2′－支链核苷和黄病毒突变的制作方法

专利名称：2′－支链核苷和黄病毒突变的制作方法
技术领域：
本发明是一种用于治疗宿主中黄病毒感染的方法，例如治疗需要上述治疗的人，包括将2’-支链核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中从丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给药。本发明也包括一种用于治疗宿主中黄病毒感染的方法，例如治疗需要上述治疗的人，包括将2’-支链核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，与干扰素联合和/或交替给药。本发明也包括一种检测黄病毒突变株的方法，和对其治疗的方法，以及用于上述检测的试剂盒和物质。
背景技术：
黄病毒科病毒包含至少3种分离的属瘟病毒属(pestiviruses)，其引起牛和猪中的疾病；黄病毒属(flaviviruses)，其是诸如登革热和黄热病的疾病的主要病因；以及丙型肝炎病毒属(hepaciviruses)；其唯一的成员是丙型肝炎病毒(HCV)。黄病毒属包括多于68个成员，可以根据血清学相关性将它们分为不同的组(Calisher等，J.Gen.Virol，1993，70，37-43)。临床症状各不相同，包括发热、脑炎和出血热(Fields Virology，编辑Fields，B.N.，Knipe，D.M.，和Howley，P.M.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1996第31章，931-959)。引起全球性关注的与人类疾病相关的黄病毒包括登革热出血热病毒(DHF)、黄热病病毒、西尼罗河病毒、休克综合征和日本脑炎病毒(Halstead，S.B.，Rev.Infect.DIS.，1984，6，251-264；Halstead，S.B.，Science，239476-481，1988；Monath，T.P.，NewEng.J.Med.，1988，319，641-643)。
瘟病毒属包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV，也称为猪霍乱病毒)和绵羊边界病病毒(BDV)(Moennig，V.等.Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。家畜(牛、猪和绵羊)的瘟病毒导致世界范围内的巨大经济损失。BVDV引起牛粘膜疾病，对于家畜业而言具有重要的经济意义(Meyers，G.和Thiel，H.-J.，Advances in Virus Research，1996，47，53-118；Moennig V.，等，Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。人瘟病毒尚未像动物瘟病毒这样进行广泛地鉴定。但是，血清学的调查研究表明人类受到相当多瘟病毒的威胁。
在黄病毒科中瘟病毒属和丙型肝炎病毒属是密切相关的病毒组。在该黄病毒科中其它密切相关的病毒包括GB病毒A、GB病毒A类似物、GB病毒B和GB病毒C(也称为肝炎G病毒，HGV)。丙型肝炎病毒属(丙型肝炎病毒；HCV)包括许多密切相关但基因型可辨别的感染人的病毒。大约有6种HCV基因型和超过50种的亚型。HCV是全球肝炎的主要病因。大多数HCV感染成为持久性的，以及约75％的病例发展为慢性肝病。慢性HCV感染可导致发展为肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭。由于瘟病毒属和丙型肝炎病毒属之间的相似性，结合丙型肝炎病毒在细胞培养中低的有效生长能力，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)经常作为替代品来研究HCV病毒。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的基因结构是十分相似的。这些正链RNA病毒具有单一大的开放阅读框(ORF)，编码对于病毒复制必需的全部病毒蛋白。这些蛋白作为多聚蛋白表达，是通过细胞和病毒编码的蛋白酶两者共同产生成熟病毒蛋白的共翻译和翻译后加工过程。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白大约位于开放阅读框羧基末端的三分之二，命名为非结构(NS)蛋白。对于瘟病毒和丙型肝炎病毒而言，ORF的非结构蛋白部分的基因结构和多聚蛋白加工过程十分相似。对于瘟病毒和丙型肝炎病毒二者而言，成熟的非结构(NS)蛋白，从非结构蛋白编码区的氨基末端到ORF的羧基末端连续依次包含p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白共有特定蛋白功能特性的序列结构域。例如，两组病毒中的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶特性的氨基酸序列基序(Gorbalenya等.(1988)Nature 33322；Bazan和Fletterick(1989)Virology171637-639；Gorbalenya等.(1989)Nucleic Acid Res.17.3889-3897)。类似地，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白具有RNA指导的RNA聚合酶特性的基序(Koonin，E.V.和Dolja，V.V.(1993)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.28375-430)。
此外，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白在病毒生活周期中的实际角色和功能是完全相似的。在两者中，NS3丝氨酸蛋白酶负责在ORF中其下游位置多聚蛋白前体的所有蛋白水解加工(Wiskerchen和Collett(1991)Virology 184341-350；Bartenschlager等.(1993)J Virol.673835-3844；Eckart等.(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.192399-406；Grakoui等.(1993)J.Virol.672832-2843；Grakoui等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010583-10587；Hijikata等.(1993)J.Virol.674665-4675；Tome等.(1993)J.Virol.674017-4026)。