用α-酮酸衍生物制备头孢烷酸衍生物的酶促方法

专利名称：用α-酮酸衍生物制备头孢烷酸衍生物的酶促方法
介绍本发明涉及3-头孢菌素C衍生物的制备方法，本品用于制备β-内酰胺抗生素。特别地，本发明涉及用α-酮酸中间体制备3-乙酰氧基-甲基-7-氨基-头孢-3-烯(em)-羧酸的3-硫醇盐衍生物(3-硫醇化的-7-ACA)的酶反应方法。α-酮酸或α-氧酸是重要的生物制药化合物。
必需氨基酸的含氧酸作为重要营养食品(Pszcola，DE，Food Technol.52，30，1998)以及治疗氮蓄积疾病的治疗剂(Schaefer et al.，KidneyInt.Suppl.27，S136，1989；Buto et al，Biotechnol.Bioeng.44，1288，1994)具有重要意义。另一重要用途是从头孢菌素C(3-乙酰氧基甲基-7β-(D-5-氨基-5羧基戊酰氨基)头孢-3-烯-4-羧酸)制备7-氨基头孢烷酸(Savidge，TA；In Biotechnology of Industrial Antibiotics，p 171，Marcel Dekker，New York，1984)。如DE 3447023(Hoechst)所述，可以通过来自衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 9945的D-氨基酸氨基转移酶进行转化，它用α-酮酸将头孢菌素C转化成α-酮己二酰-7-ACA和相应的D-α-氨基酸。此转化是氨基转移，头孢菌素C的氨基非氧化地转化成酮基，不释放过氧化氢。然而如DE 0315786所述，此酶的活性低。
制备3-硫醇化-7-ACA头孢烷酸(cephalosporanic acid)衍生物的化学方法是已知的(US 3,367,933；BE 718,824)，然而它们存在不足，例如需要低温反应条件、使用昂贵而有毒的溶剂或试剂、中间体的化学不稳定性而使本方法在工业规模化进行方面具有困难。
为克服制备7-ACA的化学反应途径的缺点，已有另外关于头孢菌素C性的酶裂解的记载。能够通过使用特定的头孢菌素酰基转移酶直接一步去除头孢菌素C侧面的7’-氨基脂肪侧链(FR 2,241,557；US 4,774,179；EP 283,248；WO 9512680；WO 9616174)。然而如专利US 5,296,358所述，这些方法经常不能重复，并具有低收率和长的反应时间。那时仍未报道过此技术(将头孢菌素C一步转化成7-ACA)的工业应用(Parmar etal，Crit.Rev.Biotechnol.18，1，1998)。
另一方面，从工业角度看，通过两个酶步骤将头孢菌素C转化成7-ACA是重要的。第一阶段包括使用不同来源的D-氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.3，下文表示为DAAO)(变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)，GB 1,272,769；纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)，EP 0,517,200；或茄病镰孢(Fusarium solari)M-0718，EP 0,364,275)。在有分子氧的条件下，DAAO使头孢菌素C侧面的D-5-酰氨基-羧戊酰基链氧化，产生7β-(5-羧基-5-氧戊-酰氨基)-头孢-3-烯-羧酸(或α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸，下文表示为α-酮己二酰-7-ACA)和过氧化氢，它通过化学途径使α-酮己二酰-7-ACA脱羧基成为7β-(4-羧基丁酰氨基)-头孢-3-烯-4-羧酸(或戊二酰-7-氨基头孢烷酸，下文称为GL-7-ACA)。
在第二阶段，使用针对GL-7-ACA的特定的酰基转移酶，戊二酰-7-ACA酰基转移酶(E.C.3.5.1.3)，例如在大肠杆菌E.coli中过量表达的假单胞菌属类微生物的酶(US 3,960,662，EP 0496993)，使GL-7-ACA脱酰基成为7-氨基-头孢-3-烯-4-羧酸(或7-氨基头孢烷酸，以下称为7-ACA)。
此制备7-ACA的两步酶方法已经以工业规模被使用(Conlon et al.Biotechnol.Bioeng.46，510，1995)。
EP 0846695还公开了酶方法的另一改进，在此方法中，固体戊二酰-7-ACA与含有至少一个氮原子并有或无硫或氧原子的杂环基团反应，产生3-位被修饰的戊二酰-7-ACA。这些3位衍生物经酶转化形成其相应的3-杂环硫代甲基-7-ACA衍生物。
本方法可以定义为酶-化学-酶(ECE)过程，当从溶解的头孢菌素C生物转化得到分离的GL-7-ACA后，使GL-7-ACA与杂环硫醇反应并最终用GL-7-ACA酰基转移酶进行3-杂环硫代衍生物的酶反应。如WO 9535020所述，本方法的问题是需要分离具有高水溶性的GL-7-ACA，这使该方法具有技术方面的困难并且昂贵。
另一个问题是由于残余杂环硫醇对生物催化剂产生的“毒性效应”使酶仅可以重复使用几次。所用硫醇中的一种，即5-甲基1，3，4-噻二唑-2-硫醇(MMTD)充分证明了此“毒性效应”(Won et al，App.Biochem.Biotech.69，1，1998)。
在需氧条件下，头孢菌素C的D-己二酰氨基侧链氧化脱氨基形成α-酮己二酰-7-ACA的过程已有记载，使用来自酵母变异三角酵母或胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(EP 0517200)的无细胞提取物(GB1,272,769，Glaxo)或甲苯活化(渗透的)的细胞中(GB 1,385,685)的D-氨基酸氧化酶(D-AAO)。在此反应中，分子氧作为电子受体转化成过氧化氢，它与α-酮己二酰-7-ACA发生化学反应脱羧基形成戊二酰-7-ACA。在有大量从上述酵母中产生的催化剂的条件下，过氧化氢裂解成水和分子氧，产生α-酮己二酰-7-ACA与戊二酰-7-ACA的混合物。α-酮己二酰-7-ACA很不稳定(GB 1,385,685)，迅速分解成未知产物，从而根据酵母和菌株的不同戊二酰-7-ACA的收率从90-95％降低到60-70％(Parmar et al，Crit.Rev.Biotechnol.18，1，1998；Rietharst，W.and Riechert，A，Chimia 53，600，1999)。结果未曾有其工业应用的报道。
因此需要高效并改进的以工业规模制备3-硫醇化的-7-ACA头孢烷酸衍生物的方法。另外，分离稳定的α-酮酸衍生物也将是有益的，它是重要的生物制药化合物。
发明概述根据本发明，提供制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式III的3-硫醇化的头孢菌素C化合物通过酶法转化成式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物
其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。
优选，式III化合物通过固定的酶系统酶转化成式IV化合物。最优选，酶系统含有共固定的D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶。
优选，在以下条件下进行酶转化有分子氧存在，1-5巴(bar)绝对压力，pH6.5-8.0，温度15℃-30℃，反应时间30分钟-180分钟。
优选此方法包括从反应混合物中分离酶系统的步骤，优选通过过滤分离。
在本发明的一个实施方案中本方法包括纯化式IV化合物的步骤。
最优选用吸附柱纯化化合物。优选用适宜的交联剂将酶共同固定在适宜的固态载体上。酶可以为体积适于作为生物催化剂的晶体形式。
优选在保持酶分散在底物水溶液中的条件下进行酶处理。这一或每个酶处理优选在柱上进行。最优选此方法包括为重复使用而回收酶的步骤。
在本发明的一个实施方案中，在连续过程中使用不经纯化的式IV化合物以得到任何有用的衍生物。
式III和IV的化合物中R基团优选含有至少一个氮原子及可选硫或氧原子的杂环基。
最优选R是选自以下任何一个或多个基团的杂环基噻吩基、二唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它们的任何衍生物，优选5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-1H-四唑-5-基或1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本发明提供了用本发明的方法制备的式IV的3-硫醇化-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物。
