人骨形态发生蛋白-2复合材料及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种人骨形态发生蛋白?2复合材料及其制备方法和应用。所述复合材料包括：(a)多孔载体、(b)骨形态发生蛋白BMP?2和(c)糖皮质激素类药物，并且(b)和(c)负载于(a)上。本发明的复合材料可有效加速骨组织的修复速度，改善修复效果。
【专利说明】
人骨形态发生蛋白-2复合材料及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体地说，本发明设及一种包含多孔载体、BMP-2和糖 皮质激素类药物的复合材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 骨组织缺损是骨科临床面临的重要难题。我国每年骨组织缺损患者超过500万人， 其中因骨质疏松引起的脊柱和四肢骨骼等的骨折患者人数在200万人W上；因骨肿瘤切除、 脊柱融合等需进行骨移植手术的患者约40万例。因此，骨组织缺损与损伤已成为影响人们 健康和生活的一种重要疾病。
[0003] 目前，自体骨移植是临床治疗骨缺损的金标准。但是该方法会给患者带来较大的 痛苦和手术并发症，而且存在自体骨来源有限、异体骨存在免疫排斥反应等突出问题，运使 得骨组织修复材料的研究引起广泛的关注。然而，目前应用于临床的骨组织修复材料或制 品的成骨活性普遍欠佳，尤其是对于大段骨缺损部位，有的甚至出现延迟愈合或不愈合，不 仅导致医疗费用增加，更增加患者痛苦。
[0004] 综上所述，本领域迫切需要研发出新型的高活性骨修复材料。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种包含多孔载体、BMP-2和糖皮质激素类药物的复合材 料及其制备方法和应用，所述复合材料能够发挥协同作用，治疗骨缺损，克服现有BMP-2在 临床使用过程中存在的高剂量W及由此带来的高成本和临床并发症等问题。
[0006] 本发明第一方面，提供一种复合材料，所述复合材料包括：
[0007] (a)多孔载体、（b)骨形态发生蛋白BMP-2和(C)糖皮质激素类药物，并且(b)和(C) 负载于(a)上；
[000引其中，所述(b)与（C)负载量的质量比为1: 3-1:15(较佳地为1:5-1:12)，并且所述 (a)多孔载体的孔隙率为50%-90% (较佳地为60%-80% )。
[0009] 在另一优选例中，所述(b)与(a)的重量之比为0.1-5000yg:lg，较佳地为100-2000 yg:Ig。
[0010]在另一优选例中，所述(b)与（a)的重量之比为0. l-5yg: Ig，较佳地为0.5-Uig: Ig。
[0011] 在另一优选例中，所述(b)与(a)的重量之比为l-30yg:lg，较佳地为5-10yg:lg。
[0012] 在另一优选例中，所述BMP-2为重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)。
[0013] 在另一优选例中，所述糖皮质激素类药物选自下组:地塞米松、倍他米松、氨化可 的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、或其组合，较佳地为地塞米松。
[0014] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体为多孔类骨憐灰石载体。
[0015] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体包含憐酸四巧和憐酸氨二巧。
[0016] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体的孔径为100-500皿(较佳地为150-450皿，更 佳地为200-400μπι)。
[0017] 本发明第二方面，提供一种制备如本发明第一方面所述的复合材料的方法，包括 步骤：
[0018] (i)提供一种药物混合物和所述(a)多孔载体，其中，所述药物混合物包括所述(b) 骨形态发生蛋白BMP-2和所述(C)糖皮质激素类；
[0019] (ii)将所述药物混合物施涂到所述(a)多孔载体上，其中所述(b)和所述(C)的质 量比为1:3-1:15(较佳地为1:5-1:12)，形成所述复合体1;
[0020] (iii)将所述复合体1在真空条件下冻干处理，制得本发明第一方面所述的复合材 料。
[0021] 在另一优选例中，所述步骤（iii)中，所述真空条件的真空度为《10化，较佳地为 《5口日，更佳地为《2口曰。
[0022] 在另一优选例中，所述步骤（iii)中，所述冻干处理的时间为5-120min(较佳地为 lO-lOOmin，更佳地为20-80min)。
