专利名称：动物乳腺内表达成纤维细胞生长因子(fgf)的重组dna的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子(FGF)的方法。
成纤维细胞生长因子是一种细胞调节蛋白，它在生命活动中参与重要的生理调控作用。它能促进多种细胞生长分化，促进弹性纤维细胞的发育及增强其功能，促进神经细胞生长和神经纤维再生，是一种神经细胞营养因子。诱导微血管的形成、发育和分化，改善微循环。它可以使表皮细胞更新、老化细胞脱落，使皮肤处于滑嫩的状态。
成纤维细胞生长因子无论是直接从组织中提取，还是利用微生物工程生产，不可避免的都存在工艺复杂、成本高及产量低等不足之处。
本方法的目的在于克服上述现有技术之不足，提供一种有助于快速、简单、有效地从动物乳汁中上获得成纤维细胞生长因子的方法。
为了实现本发明之目的，首先按本发明所述的用于在动物乳腺内表达成纤维细胞生长因子的重组DNA的构建方法，利用分子生物学的技术获得包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段，通过两者的直接或间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成一个或数个重组DNA，将重组DNA适当处理并与一些化学物质混合后注入动物的乳腺导管内，通过乳腺导管进入乳腺分泌细胞。或通过其它建立生物反应器的方法导入动物生殖细胞以建立乳腺定位表达生物反应器，在乳腺分泌细胞分泌乳汁的同时，也较大量地分泌成纤维细胞生长因子，因此可在动物的乳汁中获得成纤维细胞生长因子。
具体点说是首先通过分子生物学的方法获得动物或植物的成纤维细胞生长因子DNA完整或不完整片段和包含有动物乳蛋白基因的启动子和/或增强子的DNA片段，将成纤维细胞生长因子DNA完整或不完整片段连接在包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段的下游，再做些必要的DNA修饰后，装入适当的载体上，构成重组DNA。或者将包含有动物乳蛋白基因的启动子和/或增强子的DNA片段与T7RNA聚合酶DNA相连，T7启动子与成纤维细胞生长因子DNA完整或不完整片段相连，将以上两个连接片段做些必要的DNA修饰，装入适当的一个载体或一个以上的载体上，构成重组DNA，再通过常规的分子克隆的方法，大量扩增并纯化此重组DNA，将此重组DNA做(或者不做)一定的酶切处理，与某些化学物质(如脂质体等)混合后，借助注射器等一类器具吸取此混合物，通过动物乳头管注入乳腺导管内，使此重组DNA沿乳腺管进入乳腺分泌细胞。或通过其他组织管道导入乳腺细胞，当动物泌乳时用常规方法挤出乳汁，在乳汁中即可获得较大量的成纤维细胞生长因子。或将重组DNA通过其它建立生物反应器的方法导入动物生殖细胞以建立乳腺定位表达的生物反应器。
实施例1取全长0.8Kb的人碱性成纤维细胞生长因子cDNA与含有启动子的、长约800bp的牛β-casein cDNA连接，装入pCDA3载体建成重组DNA，经克隆筛选、扩增、提取及纯化后，与脂质体相互作用，用生理盐水配制成浓度为0.1mg/m1的液体，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺导管内，经适当挤压后，液体将通过乳腺导管进入乳腺分泌细胞，当乳牛产后泌乳，即可在乳汁中获得较大量的成纤维细胞生长因子。
使用本方法所述的用于在动物乳腺内表达成纤维细胞生长因子的重组DNA的构建方法，并配合乳腺导管内注射或其它的建立生物反应器的方法，克服了以往生产成纤维细胞生长因子所存在的的设备条件要求高、技术难度大、成本高、产量低等缺点，使成纤维细胞生长因子的生产在纯天然状态下进行，大批量生产，成本较低，因此具有一定的经济开发价值。
权利要求
1·一种用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段直接或间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
2·根据权利要求1所述的一种用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段直接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
3·根据权利要求1所述的一种用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段通过T7RNA聚合酶与T7启动子偶连系统间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
4·根据权利要求1或2或3所述的用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有牛β-casein DNA启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段间接或直接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
5·根据权利要求1或2或3所述的用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有牛α-S1-casein DNA启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段间接或直接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
6·根据权利要求1或2或3所述的用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有牛lactoglobulin DNA启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段间接或直接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。
全文摘要
本发明涉及一种用分子生物学技术在乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，克服了用现有技术提取或人工生产成纤维细胞生长因子之技术难度大、成本高、产量低等不足，将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段直接或通过T7RNA聚合酶与T7启动子偶连系统等方法间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，经过克隆筛选、扩增、纯化之后，与脂质体等物质混合，然后直接注入动物的乳腺导管内，让重组DNA进入乳腺分泌细胞，或用常规的建立生物反应器的方法建立乳腺定位表达生物反应器，在分泌细胞分泌乳汁时，重组DNA得以表达，用常规的方法挤得乳汁，可从乳汁中获重组DNA的表达产物——成纤维细胞生长因子，本方法具有方法简单、成本低、成纤维细胞生长因子活性高、产量高等优点。
文档编号C07K14/435GK1440982SQ02114900
公开日2003年9月10日 申请日期2002年2月27日 优先权日2002年2月27日
发明者黄伟民, 温汉平 申请人:黄伟民