本发明提供了下式化合物
其中在式IV中，R是1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本发明提供了下式的化合物 其中在式IV中，R是1-甲基-1H-四唑-5-基。
本发明也提供了式IV化合物在制备头孢菌素C抗生素的过程中作为中间体的用途。
本发明也提供了下式的中间体化合物在制备头孢菌素C抗生素的方法中的用途 其中在式IV中R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
本发明还提供了制备本发明的头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤使式IV化合物通过酶转化形成式I化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，且R1和R2都是氢原子或一个是氢原子，另一个是酰基供体。
优选，采用戊二酰-7-ACA酰基转移酶使式IV化合物酶转化形成式I化合物，最优选在以下条件下进行酶反应温度约20℃，pH6.5-8.0。优选用适宜的交联剂将酶固定在适宜的固体载体中。
优选酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。
在本发明的一个实施方案中，在保持酶分散在底物水溶液中的条件下进行酶反应。优选酶处理在柱上进行。最优选本方法包括为重复使用而回收酶的步骤。
本发明也提供式I化合物在制备头孢菌素C衍生物的过程中作为中间体的用途。
本方法还提供了制备3-硫醇化的头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式III化合物经过酶转化 形成式IV的3-硫醇化-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物 并将式IV化合物酶转化成式I的3-硫醇化-7-ACA化合物
其中R是含有至少一个氮原子的杂环，且R1和R2都是H原子，或一个是H原子，另一个是酰基供体。
在本发明的一个实施方案中，式III化合物通过固定的酶系统，在一步反应中酶转化为式I化合物。最优选酶系统含有共同固定的D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶的组合，存在有固定的戊二酰-7-ACA酰基转移酶。优选酶反应在以下条件下进行温度约20℃，pH6.5-8.0，最优选用适宜的交联剂将酶共同固定在适宜的固体载体中。
优选酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。
最优选在保持酶分散在底物水溶液中的条件下进行酶反应。
优选这一或每个酶处理在柱上进行。最优选此方法包括为重复使用而回收酶的步骤。
在本发明的一个实施方案中，式III化合物不经纯化用于得到任何有用衍生物的连续方法中。
本发明也提供了制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤使头孢菌素C与通式II的硫醇化合物反应R-SH II其中R是含有至少一个氮原子的杂环，来形成式III的3-硫醇化的头孢菌素化合物， 其中R的定义如上，并在形成式III化合物后去除过量的式II的硫醇。
在本发明的一个实施方案中，通过吸附在阴离子交换树脂上去除过量的硫醇。优选阴离子交换树脂是有交联的丙烯酸共聚物结构的多微孔树脂。最优选阴离子交换树脂包含8％含功能性硫代烷基苯甲铵基团的交联。此树脂可以采用盐酸盐、氢氧化物、磷酸盐或醋酸盐循环。
在本发明的另一个实施方案中通过结晶去除过量的硫醇。优选在酸性pH下进行结晶。
在本发明的另一个实施方案中，通过结晶，然后吸附在阴离子交换树脂上去除过量的硫醇。
优选头孢菌素C存在于水性介质中。最优选头孢菌素C为头孢菌素C浓溶液的形式。
优选反应在如下条件下进行pH5.5-8.0，60℃-80℃，反应时间1-8小时。最优选反应在pH约6.0和温度约65℃的条件下进行。
在本发明的一个实施方案中，硫醇化合物的量为1-5mol/mol头孢菌素C。
优选R是含有至少一个氮原子，及可选硫或氧原子的杂环基。最优选R是选自以下任何一个或多个基团的杂环基噻吩基、二唑基、噻唑基、四唑基、噻二唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它们的任何衍生物，优选5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-四唑-5-基或1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本发明提供了式III化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。
本发明还提供了下式化合物 其中，在式III中，R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
本发明还提供了具有下式的化合物
其中，在III中，R是1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本发明也提供了式III化合物在制备头孢菌素C衍生物过程中作为中间体的用途。
本发明的一个具体实施方案提供了制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤通过上述过程将式III的3-硫醇化头孢菌素C化合物进行酶转化 形成式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。
在本发明的一个具体实施方式
中，本方法还另外包括以下步骤将式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-ACA化合物酶转化
形成式I的3-硫醇化的-7-ACA化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，且R1和R2都是氢原子，或一个是氢原子，另一个是酰基供体。
本发明的另一具体实施方案提供了制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式IV化合物酶转化 形成式I化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，R1和R2都是氢原子，或一个是氢原子，另一个是酰基供体。
优选式IV化合物采用戊二酰-7-ACA酰基转移酶转化形成式I化合物。
最优选式I、III和IV化合物为固体或其无毒盐的形式。
本发明提供了制备头孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括形成上述定义的具有式III、IV和I的化合物，及随后对化合物进行酶反应。
抗生素可以是头孢唑啉、头孢西酮、头孢哌酮、头孢孟多、头孢三嗪、头孢替安和头孢曲松中的一或多种。
发明详述我们已发现可以在有共同固定的D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的条件下，将3-硫醇化的头孢菌素C衍生物酶转化成α-酮酸衍生物。已显示α-酮酸衍生物在分离时稳定。因而提供了在一步或两步连续酶反应步骤中获得3-硫醇化的-7-ACA衍生物的新的改进的方法。
本发明涉及从头孢菌素C制备式I化合物的改进的且更高效的方法。
3’-硫醇化的-7-ACA(T’X’A)其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，且R1和R2都是氢原子，或一个是氢原子，另一个是酰基供体。
本发明涉及形成新的稳定的α-酮己二酰-7-ACA衍生物中间体。或者本方法可以在单一罐反应中不形成中间体地进行。
意外地发现头孢菌素C的3-硫醇化的衍生物在过氧化氢酶存在下是D-氨基酸氧化酶非常好的底物。
从头孢菌素C制备式III的3-硫醇化-头孢菌素C衍生物。头孢菌素C溶液可以为纯化的或粗品的形式。头孢菌素C为头孢菌素C的任何无毒盐的形式。
通过加入形成水溶性盐的碱性化合物，例如碱性金属氢氧化物、氢氧化铵或优选碱性金属碳酸盐或碳酸氢盐，在水中溶解杂环硫醇和任何无毒的头孢菌素C盐，在水性介质中进行3’位亲核取代反应。一般地，除如上制备的盐以外，可以在本发明的方法中使用任何商业可得的头孢菌素C的和杂环硫醇的盐而不改变本方法的基本原理。
在分离的或共同的反应容器中溶解杂环硫醇和头孢菌素C后，将两种底物混合在同一反应器中，在此之前或之后在pH5.5-7.0将溶液加热到约65℃-80℃。
一旦反应开始，优选将温度和pH分别保持在约65℃和6.0，进行约1小时-4小时。