[0023] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0024] 将riiBMP-2和糖皮质激素药物混合，滴加在多孔类骨憐灰石上，放置于真空干燥器 中，保持30min，然后用真空冷冻干燥机无菌冻干得到所述复合材料。
[0025] 在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述的多孔载体用包括W下步骤的方法制备：
[0026] (1)将憐酸巧盐、制孔剂、水混合，得到混合浆料1，其中，所述憐酸巧盐与制孔剂的 质量比为1:0.5-1:2;
[0027] (2)将所述混合浆料1填入模具，在l-5MPa的压力下(较佳地为1.5-4.5MPa，更佳地 为2-4MPa)保压，得到支架胚体；
[0028] (3)将所述支架胚体进行固化，得到经固化的支架胚体；
[0029] (4)对所述的经固化的支架胚体进行浸泡处理，从而得到所述多孔载体。
[0030] 在另一优选例中，所述多孔载体为多孔类骨憐灰石载体。
[0031] 在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述制孔剂为NaCl。
[0032] 在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述制孔剂的粒径为100-500μπι(较佳地为300- δΟΟμL?，更佳地为500-600μπι)。
[0033] 在另一优选例中，所述多孔类骨憐灰石载体为圆柱体。
[0034] 在另一优选例中，所述多孔类骨憐灰石载体的直径约4± 1mm，高约3± 1mm。
[0035] 在另一优选例中，所述步骤（2)中，所述保压时间为O.l-lOmin(较佳地为0.5- 8min，更佳地为l-6min)。
[0036] 在另一优选例中，所述步骤(2)包括:将所述混合浆料1填入模具，在2±0.5MPa的 压力下保压〇.5-5min，得到支架胚体。
[0037] 在另一优选例中，所述步骤(3)包括:将所述支架胚体在37 ±3°C、90-100%湿度的 恒溫恒湿箱中固化1-7天。
[0038] 在另一优选例中，所述步骤(4)包括:将固化的支架胚体用蒸馈水浸泡，直至制孔 剂被溶解，从而形成所述多孔载体。
[0039] 在另一优选例中，所述步骤(4)还包括：：对所述的多孔载体进行干燥处理，从而得 到干燥的多孔类骨憐灰石载体。
[0040] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可w互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0041] 图1显示了实施例1所述的多孔类骨憐灰石载体的理化性能表征：
[0042] A图为多孔类骨憐灰石照片及尺寸示意；
[0043] B图为多孔类骨憐灰石支架的邸S元素分析和广角XRD图谱；
[0044] C图为SEM拍摄的支架连通大孔和微孔形貌，W及表面针状径基憐灰石晶体形貌。
[0045] 图2显示了复合材料1的(A)扫描电镜拍摄的表面形貌，（B)rhBMP-2蛋白缓释曲线， (C)缓释蛋白结构分析，W及(D)地塞米松缓释曲线。
[0046] 图3显示了实施例1-5、对比例1-3所述的复合材料的体外成骨ALP活性。
[0047] 图4显示了实施例1-5、对比例2所述的复合材料的体外矿化沉积。
[004引图5显示了实施例6-8、对比例4所述的多孔类骨憐灰石固载扣g riiBMP-2W及不同 比例的地塞米松植入小鼠体内异位成骨2周和4周后，取出样品的数码照片和湿重、灰重质 量数据。
【具体实施方式】
[0049]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，特定比例的BMP-2与糖皮质激 素类药物负载于特定的多孔载体上时，能够更好地发挥协同效应W诱导成骨分化，治疗骨 缺损。在此基础上完成了本发明。
[(K)加]术语说明
[0051] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0052] 如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语"约"意指该值可W从列举的 值变动不多于1 %。例如，如本文所用，表述"约100"包括99和101和之间的全部值（例如， 99.1、99.2、99.3、99.4等）。
[0053] 如本文所用，术语"含有"或"包括(包含r可W是开放式、半封闭式和封闭式的。换 言之，所述术语也包括"基本上由…构成"、或"由…构成"。
[0化4] BMP-2
