGCG连续灌胃3d后给 予LPS处理后连续观察5d，记录小鼠5d内的死亡数，然后计算小鼠的生存率。上图说明：N为 正常对照组，小鼠5d内的生存率为100%; EGCG为给予单纯给予EGCG灌胃组，5d内的生存率为 100%;LPS为给予LPS处理组，5d内死亡率为100%; EGCG pre为EGCG预先处理组，即预先给予 EGCG灌胃3d，然后给予LPS处理后连续观察5d的生存率为40%;而EGCG+LPS为给予EGCG处理 化后即给予LPS处理组，其5d生存率为30%。总的来说，无论是EGCG有无预先处理，EGCG都对 LPS造成的致死性毒性有显著的抑制作用化GCG预先处理生存率为40%，而EGCG无预先处理 的生存率为30%)，对小鼠的生存率有显著的改善作用。与EGCG非处理组比较，EGCG预处理 (EGCGlOOuM/只，连续灌胃3天)组的小鼠5天死亡率显著降低。
[0033] 本发明所举实施方式或者实施例对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步 详细说明，所应理解的是，W上所举实施方式或者实施例仅为本发明的优选实施方式而已， 并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. EGCG在制备对抗脓毒症细菌内毒素靶向药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述脓毒症可以为重症脓毒症、脓毒症休 克。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述EGCG特异性作用于CD14-TLR4受体复 合物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述EGCG加入其它治疗脓毒症的药物中， 起到靶向作用，所述其它治疗药物为抗感染类药物或重组人活化蛋白C，所述抗感染类药物 为抗生素类、抗真菌类、抗病毒类、抗支原体类、抗肿瘤类或免疫抑制剂;所述抗生素类为β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、酰胺醇类或大环内脂类，所述抗真菌类为多烯类、三唑 类、嘧啶类或棘白菌素类。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述EGCG和适量药学上可以接受的载体制 备成药物制剂。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述药物制剂为溶液制剂或干粉制剂，所 述药物制剂的给药形式为静脉给药或皮下注射或腹腔内注射或肌肉注射。
【专利摘要】本发明公开了一种EGCG在制备对抗脓毒症细菌内毒素靶向药物中的应用，所述的EGCG加入其它治疗脓毒症的药物中，起到靶向作用，所述的EGCG可和适量药学上可以接受的载体制备成药物制剂，所述的药物制剂为溶液制剂或干粉制剂，所述药物制剂的给药形式为静脉给药，皮下注射，腹腔内注射或肌肉注射。本申请发现EGCG的新药理作用，EGCG特异性作用于CD14-TLR4受体复合物，可显著抑制外周血中CD14以及CD14-TLR4复合物水平，能有效对抗LPS致死性细胞毒性效应。
【IPC分类】A61P31/04, A61K31/353
【公开号】CN105497010
【申请号】CN201510936403
【发明人】孙荣距, 肖建国, 陈威, 黎檀实, 张文涛
【申请人】孙荣距
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月16日