对于反应收率而言，杂环硫醇/头孢菌素C摩尔比是一个重要的变量，且必须根据每种所用的杂环硫醇优选此摩尔比。摩尔比在1.0-4.0之间，优选约为4。
发现保持这些摩尔比时，头孢菌素C保持相当稳定，仅有低的β-内酰胺环降解，而没有硫醇的头孢菌素C溶液，在80℃在40分钟内完全降解。
当头孢菌素C的水平低于初始量的2％时，将反应混合物冷却到约2℃-10℃，经过或不经过用强无机酸-例如氢卤酸或含氧酸酸化到pH3.0-5.5，优选约5.2。
在一些情况下此酸化步骤导致杂环硫醇结晶，就可能重复利用于新反应中。
当形成式III化合物后，选择性去除过量的硫醇基团，从而制备出纯度非常高且其中的杂环硫醇浓度非常低(＜0.2mg/ml)的式III头孢菌素C衍生物。采用使用强阴离子交换树脂Amberlite IRA-400(Rohm andHaas制造)的高选择性的去除程序。此方法具有一些优势。它使式III化合物能在下面的工艺步骤中作为底物而不引起酶中毒。结果酶可以重复使用。另外本方法不需要使用毒性试剂或分离中间体，因而提供了连续的工艺过程。
可以以工业规模使用不同的树脂和各类色谱。
对一些树脂进行试验，根据吸附、亲水-疏水相互作用、阳离子交换和阴离子交换为基础的将其分为四类树脂。所有受试的以吸附为基础的树脂(Amberlite XAD-761，Amberlite 7HP，Amberlite 16 HP和AmberliteXAD-4)产生相似的结果，洗脱液含有22％-38％杂环硫醇。疏水-吸水相互作用树脂Sephadex LH-20不保留任何硫醇(＜5％)。用阳离子交换树脂AmberliteIRC-50、IR-120和IR-200发现了类似的情况。然而，发现阴离子交换树脂对杂环硫醇有最好的结合能力，对于弱阴离子交换树脂，范围为57-60％(Amberlite IRA-93)。
发现具有8％交联的含三烷基苯甲基铵基团的强多微孔(凝胶类I)阴离子(碱性)交换树脂Amberlite IRA-400对杂环硫醇产生最高结合能力(92-98％)，而对3’-位杂环硫代甲基头孢菌素C衍生物有低的结合能力(2-15％，对于第一循环少于15％，对于以后的循环少于5％)。
这些多微孔树脂具有某些优势。它们不易碎，不需要小心操作，并有较高的负载容量。由于它们没有离散的孔，溶液离子通过粒子扩散而与交换位点相互作用。所述树脂的总交换能力约为1,4meq/ml。
意外地发现Amberlite IRA-400对头孢菌素C的3’-杂环硫代甲基衍生物比对戊二酰-7-ACA和7-ACA的相同衍生物有更小的结合能力。实际上用MMTD制备的戊二酰-7-ACA的3’-杂环硫代甲基衍生物以76.3％的水平与柱结合。对用MMTD制备的7-ACA的3-杂环硫代甲基衍生物得到了同样的结果，它以92.7％的水平与柱结合。Amberlite IRA-400与这3个相关的β-内酰胺化合物的意外的表现看来是由于头孢菌素C与戊二酰-7-ACA和7-ACA相比，侧链5位存在可电离的氨基。
用本发明的方法去除杂环硫醇在工业规模化方面具有特别的优势，因为可以将柱的洗脱液用于酶反应过程中，而无须分离被修饰的头孢菌素C，这在头孢菌素中间体领域代表一种新概念，其中杂质与柱结合，而β-内酰胺衍生物能简单地被水洗脱。
一旦将β-内酰胺衍生物被洗脱(少于5％保持结合)，通常用1.5N的强无机酸使柱再生，例如含有可变量有机溶剂-优选10-20％乙腈的卤化氢。当硫醇在洗脱液中的浓度高于0.2mg/ml时，可以用3N HCl和40％乙腈进行强再生。或者可以用1.5M HCl和1.0N NaOH进行再生。
当洗脱杂环硫醇后，将硫醇浓缩并再使用。在下一循环之前用去离子水清洗柱以去除过量的再生剂。第一柱床体积的清洗应采用再生所用的流速。其余以吸附流速进行。
用固定的酶系统将式III化合物酶转化成具有式IV的新的稳定的α-酮己二酰-7-ACA衍生物。
其中R是含有至少一个氮原子并有或无硫或氧原子的杂环基团。
使用共同固定在同一固体载体上的酶(D-AAO和过氧化氢酶)比用分离载体能更好地去除过氧化氢。有两种酶的生物催化剂易于从反应介质中回收，并能重复使用多次。这对于工业方法是必需和不可缺少的因素。
本发明的另外的工业方面的优势是在经过强阴离子交换树脂(AmberliteIRA-400，Rohm和Haas制造)色谱后，易于将含有式III化合物的化学溶液转移到含有共同固定的酶的酶反应器中。这使此方法能以头孢菌素C至化合物IV的单一液流连续进行。
可以以不同途径进行酶阶段1)不经去除过量杂环硫醇的化学反应及用固定的D-AAO氧化脱氨基。在这些条件下，化合物IV积聚到约占总β-内酰胺的35-40％，高于用未修饰的头孢菌素C制备的α-酮己二酰-7-ACA的5-10％的积聚。因此显示出化合物IV的稳定性。
2)与1)相同，包括溶解的过氧化氢酶。在这些条件下，化合物IV的水平达到溶液中总β-内酰胺的70-75％，及3-硫醇化的戊二酰-7-ACA(T’X’G)的不足10％。然而存在高水平的杂环硫醇(≥1mg/mL)使被固定的酶和过氧化氢酶在少数循环内中毒。
3)包括用离子交换色谱去除过量硫醇和共同固定在相同固体载体上的D-AAO和过氧化氢酶的化学反应。在这些条件下，根据所用的pH，化合物IV积聚到总β-内酰胺的80％-90％。在pH约6.5时，化合物IV更稳定，达到90％积聚，但D-AAO活性较低(需要更多的生物催化剂)。在pH接近7.25时，酶活性更高，但化合物IV稳定性低，达到80％的积聚。优选的pH为6.75，此时D-AAO活性损失最低，化合物IV有好的稳定性。
从以上所述可以清楚地看到方法3)与其他方法相比具有优势，但用两种共同固定的酶(D-AAO和过氧化氢酶)得到好的生物催化剂必需要考虑一些参数a)两种酶的来源。从来自于西班牙微生物采集中心(CECT，Valencia，Spain)的变异三角酵母CBS 4091得到本发明的D-AAO。此酵母在产生D-AAO的条件下生长(Kubicek et al，J.Appl.Biochem.7；104，1985)，并按Szwjcer等所述的方法(Biotechnol.Lett.7，1，1985)，用30％-55％硫酸铵分级纯化此酶。也可以由纤细红酵母得到氨基酸氧化酶。从商业途径得到来源于Micrococcus lisodeikticus的过氧化氢酶(Fluka，Madrid，Spain)，但此酶也可以来源于黑色曲霉(Aspergillas niger)。
b)所用固体载体。一些载体能固定酶。最普遍的是AmberliteIRA900(有季胺官能团的强碱性聚苯乙烯树脂)，DuoliteA365(有主要功能基(primary functional group)的弱碱性聚苯乙烯树脂)，DuoliteA568(中度碱性的多缩合的酚醛树脂)，BrCN-活化的Sepharose，乙烯基Sepharose和Eupergit C(以聚丙烯结构为基础，特别具有环氧乙烷末端基团)。在Eupergit中，两类是商业化的Rhm Pharma C和C250L，后一类特别适合于结合高分子量的酶，因为其环氧乙烷基团的含量至少为0.36％，而在Eupergit C中仅为0.93％。当在工业化生物催化过程中使用时，此C250L类显示突出的性质。它们在搅拌池反应器中良好的性质归因于载体的形态-即其窄的颗粒大小分布(200μm)和高的机械稳定性。它们在搅拌系统中不发生机械损害，在反应周期结束后能快速而容易地过滤。pH和离子强度的改变不能影响基质的溶胀。另外，此EupergitC250L尚未用于固定D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶。
c)过氧化氢酶单位/D-AAO单位的比例。此比例通常大于100，但为有效地去除过氧化氢，此比例优选约1500。D-AAO的一个单位定义为用头孢菌素C作为底物，在pH8.0和25℃每分钟消耗1μmol氧气所用的酶。过氧化氢酶的一个单位定义为在pH7.0和25℃每分种消耗1μmol过氧化氢的酶量。
d)共固定的过程。可以使用一些固定方法。本发明的一种选择是对Cramer和Steckham所述(Tetrahedron，45，14645，1997)共固定过氧化氢酶和L-α-甘油磷酸酯氧化酶的方法的改进。典型地，在锥形烧瓶中，将100mg EupergitC250L悬浮在1.5ml偶联缓冲液中(1.0M磷酸钾缓冲液pH8.0)。然后缓慢加入10-40μ的D-AAO和10-20U的过氧化物酶。在温和摇动的条件下将混合物保温16小时。固定过程后，用玻璃釉料(frit)将树脂珠粒分离，用4℃的pH7.0的100mM磷酸钾将其洗涤数次。
当进行共固定后，在含有约0.0016-0.004摩尔化合物III和少于0.2mg/ml杂环硫醇的水溶液中进行化合物III向化合物IV的酶转化。使含有3-硫醇化的头孢菌素C(化合物III)和保留有用于亲核置换头孢菌素C的3-乙酰氧基的杂环硫醇的溶液通过强阴离子交换柱-例如AmberliteIRA-400(Rohm和Hass)得到溶液。由于头孢菌素化合物在碱性pH值条件下不稳定，将洗脱液的pH调节到约6.5-8.0，优选pH6.75。