[0055] 骨组织设及细胞外基质与信号分子的识别、相关因子的表达、祀向作用和新骨的 发育成熟等一系列链式过程，其中细胞生长因子起着至关重要的作用。转化生长因子-0超 家族的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)被证明具有突出的诱导成骨分化和促进成骨的功能，人 重组BMP-2(rhBMP-2)于2002年被美国FDA和欧洲医药管理机构批准应用于脊柱融合、腔骨 骨折和齿科移植，广泛地用于骨支架的活性化修饰化.Attisano and J丄.Wrana，Science， 2002,296,1646;D.Qien,Μ.Zhao and G.R.Mundy,G;row1:h i^ictors,2004,22,233)。然而，临 床应用发现，BMP-2的实际用量大大高于试验中的动物使用剂量，不仅提高了手术成本，而 且提高了因大剂量使用可能存在的潜在风险。
[0056] 类骨憐灰石
[0057] 本发明所述的类骨憐灰石材料是由憐酸巧盐等几种材料复合而成的，在生理环境 条件下，讲过常溫水化转化可形成化学组成和结晶度均接近自然骨的低结晶度类骨憐灰 石，具有优异的生物活性和生物相容性。
[005引复合材料
[0059] 本发明的复合材料，包括：
[0060] (a)多孔载体、（b)骨形态发生蛋白BMP-2和(C)糖皮质激素类药物，并且(b)和(C) 负载于(a)上；
[0061 ]其中，所述(b)与（C)负载量的质量比为1: 3-1:15(较佳地为1:5-1:12)，并且所述 (a)多孔载体的孔隙率为50%-90% (较佳地为60%-80% )。
[0062] 在另一优选例中，所述(b)与(a)的重量之比为0.1-5000yg:lg，较佳地为100-2000 yg:Ig。
[0063] 在另一优选例中，所述(b)与(a)的重量之比为0.1 -化g: 1 g，较佳地为0.5-化g: 1 g。
[0064] 在另一优选例中，所述(b)与(a)的重量之比为1 -30yg: 1 g，较佳地为5-1 Oyg: 1 g。
[0065] 本发明中，用于细胞培养时，（b)与(a)的重量之比较佳地为0.1-扣g:lg，更佳地为 0.5-lyg: 1 g;而用于动物体内成骨时，（b)与（a)的重量之比较佳地为1 -30yg: 1 g，更佳地为 5-10yg:Ig。
[0066] 在另一优选例中，所述BMP-2为重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)。
[0067] 在另一优选例中，所述糖皮质激素类药物选自下组:地塞米松、倍他米松、氨化可 的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、或其组合，较佳地为地塞米松。
[0068] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体为多孔类骨憐灰石载体。
[0069] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体包含憐酸四巧和憐酸氨二巧。
[0070] 在另一优选例中，所述(a)多孔载体的孔径为100-500μπι(较佳地为150-450μπι，更 佳地为200-400μπι)。
[0071 ]制备方法
[0072] 本发明提供一种制备如本发明第一方面所述的复合材料的方法，包括步骤：
[0073] (i)提供一种药物混合物和所述(a)多孔载体，其中，所述药物混合物包括所述(b) 骨形态发生蛋白BMP-2和所述(C)糖皮质激素类；
[0074] (ii)将所述药物混合物施涂到所述(a)多孔载体上，其中所述(b)和所述(C)的质 量比为1:3-1:15(较佳地为1:5-1:12)，形成所述复合体1;
[0075] (iii)将所述复合体1在真空条件下冻干处理，制得本发明第一方面所述的复合材 料。
[0076] 在另一优选例中，所述步骤（iii)中，所述真空条件的真空度为《10化，较佳地为 《5口日，更佳地为《2口曰。
[0077] 在另一优选例中，所述步骤（iii)中，所述冻干处理的时间为5-120min(较佳地为 lO-lOOmin，更佳地为20-80min)。
[0078] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0079] 将riiBMP-2和糖皮质激素药物混合，滴加在多孔类骨憐灰石上，放置于真空干燥器 中，保持30min，然后用真空冷冻干燥机无菌冻干得到所述复合材料。
[0080] 在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述的多孔载体用包括W下步骤的方法制备：
[0081] (1)将憐酸巧盐、制孔剂、水混合，得到混合浆料1，其中，所述憐酸巧盐与制孔剂的 质量比为1:0.5-1:2;