在两者中，NS4A蛋白作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子(Bartenschlager等.(1994)J.Virol.685045-5055；Failla等.(1994)J.Virol.683753-3760；Lin等.(1994)688147-8157；Xu等.(1997)J.Virol.715312-5322)。两种病毒的NS3蛋白也具有解旋酶功能(Kim等.(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.215160-166；Jin和Peterson(1995)Arch.Biochem.Biophys.，32347-53；Warrener和Collett(1995)J.Virol.691720-1726)。最终，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白具有预期的RNA指导的RNA聚合酶活性(Behrens等.(1996)EMBO J.1512-22；Lchmann等.(1997)J.Virol.718416-8428；Yuan等.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.232231-235；Hagedorn，PCT WO 97/12033；Zhong等.(1998)J.Virol.72.9365-9369)。
业已鉴定具有抗黄病毒科病毒活性的抗病毒剂实例包括(1)干扰素干扰素(IFNs)是近十年来业已从商业上获得用于治疗慢性肝炎的化合物。IFNs是通过免疫细胞对病毒感染的应答所产生的糖蛋白。IFNs抑制许多病毒的复制，包括HCV，当用于单独治疗丙型肝炎病毒感染时，IFN抑制血清HCV-RNA至无法检测到的水平。此外，IFN使血清氨基转移酶水平正常化。不幸的是，lFN的效果是暂时的且稳定的应答仅在8％-9％的慢性感染HCV患者中出现(GaryL.Davis.Gastroenterology 118S104-S114，2000)。
许多患者披露HCV治疗使用了基于干扰素的疗法。例如，Blatt等的美国专利号5,980,884公开了用于再治疗患HCV患者的方法，使用代表多数人意见的干扰素。Bazer等的美国专利号5,942,223公开了一种抗HCV疗法，使用绵羊或牛τ-干扰素。Alber等的美国专利号5,928,636公开了用于治疗包括HCV的感染性疾病的白介素-12和α-干扰素的联合疗法。美国Glue等专利5,908,621公开了用乙二醇修饰的干扰素治疗HCV。Chretien等的美国专利号5,849,696公开了单独使用胸腺素或与干扰素联合使用，用于治疗HCV。Valtuena等的美国专利号5,830,455公开了一种使用干扰素和自由基清除剂的联合HCV疗法。Imakawa的美国专利号5,738,845公开了使用人τ-干扰素蛋白治疗HCV。其它基于干扰素的用于HCV治疗的方法公开于Testa等的美国专利号5,676,942、Blatt等的美国专利号5,372,808和美国专利号5,849,696。
(2)利巴韦林(Battaglia，A.M.等.，Ann.Pharmacother，2000，34，487-494)；Berenguer，M.等.Antivir.Ther.，1998 3(Suppl.3)，125-136)。
利巴韦林(1-β-D-呋核亚硝脲-1-1，2，4-三唑-3-氨甲酰)是一种合成的、非干扰素诱导的、广谱的抗病毒核苷类似物。其以商标名VirazoleTM(The Merck Index，第11版，编辑Budavari，S.，Merck & Co.，Inc.，Rahway，NJ，PL304，1989)；Rebetol(Schering Plough)和Co-Pegasus(Roche)出售。美国专利号3,798,209和RE29,835(ICN Pharmaceuticals)公开并要求保护利巴韦林。利巴韦林在结构上类似于鸟苷，具有体外抗包括黄病毒的一些DNA和RNA病毒活性(GaryL.Davis.Gastroenterology 118S104-S114，2000)。美国专利号4,211,771(ICNPharmaceuticals)公开了利巴韦林所谓抗病毒剂的用途。在40％患者中利巴韦林降低血清氨基转移酶水平至正常，但其无法降低HCV-RNA的血清水平(GaryL.Davis.Gastroenterology 118S104-S114，2000)。因此，单独使用利巴韦林无法有效降低病毒RNA水平。此外，利巴韦林具有明显的毒性且已知能诱发贫血症。
干扰素和利巴韦林的联合给药Schering-Plough以Rebetol胶囊(200mg)形式出售利巴韦林用于患HCV患者的给药。美国FDA已批准Rebetol胶囊与Schering的干扰素α-2b产品IntronA和PEG-IntronTM联合用于治疗慢性HCV感染。尽管Intron A和PEG-Intron已批准用于单一疗法(即，无需利巴韦林的给药)，但是没有批准Rebetol胶囊用于单一疗法(即，独立于IntronA或PEG-Intron的给药)。HoffmanLa Roche在欧洲和美国以Co-Pegasus的名称出售利巴韦林，也用于与干扰素联合给药治疗HCV。目前其它α干扰素产品，包括Roferon-A(Hoffmann-La Roche)、Infergen(Intermune，前Amgen′s产品)和Wellferon(Wellcome Foundation)也为FDA批准用于HCV单一疗法。目前在开发中用于治疗HCV的干扰素产品包括Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human Genome Sciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、Amarillo Biosciences的口服α干扰素和InterMune的γ-1b干扰素。
业已报道在治疗IFN首次用于实验的(naive)患者中，IFN和利巴韦林联合治疗HCV感染是有效的(Battaglia，A.M.等.，Ann.Pharmacother.34487-494，2000)。在肝炎发展前和当组织学疾病存在时，联合治疗皆有效(Berenguer，M.等.Antivir.Ther.3(Suppl.3)125-136，1998)。当前，用于HCV最有效的疗法是聚乙二醇缀合的干扰素和利巴韦林的联合疗法(2002 NIHConsensus Development Conference on the Management of Hepatitis C)。然而，联合疗法的副作用明显，包括溶血、流行性感冒样症状、贫血和疲劳(Gary L.Davis.Gastroenterology 118S104-S114，2000)。