将如上所述含有化合物III的溶液注入生物反应器，其中含有共固定D-AAO/过氧化氢酶的湿的Eupergit C250L，通常D-AAO为20-40U/g，过氧化氢酶通常为10-30kU/g。反应温度可以固定在15℃-35℃，通常固定为20℃。
以0.01-1体积/溶液体积/分钟(vvm)，优选0.1vvm的流速，从底部通气孔通入氧化脱氨所需的分子氧，同时伴以速度约400rpm的适宜的机械搅拌。优选为含有固定酶的渗滤柱设计生物反应器，以避免将会降低化合物IV收率的分子氧的扩散问题。用自动滴定仪滴加浓有机或无机碱将溶液滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，当化合物III的转化高于97％时，停止反应，将溶液过滤。根据反应条件，所需转化时间约为0.5-3小时，但通常约为1小时。
当需要时，用与在酶反应中所用相同的碱将上述溶液的pH降低到pH4.5-6.0，优选5.0，分离化合物IV，并加载到填充吸附树脂AmberliteXAD-2的柱上。用水以流速2-3柱床体积/小时洗脱化合物IV。分级收集含有HPLC纯度大于90-95％的化合物IV的流份，并将其冷冻干燥。
然后用戊二酰-7-ACA酰基转移酶，通过酶反应，将式IV的化合物转化成式I化合物。
也可以在单一反应器的反应中完成本发明从头孢菌素C制备式I化合物的过程。在这种情况下，在有戊二酰7-ACA酰基转移酶的条件下，用含有D-AAO和过氧化氢酶的固定酶系统将从阴离子交换柱得到的含有式III化合物的滤液经酶转化形成式I化合物。按此方法制备得到HPLC纯度为95％的式I化合物。此方法能容易且高效地进行。
用本发明的两种方法(单反应器或两步法)，能容易且经济地制备3-硫醇化-7-ACA衍生物。可以随后将这些化合物用青霉素G酰基转移酶转化，例如用于制备半合成β-内酰胺抗生素。β-内酰胺抗生素可以包括头孢唑啉、头孢西酮、头孢哌酮、头孢孟多、头孢三嗪、头孢替安和头孢曲松中的一或多种。
以下实施例意在说明本发明的一般原则而非对其限制。
实施例1-5说明从头孢菌素C制备式III的3-硫醇化的-7-ACA衍生物的方法。
实施例6-8说明从式III的3-硫醇化的头孢菌素C衍生物制备式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-ACA衍生物的酶方法。
实施例9-11说明从式III的3-硫醇化的衍生物通过形成稳定的具有式IV的α-酮己二酰-7-ACA衍生物制备3-硫醇化的-7-ACA衍生物(TXA)的酶方法。
实施例12-14说明从式III的3-硫醇化的衍生物经过一步(一个反应器)制备3-硫醇化的-7-ACA衍生物的酶方法。
实施例1制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(TDC)向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入31.73g(0.24摩尔)2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，然后将反应器搅拌加热到约65℃。加入10g碳酸钠将混合物的pH调节到约6.0。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液(HPLC测定纯度为98％)。当溶解MMTD后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约65℃搅拌混合物240分钟，控制反应的进行直至头孢菌素C的浓度低于2％。发现以下反应动力学参数
然后将反应混合物冷却到约4℃，此时过量的MMTD开始结晶。伴随搅拌(150rpm)，用37％盐酸将pH酸化到pH5.2然后缓慢搅拌(50rpm)60分钟使结晶完全。
过滤沉淀的MMTD并在35℃真空干燥。回收得到23g MMTD(HPLC测定纯度99％)，回收率约为95％。
滤液中(825ml)含有0.042摩尔TDC和0.016摩尔MMTD，用3M氨水将其调节到pH7.25，加载到盐酸盐循环的Amberlite IRA-400柱上(柱床体积等于180ml)上，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。加载后用去离子水(约100ml)洗脱，直至加载的TDC以94％的HPLC纯度达到97％的回收率。洗脱液的pH约为5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTD为0.0009摩尔(＜0.2mg/ml)，少于降低pH结晶后剩余MMTD的6％。有此低水平MMTD(＜化学反应后生成MMTD的1％)，能进行TDC的酶反应。
通常用含10％乙腈的1.5M盐酸1L将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。当需要时(MMTD＞0.2mg/ml)，可以用含有40％乙腈的3M盐酸1L对树脂进行强再生。或者，也可以用1.5M的HCl和1.0N的NaOH再生。
为进一步表征pH5.0的TDC溶液，将其加载到Amberlite XAD-2吸附柱上，用水洗涤柱。水洗后，用水洗脱树脂，按每份25ml分级收集。将HPLC测定含98.5％TDC的流份冷冻干燥，然后进行分析对产物C17H20N5O6S3·2H2O(TDC)的元素分析，计算值C 37.42；H 4.43；N 12.84；S 17.63；实测值37.27；H 4.3；N 13.11；S 17.51。
1H-NMR(DMSO/DCl)(δppm)1.57(m，2H，-CH2-)；1.63(m，2H，-CH2-)；2.18(m，2H，-CH2-)；2.64(s，3H，CH3)；3.55，373(J＝18Hz，2H，-CH2-)；3.83(t，1H，-CH-)；4.18-4.46(d，J＝13Hz，2H，-CH2-)；5.02(d，J＝3Hz，1H，C-6)；5.6(d，J＝3Hz，1H，C-7)。
实施例2对比实施例用不同的柱制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-头孢烯-4-羧酸如实施例1所述制备TDC衍生物并将含此物质的滤液加载到不同类的树脂上。
在柱使用的第一循环中用100ml水洗脱得到以下数据
Amberlite IRA-400得到最好的结果。TDC的洗脱率高，而MMTD的洗脱率低。用其他阴离子交换柱也能洗脱更大量的MMTD。其他阴离子交换树脂显示与硫醇和TDC的高的双重结合。
实施例3TDC对Amberlite IRA-400的特异性按实施例1用戊二酰-7-ACA和7-ACA作为起始物质制备戊二酰-7-ACA衍生物(TDG)和7-ACA衍生物(7-TDA)。从Amberlite IRA-400的滤液得到以下数据
*在pH7.8以避免TDA在柱中的沉淀。
与TDC相反，TDG和TDA显示保留结合在Amberlite IRA-400中，与MMTD相同。
实施例4制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZC)向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入28.16g(0.24摩尔)5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)，然后将反应器搅拌加热到约70℃。加入约12g碳酸钠将混合物的pH调节到约5.7-5.8。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔，HPLC测定纯度98％)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液。当溶解MMTZ后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约70℃搅拌混合物120分钟，控制反应动力学的进行直至头孢菌素C的浓度低于3％。
将反应混合物冷却到约4℃，但即使pH降低时，过量的MMTZ也不开始结晶。用3M氨水将含有从MMTZ得到的0.04摩尔TZC衍生物和0.19摩尔MMTZ的溶液调节到pH7.25，并加载到采用盐酸盐循环的AmberliteIRA-400柱上(柱床体积等于150ml)，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。首次经过柱后，剩余的MMTZ高于初始量(0.032摩尔)的13％。
由于此原因，在上述相同的条件下将洗脱液加载到另一AmberliteIRA-400(柱床体积等于60ml)柱上以降低MMTZ的水平。