[0082] (2)将所述混合浆料1填入模具，在1-5M化的压力下(较佳地为1.5-4.5MPa，更佳地 为2-4MPa)保压，得到支架胚体；
[0083] (3)将所述支架胚体进行固化，得到经固化的支架胚体；
[0084] (4)对所述的经固化的支架胚体进行浸泡处理，从而得到所述多孔载体。
[0085] 在另一优选例中，所述多孔载体为多孔类骨憐灰石载体。
[0086] 在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述制孔剂为NaCl。
[0087] 在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述制孔剂的粒径为100-500μπι(较佳地为300- δΟΟμL?，更佳地为500-600μπι)。
[0088] 在另一优选例中，所述多孔类骨憐灰石载体为圆柱体。
[0089] 在另一优选例中，所述多孔类骨憐灰石载体的尺寸为直径约4±lmm，高约3±lmm。
[0090] 在另一优选例中，所述步骤（2)中，所述保压时间为O.l-lOmin(较佳地为0.5- 8min，更佳地为l-6min)。
[0091] 在另一优选例中，所述步骤(2)包括:将所述混合浆料1填入模具，在2±0.5MPa的 压力下保压〇.5-5min，得到支架胚体。
[0092] 在另一优选例中，所述步骤(3)包括:将所述支架胚体在37 ±3°C、90-100%湿度的 恒溫恒湿箱中固化1-7天。
[0093] 在另一优选例中，所述步骤(4)包括:将固化的支架胚体用蒸馈水浸泡，直至制孔 剂被溶解，从而形成所述多孔载体。
[0094] 在另一优选例中，所述步骤(4)还包括：：对所述的多孔载体进行干燥处理，从而得 到干燥的多孔类骨憐灰石载体。
[00M]测试实验及方法
[0096] 1、材料表征
[0097] 采用X射线衍射(X畑，Rigaku D/max 2550VB/PC Japan)对多孔类骨憐灰石载体进 行物相分析;采用场发射扫描电子显微镜镜(FE-SEM，HitacM S-4800)观察支架及复合材 料的大孔结构、表面微孔结构和固载蛋白形貌，并结合面扫描邸S表征类骨憐灰石支架表面 的元素分布情况。
[0098] 2、材料的药物缓释
[0099] 将制备好的复合材料浸泡于PBS缓冲溶液，置于恒溫振荡箱在37°C、100rpm频率恒 溫振荡，在各个时间点收集蛋白缓释液后加入新鲜PBS继续浸泡降解。用riiBMP-2ELISA试剂 盒测定各时间点的rhBMP-2缓释浓度，用圆二色谱分析缓释蛋白的结构变化;缓释液用透析 膜透析后，用液相色谱测定各个时间点的地塞米松释放量。
[0100] 3、碱性憐酸酶(ALP)活性测定
[0101] 碱性憐酸酶(ALP)是广泛用于体内和体外的成骨分化标记物，它的表达水平被用 来定量地显示细胞的成骨分化水平。进行ALP活性测定和体外细胞矿化实验，研究不同浓度 和不同时间培养的地塞米松对rhBMP-2的生物活性的影响;采用实时逆转录聚合酶链反应 分析(Realtime RT-PCR)，研究地塞米松和riiBMP-2对一些成骨转录因子和成骨标记物的基 因表达的影响。
[0102] 采用对硝基苯憐酸盐(PNPP-化，购自上海生工生物有限公司）作为基质测定碱性 憐酸酶活性。即，将复合材料样品置于24孔板内，X 10^孔的密度在其上接种骨髓间充 质干细胞。在培养基中培养24h，细胞用PBS洗两次，更换新的维持培养基(培养液含2 %小牛 血清），之后隔天更换维持培养基。在4/7/14天培养后，去除维持培养基，在每孔加入50化 1 %乙基苯基聚乙二醇溶液(NP-40)，化后获得细胞裂解液。
[0103] 0.1 mL P-硝基苯基憐酸盐溶液（Img/mL，抑=9.0)和0.1M甘氨酸组成的混合液，加 入ImM MgCl2.6H2〇,并在37°C解育15min。然后加入O.lmL的0.1M NaOH，用酶标仪 (SPECTRAmax 384,美国分子器件公司）来定量碱性憐酸酶的吸收，测定结果在波长为405nm 处。碱性憐酸酶的活性用405nm时的吸光度除W时间和总蛋白值来表达。W牛血清白蛋白作 为标准，用BCA蛋白定量试剂盒(购自中国江苏碧云天生物研究技术所)测定蛋白质浓度。
[0104] 4、细胞矿化
[0105] 为了确定成骨矿化结节的形成，使用Von Kossa染色技术将一个细胞外基质矿化 染色。即将复合材料样品置于24孔板内，把骨髓间充质干细胞W2X10シ孔的密度接种其 上。在培养基中经过24h的培养，细胞用PBS洗两次，更换新的维持培养基(培养液含2%小牛 血清），之后隔天更换维持培养基。在7/14天培养后，去除维持培养基，室溫下用PBS冲洗细 胞，加入冷的1 %戊二醒溶液固定1 Omi η。用冷的1 %茜素红(购自上海Maj or生物公司）（抑= 4.2)作用细胞lOmin进行细胞染色。然后用PBS冲洗运些细胞，在光学显微镜下可获得彩色 数字图像。