(3)基于底物的NS3蛋白酶抑制剂(例如，Attwood等，抗病毒肽衍生物，PCT WO 98/22496，1998；Attwood等，Antiviral Chemistry and Chemotherapy，1999，10，259-273；Attwood等，Preparation and use of amino acid derivatives asanti-viral agents，德国专利公开号.DE 19914474；Tung等.Inhibitors of serineproteases，particularly hepatitis C virus NS3 protease，PCT WO 98/17679)，包括α-酮酰胺和肼基脲(hydrazinoureas)，和在亲电子试剂中能起终止作用的抑制剂，例如硼酸或膦酸酯(Llinas-Brunet等，Hepatitis C inhibitor peptide analogues，PCTWO 99/07734)。
(4)非基于底物的抑制剂，例如，2，4，6-三羟基-3-硝基-苯甲酰胺衍生物(SudoK.等，Biochemical and Biophysical Research Communications，1997，238，643-647；Sudo K.等.Antiviral Chemistry and Chemotherapy，1998，9，186)，包括RD3-4082和RD3-4078，前者酰胺为14碳链所取代，后者具有对苯氧基苯基；(5)噻唑烷衍生物，在采用NS3/4A融合蛋白和NS5A/5B底物进行的反相HPLC测定中显示了相应的抑制作用(例如Sudo K.等，Antiviral Research，1996，32，9-18)，尤其是化合物RD-1-6250，具有为长烷基链所取代的稠合的肉桂酰基，RD4 6205和RD4 6193；(6)噻唑烷和N-苯甲酰苯胺(例如Kakiuchi N.等.J.EBS Letters 421，21-220；和Takeshita N.等.，Analytical Biochemistry，1997，247，242-246)；(7)在SDS-PAGE和射线自显影分析法中具有抗蛋白酶活性的菲醌，分离自链霉菌(Streptomyces sp)发酵肉汤培养基的，例如Sch 68631(Chu M.等.，Tetrahedron Letters，1996，37，7229-7232)，和Sch 351633，分离自灰青霉菌(Penicillium griseofulvum)，在闪烁迫近分析法中证实其活性(Chu M.等.，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9，1949-1952)；(8)选择性NS3抑制剂，例如，基于分离自水蛭的大分子elgin c的那些(Qasim M.A.等.，Biochemistry，1997，36，1598-1607)(9)解旋酶抑制剂(例如Diana GD.等，Compounds，compositons and methodsfor treatment of hepatitis C，美国专利号5,633,358；Diana GD.等.，Piperidinederivatives，pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment ofhepatitis C，PCT WO 97/36554)；(10)聚合酶抑制剂，例如核苷酸类似物、胶霉毒素(Ferrari R.等.Journalof Virology，1999，73，1649-1654)，和天然产物浅蓝菌素(Lohmann V等.，Virology，1998，249，108-118)；(11)与病毒的5′非编码区(NCR)中一段序列互补的反义硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸(S-ODN)(Alt M.等，Hepatology，1995，22，707-717)，或包含NCR 3′末端的核苷酸326-348和位于HCVRNA核心编码区的核苷酸371-388(AltM.等，Archives of Virology，1997，142，589-599；Galderisi U.等，Journal of CellularPhysiology，1999，181，251-257)。
(12)依赖于IRES翻译的抑制剂(Ikeda N等.，Agent for the prevention andtreatment of hepatitis C，日本专利公开号JP-08268890；Kai Y.等.，Prevention andtreatment of viral diseases，日本专利公开号JP-10101591)；(13)抗核酸酶核酶(Maccjak D.J.等，Hepatology 1999，30，摘要995)。
(14)也已被开发用于治疗黄病毒感染的核苷类似物。
在相应于国际公开号WO 01/90121和WO 01/92282的美国专利公开号2003/0050229 A1和美国专利公开号2003/0060400 A1中，Idenix Pharmaceuticals，Ltd公开了支链核苷，以及它们在治疗HCV和黄病毒及瘟病毒中的用途。一种用于治疗人和其它宿主动物中丙型肝炎病毒感染(和黄病毒及瘟病毒)的方法公开于Idenix出版物中，包括给予有效量的生物学活性的1’，2’，3’，或4’-支链β-D或β-L核苷或其药学上可接受的盐或前体药物，单独给予或联合给予，任选地在药学上可接受的载体中。
其它专利申请公开了某些核苷类似物治疗丙型肝炎病毒的用途，包括BioChem Pharma，Inc.(现在为Shire Biochem，Inc.)提交的国际专利公开号WO01/32153(PCT/CA00/01316；于2000年11月3日提交)和WO 01/60315(PCT/CA01/00197；于2001年2月19日提交)；Merck & Co.，Inc.提交的美国专利公开号2002/0147160和相应的国际专利公开号WO 02/057425(PCT/US02/01531；于2002年1月18日提交)和WO 02/057287(PCT/US02/03086；于2002年1月18日提交)；美国专利公开号2003/083307 A1和US 2003/008841 A1，以及相应的国际专利公开号WO 02/18404(PCT/EP01/09633；公布于2001年8月21日)；Hoffman LaRoche提交的WO02/100415和WO 02/094289；Ribapharm提交的美国专利公开号2003/028013 A1和相应的国际专利公开号WO 03/062255和WO 03/061385；以及Pharmasset提交的WO 01/79246和WO 02/32920。