加载后用去离子水(约90ml)洗脱，直至加载的TZC以87％的HPLC纯度达到97％的回收率。流出液的pH约为5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTZ浓度为0.0013摩尔，少于化学反应后得到MMTZ的1％。有如此低水平的MMTZ，能够进行衍生物的酶反应而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M盐酸1升将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。或者也可以用1.5M HCl和1.0N NaOH进行再生。
实施例5制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTC)向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入37.96g(0.24摩尔)2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(以下称为TTZ)，然后将反应器搅拌加热到约75℃。加入约12g碳酸钠将混合物的pH调节到约6.7。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔，HPLC测定纯度98％)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液。当TTZ溶解后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约75℃搅拌混合物75分钟，控制反应动力学的进行直至头孢菌素C的浓度低于2％。
将反应混合物冷却到约4℃，但即使pH降低时，过量的TTZ也不开始结晶。用3M氨水将含有0.036摩尔TTC和0.19摩尔TTZ的溶液调节到pH7.25，并加载到采用盐酸盐循环的Amberlite IRA-400柱上(柱床体积等于209ml)，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。首次经过柱后，剩余的TTZ为0.015摩尔。
由于此原因，在上述相同的条件下将洗脱液加载到另一AmberliteIRA-400(柱床体积相同)柱上以降低TTZ的水平。
加载后用去离子水(约120ml)洗脱，直至加载的TTC以90％的HPLC纯度达到60％的回收率。流出液的pH约为5.4，用3M氨水中和到pH7.0。剩余的TTZ浓度为0.00096摩尔，少于化学反应后得到TTZ的1％。有如此低水平的TTZ，能够进行衍生物的酶反应而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M盐酸1升将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。或者也可以用1.5M HCl和1.0N NaOH进行再生。
实施例6制备7β-(5-羧基-5-氧戊酰氨)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TDK)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(80ml)，含有0.0035摩尔纯度(HPLC)为94.3％的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TDC)，和浓度低于0.2mg/mL的2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，用3M氨水将其调节至pH6.75。
将TDC溶液输入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有30.76g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(11.77UDAAO/g和15kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移动相为含有4％乙腈的20mM醋酸铵，pH5.5，流速为1ml/min，使用260nm检测器。在7.0分钟时出现TDC，TDK在8.5分钟出现，3-硫醇化的戊二酰-7-ACA中间体(TDG)在11.5分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表
当TDC转化低于3％时，停止反应，过滤去除反应溶液。
为分离TDK，用3M氨水将产生的溶液调节到pH5.0，并通过装有40g吸附树脂Amberlite XAD-2(68.7ml柱床体积)的柱。用水洗脱，流速为200ml/h(约3个柱床体积/小时)。收集含有纯度≥95％(HPLC)的TDK的25ml流份并冷冻干燥得到固体状的目标产物以进一步分析。洗脱后，加入2个柱床体积的再生溶液(25％甲醇的水溶液，3柱床体积/小时)再活化吸附表面。在柱可以再使用前，从柱中去除溶液。用过量水平衡后(约15柱床体积)，柱即能再次使用。
1H-NMR(DMSO)(δppm)1.66(m，2H，-CH2-)；2.16(t，2H，-CH2-)；2.50(t，2H，-CH2-)；2.65(s，3H，-CH3-)；3.34-3.58(J＝17.4Hz，2H，-CH2-)；4.31-4.48(J＝12.1Hz，2H，-CH2-)；4.94(J＝5.1Hz，1H，C-6)；5.5(d，d，J＝5.1Hz，J＝8.4Hz，1H，C-7)。
实施例7制备7β-(5-羧基-5-氧戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZK)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(100ml)，含有0.0039摩尔纯度为90.1％(HPLC)的7-(5’-氨基己二酰二氨)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZC)，和少于0.2mg/ml的5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH6.75。
将TZC溶液加入0.125升搅拌反应器中，其中有30.76g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(11.77U DAAO/g和15kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移动相为含有4％乙腈的20mM醋酸铵，pH5.5，流速为1ml/min，使用260nm检测器。在3.0分钟时出现TZC，TZK在3.6分钟出现，3-硫醇化的戊二酰-7-ACA中间体(TZG)在4.6分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表
当剩余TZG低于3％时，停止反应，过滤去除反应溶液。
为分离TZK，用3M氨水将得到的溶液调节到pH5.0并通过装有40g吸附树脂Amberlite XAD-2(68.7ml柱床体积)的柱。用水洗脱，流速为200ml/h(约3个柱床体积/小时)。收集含有纯度≥93％(HPLC)的TZK的25ml流份并冷冻干燥得到固体状的目标产物以进一步分析。洗脱后，加入2个柱床体积的再生溶液(25％甲醇的水溶液，3柱床体积/小时)再活化吸附表面。在柱可以再使用前，从柱中去除溶液。用过量水平衡后(约15柱床体积)，柱即能再次使用。
1H-NMR(DMSO)(δppm)1.61(m，2H，-CH2-)；2.12(t，2H，-CH2-)；2.45(t，2H，-CH2-)；3.33-3.56(J＝17.4Hz，2H，-CH2-)；3.86(s，3H，-CH3-)，4.18-4.35(J＝12.6Hz，2H，-CH2-)；4.88(d，J＝4.8Hz，1H，C-6)；5.46(d，d，J＝4.8Hz，J＝8.2Hz，1H，C-7)。
实施例8制备7β-(5-羧基-5-氧戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTK)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.0016摩尔纯度为89.86％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTC)，和少于0.2mg/ml的2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH6.75。