[0106] 5、实时逆转录聚合酶链反应分析(realtime RT-PCR)
[0107] 将复合材料样品置于24孔板内，W2X10シ孔的密度将骨髓间充质干细胞接种其 上。在培养基中经过24h的培养，细胞用PBS洗两次，更换新的维持培养基(培养液含2%小牛 血清），之后隔天更换维持培养基。在7/14天培养后，去除维持培养基，采用RT-PCR检测其成 骨相关基因的表达。
[0108] RT-PCR检测步骤如下：
[0109] A.RNA的提取与逆转录：
[0110] 1)弃去培养基，用PBS清洗固载有细胞的支架2次；
[0111] 2)向每孔中加入50化L的RNAisoPlus裂解液充分裂解细胞15分钟；
[0112] 3)收集细胞裂解液并转移至离屯、管中，室溫静置5分钟；
[0113] 4)向上述裂解液中加入其1/5体积量的氯仿并充分混合至粉红色乳状液体，室溫 静置5分钟；
[0114] 5H.2X104rpm、4 °C离屯、15mi η，上述液体分为Ξ层:透明上清液(mRNA)、白色蛋白 层(含有大量DNA)及最下层有机相；
[0115] 6)小屯、吸取上清液至另一新的离屯、管中；
[0116] 7)加入与上述上清液等体积的异丙醇，快速上下颠倒使其均匀混合，室溫静置10 分钟；
[0117] 8) 1.2 X 104rpm、4 °C离屯、15分钟，小屯、弃去上清，试管底部即为mRNA沉淀。加入 75%乙醇清洗mRNA，1.0X 104rpm 4°C离屯、5分钟后小屯、弃去上清；
[011引 9)最后加入ΙΟμΙ DEPC水溶解mRNA;
[0119] 10)配制10化扩增反应体系：6.5化1111?熱，0.5化011旨〇扣？'11116'(504]\0，化1 SxPrimeScrip飯Buffer和0.5化逆转录酶PHmeScHp魄RT Enzyme Mixl;
[0120] 11)用Biometra基因扩增仪逆转录，其条件为：37°C/15min，85°C/5s;
[0121] 12)逆转录结束后，样品置于-20°C保存。
[0122] B.Realtime PCR检测：
[0123] l)10l·^LSYBRPremixExTaq?，o.4化50μM上下游引物，l化cDNA模板，8.2化 DEPC水分别加入到孔板中。引物序列如表1所示，GAPDH为内参；
[0124] 2)采用Bio-Rad公司实时定量PCR仪(CFX96)进行巧光定量检测，具体循环溫度如 下:升溫至 95 °C/30s 一 95 °C/5s，60 °C/30s (40 次循环)一最后升溫至 95 °C( 0.5 °C/5s)。
[0125] C.数据处理
[0126] W空白对照组的第一个时间点的巧光强度为1，得到的巧光强度数据W倍数形式 表不。
[0127] 表1Realtime RT-PCR所用的正向引物和反向引物 [012 引
[0129] 6、小鼠异位成骨实验
[0130] W小鼠的肌袋植入模型作为异位成骨模型，研究本发明的复合材料的体内促成骨 效果，并证明rhBMP-2与地塞米松的协同效应及其与类骨憐灰石载体相结合的应用前景。
[0131] 动物实验在无菌环境下操作，所用的实验器具均灭菌处理。将巧7小鼠（23g)按体 重的3%进行戊己比妥钢腹腔注射麻醉。将小鼠的右后腿外侧剌毛、消毒处理，切开约10mm 的纵向切口，分离肌袋内软组织，植入样品，手术线缝合肌膜和皮肤。无菌环境中正常标准 饲养。
[0132] 在手术2周和4周后分别处死每组6只小鼠，取出诱导成骨组织。3个带周围软组织 样品置于4%的福尔马林溶液中固定，用于后续的组织切片检测。其余3个样品去除周围软 组织后称湿重，然后放入马弗炉中60(TC般烧化，取出并称取灰分重量。
[0133] 本发明的主要优点在于：
[0134] (1)本发明特定比例的BMP-2与糖皮质激素类药物负载于特定的多孔载体上时，能 够更好地发挥协同效应W诱导成骨分化；
[0135] (2)与单纯的多孔憐酸巧盐相比，本发明的复合材料通过负载重组人骨形态发生 蛋白-2提高骨诱导性，同时，通过糖皮质激素类药物的协同作用，降低重组人骨形态发生蛋 白-2的使用剂量、提高了材料的骨修复能力和新骨生长能力，从而更好地实现骨组织完全 再生/修复。
[0136] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量 份数。
[0137] W下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0138] 实施例1多孔类骨憐灰石的制备