(15)各种化合物，包括1-氨基-烷基环己烷(Gold等的美国专利号6,034,134)、烷基脂质(Chojkier等的美国专利号5,922,757)、维生素E和其它抗氧化剂(Chojkier等的美国专利号5,922,757)、角鲨、金刚烷胺、胆酸(Ozeki等的美国专利号5,846,964)、N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸、(Diana等的美国专利号5,830,905)、苯二甲酰胺(Diana等的美国专利号5,633,388)、多腺苷酸衍生物(Wang等的美国专利号5,496,546)、2’，3’-二脱氧肌苷(Yarchoan等的美国专利号5,026,687)和苯并咪唑(Colacino等的美国专利号5,891,874)。
(16)目前处于临床开发中的用于治疗丙型肝炎病毒的其它化合物，包括Schering-Plough的白介素-10、Interneuron的IP-501、Vertex的Merimebodib(VX-497)、Endo Labs Solvay的AMANTADINE(金刚烷胺)、RPI的HEPTAZYME、Idun Pharma的IDN-6556、XTL的XTL-002、Chiron的HCV/MF59、NABI的CIVACIR、ICN的LEVOVIRIN、ICN的VIRAMIDINE、Sci Clone的ZADAXIN(胸腺素α-1)、Maxim的CEPLENE(二盐酸组胺)、Vertex/Eli Lilly的VX 950/LY570310、Isis Pharmaceutical/Elan的ISIS 14803、Idun Pharmaceuticals Inc.的IDN-6556和AKROS Pharma的JTK 003。
在用抗病毒剂长期治疗后，可出现病毒的药物抗性变体。由于编码用于病毒复制的酶的基因的突变，最经常地出现药物抗性，以及，例如就HIV而言，所述的酶为逆转录酶、蛋白酶或DNA聚合酶。业已证实通过给予化合物，其与第二种，和有可能第三种抗病毒化合物联合或交替给予，所述抗病毒化合物能有效地抗病毒，药物的抗病毒感染功效可得到延长、增加或恢复。通过上述联合或交替治疗，药物的药物代谢动力学、生物分布或其它参数可得到改变。一般而言，较交替治疗通常优选联合治疗，因为其诱导多种同时发生的对病毒的压制。但是，无法预测所给定的药物将诱发病毒基因组中何种突变，突变是否是持久的或暂时的，或具有或不具有突变的病毒序列的感染的细胞如何对与其它试剂联合或交替的治疗作出反应。但其为目前事实所困扰，即仅有极少量的用新式抗病毒剂处理的长期细胞培养物中药物抗性的动力学数据。
本发明的一个目的优化HCV感染的治疗。
另一个目的提供了2’-支链核苷，具体而言2’-支链嘧啶核苷用于治疗黄病毒感染的最佳给药方案。
本发明的另一个目的提供了一种用于治疗感染瘟病毒、黄病毒或丙型肝炎病毒患者的方法和包括2’-支链核苷的组合物，较单独给予2’-支链嘧啶核苷其显示了有利的或改良的药物代谢动力学、生物分布、新陈代谢、抗性或其它参数。
本发明的另一个目的提供了一种用于治疗感染黄病毒患者的方法和组合物，其中2’-支链核苷，具体而言2’-支链嘧啶核苷与一种或多种化合物联合和/或交替给药，所述化合物以协同方式或有利于2’-支链嘧啶核苷的方式抗病毒。
本发明的另一个目的提供了一种用于治疗感染瘟病毒、黄病毒或丙型肝炎病毒抗药型患者的方法和组合物。
本发明的一个目的也提供了一种鉴定黄病毒突变株的方法和试剂盒。
发明简述业已发现长期使用2’-支链核苷，例如描述如下的2’-支链核苷，具体而言2’-支链嘧啶核苷，例如化合物β-D-2’-CH3-核糖C，或2’-支链嘌呤核苷，包括化合物β-D-2’-CH3-核糖腺苷或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基腺苷，与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(

图11)的核苷酸处的突变相关，导致了氨基酸残基中丝氨酸改变为不同的氨基酸，例如苏氨酸。该结构域发现于HCV基因组和其它黄病毒基因组的NS5B区中。其在所有丙型肝炎病毒、瘟病毒和黄病毒基因组中高度保守(图11，Lai等.J Virol.1999，73，10129-36)。
在本发明的一个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和
R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2；和碱基(Base)是如本文所进一步描述的嘌呤或嘧啶。
在本发明第二个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中碱基(Base)是本文所定义的嘌呤或嘧啶碱基。
R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根)；直链、支链或环烷基(包括低级烷基)；酰基(包括低级酰基)；CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；R6是烷基(包括低级烷基和卤代烷基)、CH3、CF3、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、2-Br-乙基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、CF3、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；和R7是氢、OR3、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；和X是O、S、SO2或CH2。
和碱基(Base)是如本文所进一步描述的嘌呤或嘧啶。