将TTC溶液加入0.125升搅拌反应器中，其中有30.76g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(11.77U DAA0/g和15kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱EclipseXDB-C8 5μm 4.6×150mm，移动相为10mM TBHS(四丁基铵硫酸氢盐)和15mM磷酸二氢钾中35％甲醇的溶液，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TTC在2.6分钟出现，3-硫醇化的戊二酰-7-ACA中间体(TTG)在5.5分钟，TTK在6.6分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表
当剩余TTC低于3％时，停止反应，过滤去除反应溶液。
为分离TTK，用3M氨水将得到的溶液调节到pH5.0并通过装有40g吸附树脂Amberlite XAD-2(68.7ml柱床体积)的柱。用水洗脱，流速为200ml/h(约3个柱床体积/小时)。收集含有纯度≥90％(HPLC)的TTK的25ml流份并冷冻干燥得到固体状的目标产物以进一步分析。洗脱后，加入2个柱床体积的再生溶液(25％甲醇的水溶液，3柱床体积/小时)再活化吸附表面。在柱可以再使用前，从柱中去除溶液。用过量水平衡后(约15柱床体积)，柱即能再次使用。
1H-NMR(D2O)(δppm)1.89(m，2H，-CH2-)；2.38(t，2H，-CH2-)；2.81(t，2H，-CH2-)；3.45-3.72(J＝17.7Hz，2H，-CH2-)；3.65(s，3H，-CH3-)，4.05-4.34(J＝13.2Hz，2H，-CH2-)；5.10(d，J＝4.7Hz，1H，C-6)；5.62(d，J＝4.7Hz，1H，C-7)。
实施例9合成7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TDA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.0011摩尔纯度为94.01％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(以下称为TDC)，并含有少于0.2mg/ml的2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，用3M氨水将此滤液调节到pH6.75。
将TDC溶液加入0.125升搅拌反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μM，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐和15mM磷酸二氢钾，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TDC在3.0分钟出现，TDK在10.9分钟，TDG在8.1分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表
当剩余TDC低于3％时，停止反应，过滤去除含有HPLC纯度为88.27％的TDK的反应溶液，用3M氨水调节到pH7.25。
将TDK溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有23g湿的戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。在20℃、400rpm、1巴绝对压力下进行转化。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
在上述条件下用HPLC控制转化。TDA出现在4.1分钟。提取反应混合物除酶外的代表性的样品，所得结果示于下表
当剩余的TDK的百分比小于3％时，停止反应，反应溶液含有HPLC纯度为88.59的TDA。
例10合成7-氨基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.00195摩尔纯度为91.74％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZC)，并含有少于0.2mg/ml的5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH6.75。
将TZC溶液加入0.125升搅拌反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μM，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐，15mM磷酸二氢钾，pH6.5，含有35％甲醇，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TZC在2.1分钟出现，TZK在5.0分钟，TZG在4.3分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果以β-内酯百分比示于下表
当剩余TZC低于3％时，停止反应，过滤去除含有HPLC纯度为82.42％的TZK的反应溶液，用3M氨水调节到pH7.25。
将TZK溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有23g湿戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。在20℃、400rpm、1巴绝对压力下进行转化。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
在上述条件下用HPLC控制转化。TZA出现在2.5分钟。提取反应混合物除酶外的代表性的样品，所得结果以总β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TZK少于3％时，停止反应。反应溶液中含有HPLC纯度为80.77％的TZA。
实施例11合成7-氨基-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.0014摩尔纯度为92.2％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(下称TTC)，并含有少于0.2mg/ml的2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH6.75。
将TTC溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH6.75。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μM，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐，15mM磷酸二氢钾，pH6.5，含有35％甲醇，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TTC在2.4分钟出现，TTK在6.1分钟，TTG在5.5分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果以总β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TTC低于3％时，停止反应，过滤去除含有HPLC纯度为90.0％的TTK的反应溶液，用3M氨水调节到pH7.25。
将TTK溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有23g湿戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。在20℃、400rpm、1巴绝对压力下进行转化。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
在上述条件下用HPLC控制转化。TTA出现在2.9分钟。提取反应混合物除酶外的代表性的样品，所得结果以总β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TTK少于3％时，停止反应。反应溶液含有HPLC纯度为78.40％的TTA。