[0139] 将由等摩尔比的憐酸四巧（Tetracalcium曲osphate，TTCP)和无水憐酸氨二巧 (Dicalcium Phosphate Anhy化ate,DCPA)组成的复合憐酸巧盐粉末Ig、化C1颗粒(粒径约 500μπι) Ig、饱和化C1溶液0.3g混合得到均匀浆料，将浆料填入直径4mm、高3mm的圆柱状的模 具并维持2MPa的压力Imin，得到相应尺寸和形状的支架胚体。
[0140] 将所述支架胚体在37°C、100%湿度的恒溫恒湿箱中固化3天，用蒸馈水浸泡将 NaCl完全溶解后，100°C下烘干12h得到多孔类骨憐灰石载体。
[0141] 如图1所示，多孔类骨憐灰石载体为直径约4mm、高约3mm的圆柱状（图1A)，成分主 要是径基憐灰石（图1B)。
[0142] 如图1C所示，通过盐析法，多孔类骨憐灰石载体具有连通的大孔结构，保证了细胞 组织的长入和材料的快速降解，还具有固化过程中过量的水形成的微孔，从而提高了支架 的生物活性，同时为固载rhBMP-2提供了高吸附比表面积。在更高放大倍数下观察（图1C， c3)，可看到多孔类骨憐灰石载体表面有大量针状径基憐灰石晶体。
[0143] 实施例2-复合材料layg riiBMP-2与化g地塞米松
[0144] 取Ig实施例1所述的多孔类骨憐灰石载体进行高溫高压蒸汽灭菌，在无菌条件下， 将含化g riiBMP-2和化g地塞米松的溶液滴加在多孔类骨憐灰石载体上，放置于真空干燥器 中，用真空累抽真空并保持30min，使溶液充分吸附入支架的孔隙中。
[0145] 然后将支架从真空干燥器中取出，用真空冷冻干燥机无菌冻干得到复合材料1，复 合材料1的riiBMP-2固载量为化g，可4°C密封长期保存。
[0146] 实施例3-复合材料2:化g riiBMP-2与化g地塞米松
[0147] 同实施例2,不同之处在于，地塞米松为化g，复合材料2的riiBMP-2固载量为化g。
[0148] 实施例4-复合材料3:化g riiBMP-2与化g地塞米松
[0149] 同实施例2,不同之处在于，地塞米松为化g，复合材料3的riiBMP-2固载量为化g。
[0150] 实施例5-复合材料4:化g riiBMP-2/12yg地塞米松
[0151] 同实施例2，不同之处在于，地塞米松为1化g，riiBMP-2为化g，复合材料4的riiBMP-2 固载量为化g。
[0152] 实施例6-复合材料5:化g riiBMP-2与30yg地塞米松
[0153] 同实施例2，不同之处在于，地塞米松为30yg，riiBMP-2为扣g，复合材料5的riiBMP-2 固载量为化g。
[0154] 实施例7-复合材料6:化g riiBMP-2与15yg地塞米松
[01巧]同实施例2，不同之处在于，地塞米松为15yg，riiBMP-2为扣g，复合材料6的riiBMP-2 固载量为化g。
[0156] 实施例8-复合材料7:化g riiBMP-2与45yg地塞米松
[0157] 同实施例2，不同之处在于，地塞米松为45yg，riiBMP-2为扣g，复合材料7的riiBMP-2 固载量为化g。
[015引对比例1-复合材料Cl:lyg riiBMP-2/lyg地塞米松
[0159] 同实施例2,不同之处在于，地塞米松为化g，复合材料C1的riiBMP-2固载量为化g。
[0160] 对比例2-复合材料C2:lyg riiBMP-2/多孔类骨憐灰石复合材料 [0161 ]同实施例2，不同之处在于，不添加地塞米松。
[0162] 对比例3-复合材料C3:6yg地塞米松/多孔类骨憐灰石复合材料
[0163] 同实施例2,不同之处在于，不添加 riiBMP-2。
[0164] 对比例4-复合材料C4:5yg riiBMP-2/多孔类骨憐灰石复合材料
[0165] 同实施例6，不同之处在于，不添加地塞米松。
[0166] 实施例9复合材料1的表征和药物缓释
[0167] 用扫描电镜观察复合材料1，图2A中可看到，固载了riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体的大孔表面均匀吸附了大量絮状蛋白。
[0168] 将复合材料1浸泡于PBS缓冲溶液，置于恒溫振荡箱在37°C、100巧m频率恒溫振荡， 在各个时间点收集蛋白缓释液后加入新鲜PBS继续浸泡降解。用riiBMP-2ELISA试剂盒测定 各时间点的rhBMP-2缓释浓度，用圆二色谱分析缓释蛋白的结构变化;缓释液用透析膜透析 后，用液相色谱测定各个时间点的地塞米松释放量。
[0169] 复合材料1的rhBMP-2缓释曲线（图2B)显示，支架具有典型的双阶段释放动力学： 初始突释和后期缓释。从圆二色谱图（图2C)及其结构分析还可看出，多孔类骨憐灰石载体 所采用的W物理吸附为主的固载方式不会影响蛋白结构（结构变化率仅为5.7%左右）。地 塞米松缓释曲线（图2D)显示，地塞米松的释放速度要高于rhBMP-2。