在本发明的第三个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 其中碱基(Base)是如本文所定义的嘌呤或嘧啶碱基；R6是烷基(包括低级烷基和卤代烷基)、CH3、CF3、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、2-Br-乙基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、CF3、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R7是OR2、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、卤代-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R9是氢、OR3、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R10是H、烷基(包括低级烷基)、氟、氯、溴或碘；R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根)；直链、支链或环烷基(包括低级烷基)；酰基(包括低级酰基)；CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和X是O、S、SO2或CH2。
在BVDV感染情况下，2’-支链核苷，具体而言诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷诱发BVDV的RNA聚合酶的残基1214处的鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)，其导致在该酶405位的氨基酸残基丝氨酸改变为苏氨酸。该丝氨酸残基位于所述RNA聚合酶结构域B的保守连续序列(XRXSGXXXT)(图5和11)，通过突变分析得到鉴定(Lai V C.，Kao C.C.，Ferrari E.，Park J.，Uss A.S.，Wright-Minogue J.，Hong Z.，和J.Y.Lau.“Mutational analysis of bovine viraldiarrhea virusRNA-dependent RNA polymerase”J Virol.1999，73，10129-36)。
在HCV感染情况下，2’-支链核苷，具体而言诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷诱发编码RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸282的核苷酸突变(图11)，其导致丝氨酸改变为不同的氨基酸，例如苏氨酸。
此外，业已发现2’-支链核苷和干扰素产生协同作用抑制黄病毒。具体而言，诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷或诸如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基腺苷化合物的2’-支链嘌呤核苷，和干扰素α-2b联合和/或交替给药，产生协同作用抑制黄病毒。此外，业已发现抗性病毒群体，其在2’-支链核苷治疗后出现，例如，在β-D-2’-CH3-核糖C治疗后，显示对用干扰素的后继治疗增加的敏感性。因此，2’-支链核苷和干扰素的序贯和/或联合疗法可实质上减轻黄病毒感染。
本发明的一方面提供了一种通过将治疗有效量的2’-支链核苷，例如，2’-支链嘧啶核苷， 例如β-D-2’-CH3-核糖C，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予宿主，例如需要上述治疗的人，以治疗黄病毒感染的方法。该高保守丝氨酸残基相应于BVDV基因组RNA聚合酶区405位的氨基酸。其也相应于HCV基因组RNA聚合酶区282位的氨基酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)。
本发明的另一方面提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主为黄病毒所感染，所述黄病毒包含黄病毒的保守丝氨酸残基处丝氨酸至苏氨酸突变(图11)，例如，在BVDV RNA聚合酶区的氨基酸405或HCV RNA聚合酶区的氨基酸282处。在一个具体的实施方案中，给予干扰素α-2b以治疗和/或基本上治愈突变的黄病毒科病毒导致的感染。
在本文中本发明所公开的也最低限度低包括了至少如下实施方案(i)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷，例如，2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受载体或稀释剂中，和一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，例如，不同于核苷酸1214(G至C)或BVDVRNA聚合酶区的405丝氨酸至苏氨酸或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCV RNA聚合酶区的282丝氨酸至苏氨酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
(ii)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，和干扰素。干扰素包括Schering的Intron-A(干扰素α-2b)、Schering的PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human GenomeSciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、Amarillo Biosciences的口服α干扰素和InterMune的干扰素γ-1b。
(iii)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，包括β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，包括3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；和一种或多种直接或间接诱导黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
(iv)一种用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的方法，包含将治疗有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，例如，不同于核苷酸1214(G至C)或BVDV RNA聚合酶区的405丝氨酸至苏氨酸或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCV RNA聚合酶区的282丝氨酸至苏氨酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予人。