实施例12单一步骤合成7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TDA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.0011摩尔纯度为95.41％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(下称TDC)，并含有少于0.2mg/ml的2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，用3M氨水将此滤液调节到pH7.25。
将TDC溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)，和23g湿戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μM，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐，15mM磷酸二氢钾，pH6.5，含有35％甲醇，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TDC在3.0分钟出现，TDK在10.9分钟，TDG在8.1分钟，TDA在4.1分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果以β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TDK低于3％时，停止反应。反应溶液中含有HPLC纯度为95.13％的TDA。
实施例13单一步骤合成7-氨基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.00195摩尔纯度为93.55％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(下称TZC)，并含有少于0.2mg/ml的5-巯基-1-甲基-四唑(MMTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH7.25。
将TZC溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)，和23g湿戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μ，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐，15mM磷酸二氢钾，pH6.5，含有35％甲醇，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TZC在2.1分钟出现，TZK在5.0分钟，TZG在4.3分钟，TZA在2.5分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果以β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TZK低于3％时，停止反应。反应溶液中含有HPLC纯度为78.17％的TZA。
实施例14单一步骤合成7-氨基-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTA)从强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(50ml)，含有0.0016摩尔纯度为91.1％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(下称TTC)，并含有少于0.2mg/ml的2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH7.25。
将TTC溶液加入0.125升搅拌玻璃反应器中，其中有16g共同固定D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶系统的湿Eupergit C250L(25U DAAO/g和30kU过氧化氢酶/g)，和23g湿戊二酰-7-ACA酰基转移酶(87U/g)。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在1巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.25。
用HPLC控制转化，使用反相柱Eclipse XDB-C8 150mm×4.6mm ID×5μ，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐、15mM二氢磷酸钾，pH6.5，含有35％甲醇，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TTC在2.4分钟出现，TTK在6.1分钟，TTG在5.5分钟，TTA在2.9分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果以β-内酰胺百分比示于下表
当剩余TTK低于3％时，停止反应。反应溶液中含有HPLC纯度为88.69％的TTA。
本发明不仅局限于上述具体实施方案，而可以在细节上有所改变。
权利要求
1.制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式III的3-硫醇化的头孢菌素C化合物酶转化成式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过固定的酶系统将式III化合物酶转化成为式IV化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中酶系统含有共同固定的D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶。
4.根据权利要求3所述方法，其中酶转化进行的条件为有分子氧存在，绝对压力1-5巴，pH 6.5-8.0，温度15-30℃，反应时间30-180分钟。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，包括从反应混合物中分离酶系统的步骤，优选通过过滤分离酶系统。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，包括纯化式IV化合物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中用吸附柱纯化该化合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中用适宜的交联剂将酶共固定在适宜的固体载体中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在保持酶分散于底物水溶液中的条件下进行酶处理。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在柱上进行所述或每个酶处理。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，包括为重复使用而回收酶的步骤。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在连续过程中使用不经纯化的式IV化合物以得到任何有用的衍生物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中R是含有至少一个氮原子及可选硫或氧原子的杂环。
15.根据权利要求14所述的方法，其中R是选自以下任何一个或多个基团的杂环基噻吩基、二唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它们的任何衍生物，优选5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-1H-四唑-5-基或1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
16.由权利要求1-15中任一项所述的方法制备的式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物。
17.下式化合物 其中在式IV中，R是1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
18.下式化合物 其中在式IV中，R是1-甲基-1H-四唑-5-基。
19.式IV化合物作为中间体在制备头孢菌素C抗生素方法中的用途。
20.下式的中间体化合物在制备头孢菌素C抗生素方法中的用途，其中在式IV中，R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式IV化合物酶转化成式I化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环，且R1和R2都是H原子，或其一是H原子，其另一是酰基供体。