[0170] 实施例10固载不同药物和不同药物比例的多孔类骨憐灰石的体外成骨ALP活性
[0171] W大鼠间充质干细胞为细胞模型，研究固载不同药物或不同药物比例的多孔类骨 憐灰石载体的体外成骨ALP活性，分别选取W下复合材料：
[0172] 实施例1所述的多孔类骨憐灰石载体作为对照组(bla址control组）；
[0173] 实施例2所述的复合材料1:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:6组）；
[0174] 实施例3所述的复合材料2:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:3组）；
[0175] 实施例4所述的复合材料3:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:9组）；
[0176] 实施例5所述的复合材料4:固载12yg地塞米松、lyg rhBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:12组）；
[0177] 对比例1所述的复合材料C1:固载化g地塞米松、lyg rhBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:l组）；
[0178] 对比例2所述的复合材料C2:固载化griiBMP-2、无地塞米松的多孔类骨憐灰石载体 (BMP-2组）；
[0179] 对比例3所述的复合材料C3:固载化g地塞米松、无 rhBMP-2的多孔类骨憐灰石载体 (Dex组）。
[0180] 如图3所示，可W看出：
[0181 ] (1)只固载地塞米松的复合材料成骨性能较差；
[0182] (2)rhBMP-2本身具有一定的成骨诱导性，而当riiBMP-2与地塞米松共同作用时，成 骨诱导性得到大幅度显著提升。其中，具有较佳成骨诱导效果的rhBMP-2/地塞米松比例为 1:3、1:6、1:9、1:12。
[0183] 实施例11固载不同药物和不同药物比例的多孔类骨憐灰石的体外矿化
[0184] W大鼠间充质干细胞为细胞模型，研究了固载不同药物或不同药物比例的多孔类 骨憐灰石载体的体外矿化，分别选取W下复合材料：
[01化]实施例1所述的多孔类骨憐灰石载体作为对照组(bla址control);
[0186] 实施例2所述的复合材料1:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:6组）；
[0187] 实施例3所述的复合材料2:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:3组）；
[0188] 实施例4所述的复合材料3:固载化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:9组）；
[0189] 实施例5所述的复合材料4:固载12yg地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载 体(BMP-2/DEX=l:12组）；
[0190] 对比例2所述的复合材料C2:固载化griiBMP-2、无地塞米松的多孔类骨憐灰石载体 (BMP-2组）。
[0191] 如图4所示，当riiBMP-2与地塞米松共同作用时，其体外矿化沉积水平显著提升，且 具有较佳矿化沉积量的riiBMP-2/地塞米松比例为1:3、1:6、1:9、1:12。
[0192] 实施例12固载不同药物和不同药物比例的多孔类骨憐灰石的体外成骨基因表达
[0193] W大鼠间充质干细胞为细胞模型，研究了固载不同药物或不同药物比例的多孔类 骨憐灰石载体的体外成骨基因表达，分别选取W下复合材料：
[0194] 实施例1所述的多孔类骨憐灰石载体作为对照组(Bla址Control组）；
[01巧]对比例2所述的复合材料C2:固载化griiBMP-2、无地塞米松的多孔类骨憐灰石载体 (BMP-2组）；
[0196] 对比例3所述的复合材料C3:固载化g地塞米松、无 riiBMP-2的多孔类骨憐灰石载体 (Dex组）；
[0197] 实施例2所述的复合材料1:固载化g riiBMP-2与化g地塞米松的多孔类骨憐灰石载 体(Dex+BMP-2组）。
[0198] 复合材料1、C2、C3对体外成骨基因的表达结果如表2所示。
[0199] 由表2可W看出，单纯的BMP-2对BSP、Col I、0CN、0PN和Runx2成骨相关基因的表达 具有一定的上调作用;单纯的地塞米松对Runx2基因作用不明显。
[0200] 但是，当Ξ者(地塞米松+多孔类骨憐灰石载体+BMP-2)共同使用时，可发挥协同作 用，对BSP、Co 1 I、0CN、0PN和Runx2成骨基因的表达均具有非常明显的上调作用。特别地，对 于Col I和Runx2基因，与对照组、BMP-2组和Dex组相比，协同效果尤其明显：