(v)一种用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的方法，包含将有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或对于宿主其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与干扰素联合和/或交替给予宿主。干扰素包括Schering的Intron-A(干扰素α-2b)、Schering的PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human Genome Sciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、Amarillo Biosciences的口服α干扰素和InterMune的干扰素γ-1b。
(vi)一种用于治疗黄病毒科病毒感染的患者的方法，所述黄病毒科病毒具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性，包含给予有效量的干扰素，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，任选地以基本上消除病毒载量的方式。
(iv)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含将有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给药。
(v)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予患者有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)化验患者血液以对从野生型到病毒突变体的血清转化进行测试；和(c)给予有效量的干扰素；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
(vi)一种用于鉴定怀疑含有抗2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐的黄病毒的样品的方法；包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(图11)的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与所述序列的杂交。
(vii)一种用于鉴定怀疑含有抗2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐的黄病毒的样品的方法，包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷的杂交。
(viii)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒样品；(c)测定所述病毒的复制适合度；(d)测定是否样品中所述病毒的复制适合度小于野生型病毒的复制适合度，其表明抗2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；和(e)给予那些抗2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐的患者有效量的干扰素。
(ix)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒培养物样品；
(c)培养所述样品并比较所述样品与野生型病毒之间的噬菌斑生长；(d)测定是否所述样品的噬菌斑生长小于野生型的噬菌斑生长，其表明具有2’-支链核苷抗性；和(e)给予那些具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的患者有效量的干扰素。
(x)一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒存在的方法，包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(图11)的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与所述序列的杂交以确定具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的存在。
(xi)一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒存在的方法；包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；
(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDVRNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷杂交，以确定具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的存在。
所述公开的联合和/或交替给药方案在预防和治疗黄病毒感染中是有用的，所述黄病毒包括BVDV、BDV、CSFV、DHF、黄热病病毒、休克综合征和日本脑炎病毒和HCV。
此外，对于黄病毒带毒者对2’-支链核苷治疗的长期响应而言，黄病毒诊断标记物相应的氨基酸序列可确定自例证性的黄病毒核苷酸序列。
除鉴定用于鉴定与2’-支链核苷失效相关的黄病毒毒株目的的病毒标记物之外，本发明也可用于鉴定对2’-支链核苷治疗响应的黄病毒毒株。在该关系中，缺乏与2’-支链核苷治疗相关的病毒标记物可用于建议疗程，所述疗程包括对于那些携带缺乏与2’-支链核苷治疗失效相关的病毒标记物的黄病毒的个体而言，2’-支链核苷作为用药程式。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于扩增黄病毒核酸序列的寡核苷酸引物。在一个实施方案中，所述寡核苷酸具有至少14个核苷酸的长度，在序列特异性、严格杂交条件下，与含有与治疗失效相关标记物的核苷酸序列杂交。
用作为引物杂交区的寡核苷酸序列也可用作为探针的杂交区。引物序列用作为探针的适用性基于引物的杂交特性，同样地，用作为探针的寡核苷酸可用作为引物。
此外，本发明提供了一种检测含有黄病毒带毒者对2’-支链核苷治疗长期响应的预兆的氨基酸(如本文中所广泛描述的)的蛋白质、肽或肽片段，或那些蛋白质、肽或肽片段的抗体的方法、物质和试剂盒。依据于诊断物质的便利性和可能取决于其浓度，可对宿主血清或组织测试所述蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗体。