22.根据权利要求21所述方法，其中用戊二酰-7-ACA酰基转移酶将式IV化合物酶转化形成式I化合物。
23.根据权利要求21或22所述方法，其中酶反应发生的条件为温度约20℃，及pH 6.5-8.0。
24.根据权利要求21-23中任一项所述方法，其中用适宜的交联剂将酶共固定在适宜的固体载体中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中在保持酶分散于底物水溶液中的条件下进行酶反应。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中在柱上进行酶处理。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，包括为重复使用而回收酶的步骤。
29.式I化合物作为中间体在制备头孢菌素C抗生素的方法中的用途。
30.制备3-硫醇化的头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式III化合物酶转化成式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物， 并将式IV化合物酶转化形成式I的3-硫醇化的-7-ACA化合物， 其中R是含有至少一个氮原子的杂环，R1和R2都是H原子，或其一是H原子，而其另一是酰基供体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中由固定的酶系统经一步将式III化合物酶转化成式I化合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中的酶系统包括在固定的戊二酰-7-ACA酰基转移酶存在下的共固定的D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶的组合。
33.根据权利要求30-32中任一项所述方法，其中酶反应发生的条件为温度约20℃，pH 6.5-8.0。
34.根据权利要求30-33中任一项所述方法，其中用适宜的交联剂将酶共固定在适宜的固体载体中。
35.根据权利要求34所述的方法，其中的酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中在保持酶分散于底物水溶液中的条件下进行酶处理。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中在柱上进行所述或每一个酶处理。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的方法，包括为重复使用而回收酶的步骤。
39.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中在连续过程中使用不经纯化的式III化合物以得到任何有用的衍生物。
40.制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤使头孢菌素C与具有通式II的硫醇化合物反应R-SH II其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，形成式III的3-硫醇化的头孢菌素化合物， 其中R的定义如上，并在形成式III化合物后去除过量的式II的硫醇。
41.根据权利要求40所述的方法，其中通过在阴离子交换树脂上吸附而去除过量硫醇。
42.根据权利要求41所述方法，其中阴离子交换树脂是具有交联的丙烯酸共聚物结构的微孔树脂。
43.根据权利要求42所述方法，其中阴离子交换树脂含有8％有功能性硫代烷基苯甲基铵基团的交联。
44.根据权利要求41或42所述方法，其中的树脂采用盐酸盐、氢氧化物、磷酸盐或醋酸盐来循环。
45.根据权利要求40所述方法，其中通过结晶去除过量硫醇。
46.根据权利要求45所述方法，其中在酸性pH条件下进行结晶。
47.根据权利要求40-46中任一项所述方法，其中通过结晶后由吸附于阴离子交换柱而去除过量的硫醇。
48.根据权利要求40-47中任一项所述方法，其中头孢菌素C在水性介质中。
49.根据权利要求40-48中任一项所述方法，其中头孢菌素C为头孢菌素C浓溶液的形式。
50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中反应发生的条件为pH 5.5-8.0，温度60-80℃，反应时间1-8小时。
51.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中反应发生的条件为pH约6.0，温度约65℃。
52.根据权利要求40-51中任一项所述的方法，其中硫醇化合物以1-5mol/mol头孢菌素C的量存在。
53.根据权利要求40-52中任一项所述的方法，其中R是含有至少一个氮原子及可选硫或氧原子的杂环基。
54.根据权利要求40-53中任一项所述的方法，其中R是选自以下任何一个或多个基团的杂环基噻吩基、二唑基、噻唑基、四唑基、噻二唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它们的任何衍生物，优选5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-四唑-5-基或1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
55.由权利要求40-54中任一项所述方法得到的式III化合物， 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，
56.下式化合物 其中在式III中R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
57.下式化合物 其中在式III中R是1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
58.式III化合物作为中间体在制备头孢菌素C衍生物的方法中的用途。
59.制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将由权利要求40-54中任一项所述的方法得到的式III的3-硫醇化的头孢菌素C化合物酶转化成式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物， 其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。
60.根据权利要求59所述的方法，包括以下步骤将式IV的3-硫醇化的-α-酮己二酰-7-ACA化合物， 酶转化形成式I的3-硫醇化的-7-ACA化合物， 其中R是含有至少一个氮原子的杂环，且R1和R2都是氢原子或其一个是氢原子，而另一是酰基供体。
61.制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式IV化合物酶转化成式I化合物 其中R是含有至少一个氮原子的杂环，且R1和R2都是氢原子或其一是氢原子，而另一是酰基供体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中用戊二酰-7-ACA酰基转移酶将式IV化合物酶转化形成式I化合物。
63.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中式I、III和IV化合物为固体或其无毒盐的形式。
64.制备头孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括形成如前述任一项定义的式III、IV和I化合物，以及随后对该化合物的酶反应。
65.根据权利要求64所述的方法，其中抗生素是头孢唑啉、头孢西酮、头孢哌酮、头孢孟多、头孢三嗪、头孢替安和头孢曲松。
全文摘要
制备头孢烷酸衍生物的方法，包括以下步骤将式(III)的3－硫醇化的头孢菌素C化合物通过酶法转化成式(IV)的3－硫醇化－α－酮己二酰－7－氨基头孢烷酸衍生物，其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团。式(IV)化合物用于制备头孢菌素C抗生素及其衍生物。
文档编号C07D501/12GK1531539SQ02809765
公开日2004年9月22日 申请日期2002年4月18日 优先权日2001年4月19日
发明者A·桑切兹－法勒尔, J·A·洛佩兹－马斯, F·加西亚－卡蒙纳, A 桑切兹-法勒尔, 洛佩兹-马斯, 餮 卡蒙纳 申请人:碧欧弗玛穆尔西亚股份有限公司