[020U 例如，对于Co 1 I基因，7d后，Dex+BMP-2组基因表达相较于Dex组提高了 19.6 %，相 较于BMP-2组提高了 58.9 % ;对于Runx2基因，7d后，Dex+BMP-2组基因表达相较于Dex组提高 了86.6%。
[0202] 表2复合材料1、C2、C3对体外成骨基因的相对表达结果(倍数）
[0203]
[0204] (注:倍数数据WBla址Control组数据为基准，采用平均值表示）
[0205] 实施例13固载扣g riiBMP-2和不同比例地塞米松的多孔类骨憐灰石载体在小鼠体 内异位成骨
[0206] 依据图3、图4得到的数据结果，选取W下复合材料进行动物异位成骨测试：
[0207] (1)实施例6所述的复合材料5(rhBMP-2 :DEX = 1:6);
[020引 （2)实施例7所述的复合材料6 (riiBMP-2: DEX = 1:3);
[0209] (3)实施例8所述的复合材料7 (riiBMP-2: DEX = 1:9);
[0210] (4)对比例4所述的复合材料C4作为对照(riiBMP-2 :DEX = 1:0)。
[0211] 2周时，上述（1)-(4)组的异位骨样品大小和异位骨湿重、灰重质量结果如图5所 示：
[0212] 可见，多孔类骨憐灰石/riiBMP-2/地塞米松复合材料的成骨活性、成骨量和矿化程 度明显高于仅固载riiBMP-2的复合材料，且rhBMP-2与地塞米松的剂量比例为1: 3、1:6、1:9 时，都具有明显效果。
[0213] 第4周与第2周相比，异位骨湿重降低，灰重增加，说明异位骨组织进一步矿化，同 时发生骨吸收，各组趋势与第2周时基本一致，多孔类骨憐灰石/riiBMP-2/地塞米松复合材 料与仅固载rhBMP-2的材料相比，灰重差距更大，再次说明本发明的多孔类骨憐灰石/ riiBMP-2/地塞米松复合材料促进了矿化程度。
[0214] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种复合材料，其特征在于，所述复合材料包括： (a)多孔载体、（b)骨形态发生蛋白BMP-2和(c)糖皮质激素类药物，并且(b)和（c)负载 于(a)上； 其中，所述(b)与（c)负载量的质量比为1:3-1:15,并且所述(a)多孔载体的孔隙率为 50%-90%〇2. 如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述(b)与（a)的重量之比为0.1-5yg: lg〇3. 如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述(b)与(a)的重量之比为l-30yg:lg。4. 如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述糖皮质激素类药物选自下组:地塞 米松、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、或其组合。5. 如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述(a)多孔载体为多孔类骨磷灰石载 体。6. 如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述(a)多孔载体的孔径为100-500μπι。7. -种制备如权利要求1所述的复合材料的方法，包括步骤： (i) 提供一种药物混合物和所述(a)多孔载体，其中，所述药物混合物包括所述(b)骨形 态发生蛋白BMP-2和所述(c)糖皮质激素类； (ii) 将所述药物混合物施涂到所述(a)多孔载体上，其中所述(b)和所述(c)的质量比 为1:3-1:15,形成所述复合体1; (iii) 将所述复合体1在真空条件下冻干处理，制得权利要求1所述的复合材料。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述制孔剂为NaCl。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述制孔剂的粒径为100-500um〇10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多孔类骨磷灰石载体的直径约4±lmm， 高约3± lmm。
【文档编号】A61L27/54GK105999417SQ201610392378
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】刘昌胜, 林丹, 柴延军, 袁媛
【申请人】华东理工大学