所述蛋白质、肽或肽片段可通过与抗体，优选单克隆抗体的反应得到证实，例如使用蛋白质印迹方法。此外，所述蛋白质或肽可通过任何本领域公知的方法得到分离和测序或以其它方式得到鉴定，包括用2D PAGE方法。在一个实施方案中，反应抗体结合黄病毒蛋白质或肽序列，所述序列包括在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中的苏氨酸，而非丝氨酸，所述苏氨酸例如位于BVDV基因组RNA聚合酶区的405位或位于HCV基因组RNA聚合酶区的282位。
在另一个实施方案中，反应抗体与肽序列特异性结合，所述序列包括在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中的苏氨酸，而非丝氨酸，所述苏氨酸例如位于BVDV基因组RNA聚合酶区的405位或位于HCV基因组RNA聚合酶区的282位，其代表了黄病毒RNA聚合酶区中与治疗失效相关的特异性点突变。
在具体的实施方案中，使用了结合至少一个为sequence ID Nos.1-31中核酸序列所编码的肽或肽片段的抗体。
在具体的实施方案中，使用了结合至少一个为sequence ID Nos.32-62中核酸序列所编码的肽或肽片段的抗体。
附图简述图1显示了从未处理的BVDV出现β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV。
图2显示了(A)野生型(wt)BVDV(I-N-dIns株)，和(B)β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV(I-N-dInsβ-D-2’-CH3-核糖C-R)转化灶形成(focus formation)的表型。
图3显示了野生型BVDV I-N-dIns和其β-D-2’-CH3-核糖C抗性突变株，I-N-dInsβ-D-2’-CH3-核糖C-R(抗性突变株)的生长动力学。
图4显示了在新生感染的MDBK细胞中β-D-2’-CH3-核糖C对病毒生长的影响(其中I-N-dIns是野生型(wt)BVDV，以及抗体突变株是I-N-dInsβ-D-2’-CH3-核糖C-R(β-D-2’-CH3-核糖C-抗性BVDV))。
图5是BVDV NS5B区的图示，显示了建议的功能结构域，基于突变分析的结果(Vassilev，V.B.和R.O.Donis.(2000)Bovine viral diarrhea virus inducedapoptosis correlates with increased intracellular viral RNA accumulation.Virus Res.69(2)95-107)。大箭头表示仅在β-D-2’-CH3-核糖C-抗性BVDV的NS5B区中发现的氨基酸改变的位置(Ser405至Thr405)。
图6显示了在新生感染的MDBK细胞中干扰素α-2b对病毒生长的影响(I-N-dIns野生型(wt)BVDV；I-N-dInsβ-D-2’-CH3-核糖C-Rβ-D-2’-CH3-核糖C-抗性BVDV(抗性突变株))。
图7显示了在持续性感染的MDBK细胞中β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b对BVDV(I-N-dIns株)滴度的影响。
图8显示了在持续感染的MDBK细胞中β-D-2’-CH3-核糖C与干扰素α-2b联合给药对野生型BVDV(I-N-dIns株)滴度的影响。
图9显示了在持续性感染的MDBK细胞中β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b(IntronA)对BVDV(NY-1株)滴度的影响。
图10显示了在持续性感染的MDBK细胞中β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b(Intron A)对野生型BVDV(I-N-dIns株)滴度的影响。
图11显示了不同的黄病毒中RNA聚合酶中结构域B的比对；大号粗体字体显示了100％保守的氨基酸；下划线的丝氨酸氨基酸残基是在用2’-支链核苷处理后可突变为苏氨酸的一种残基。[100％保守的丝氨酸残基也具有下划线，并表示为在用2’-支链核苷处理后突变为苏氨酸的氨基酸(BVDV RNA聚合酶区的Ser405；HCV RNA聚合酶区的Ser282)。参见Lai等.J Virol.1999，73，10129-36.]发明详述业已发现长期使用2’-支链核苷，例如描述如下的2’-支链核苷，具体而言诸如化合物β-D-2’-CH3-核糖C的2’-支链嘧啶核苷，与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(图11)的核苷酸处的突变相关，导致了氨基酸残基中丝氨酸改变为不同的氨基酸，例如苏氨酸。该结构域发现于HCV基因组和其它黄病毒基因组的NS5B区中。其在所有丙型肝炎病毒、瘟病毒和黄病毒基因组中高度保守(图11，Lai等.J Virol.1999，73，10129-36)。
在BVDV感染情况下，2’-支链核苷，具体而言诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷诱发BVDV的RNA聚合酶的残基1214处的鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)，其导致在该酶405位的氨基酸残基丝氨酸改变为苏氨酸。该丝氨酸残基位于所述RNA聚合酶结构域B的保守连续序列(XRXSGXXXT)(图5和11)，通过突变分析得到鉴定(Lai V. C.，Kao C.C.，Ferrari E.，Park J.，Uss A.S.，Wright-Minogue J.，Hong Z.，和J.Y.Lau.“Mutational analysis of bovine viraldiarrhea virusRNA-dependent RNA polymerase”J Virol.1999，73，10129-36)。
在HCV感染情况下，2’-支链核苷，具体而言诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷诱发编码RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸282的核苷酸突变(图11)，其导致丝氨酸改变为不同的氨基酸，例如苏氨酸。
此外，业已发现2’-支链核苷和干扰素产生协同作用抑制黄病毒。具体而言，诸如β-D-2’-CH3-核糖C化合物的2’-支链嘧啶核苷和干扰素α-2b联合和/或交替给药，产生协同作用抑制黄病毒。此外，业已发现抗性病毒群体，其在2’-支链核苷治疗后出现，例如，在β-D-2’-CH3-核糖C治疗后，显示对用干扰素的后继治疗增加的敏感性。因此，2’-支链核苷和干扰素的序贯和/或联合疗法可实质上减轻黄病毒感染。
本发明的一方面提供了一种通过将治疗有效量的2’-支链核苷，例如，2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予宿主，例如需要上述治疗的人，以治疗黄病毒感染的方法。该高保守丝氨酸残基相应于BVDV基因组RNA聚合酶区405位的氨基酸。其也相应于HCV基因组RNA聚合酶区282位的氨基酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)。
本发明的另一方面提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主为黄病毒所感染，所述黄病毒包含在黄病毒的保守丝氨酸残基处丝氨酸至苏氨酸突变(图11)，例如，在BVDVRNA聚合酶区的氨基酸405或HCV RNA聚合酶区的氨基酸282处。在一个具体的实施方案中，给予干扰素α-2b以治疗和/或基本上治愈突变的黄病毒科病毒导致的感染。
在本文中本发明所公开的也最低限度低包括了至少如下实施方案(i)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷，例如，2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受载体或稀释剂中，和一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，例如，不同于核苷酸1214(G至C)或BVDV RNA聚合酶区的405丝氨酸至苏氨酸或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCV RNA聚合酶区的282丝氨酸至苏氨酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
(ii)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，和干扰素。干扰素包括Schering的Intron-A(干扰素α-2b)、Schering的PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human Genome Sciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、AmarilloBiosciences的口服α干扰素和InterMune的干扰素γ-1b。
(iii)一种有效用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，包括β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，包括3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；和一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
(iv)-种用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的方法，包含将治疗有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或对于人其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，例如，不同于核苷酸1214(G至C)或BVDV RNA聚合酶区的405丝氨酸至苏氨酸或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCV RNA聚合酶区的282丝氨酸至苏氨酸(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予人。
(v)一种用于治疗诸如人的宿主中黄病毒感染的方法，包含将有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或对于宿主其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与干扰素联合和/或交替给予宿主。干扰素包括Schering的Intron-A(干扰素α-2b)、Schering的PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human Genome Sciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、Amarillo Biosciences的口服α干扰素和InterMune的干扰素γ-1b。
(vi)一种用于治疗黄病毒科病毒感染的患者的方法，所述黄病毒科病毒具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性，包含给予有效量的干扰素，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，任选地以基本上消除病毒载量的方式。
(iv)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含将有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；与一种或多种直接或间接诱导黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给药。
(v)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予患者有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)化验所述患者血液以对从野生型到病毒突变体的血清转化进行测试；和(c)给予有效量的干扰素；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
(vi)一种用于鉴定怀疑含有具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的样品的方法；包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(图11)的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与所述序列的杂交。
(vii)一种用于鉴定怀疑含有具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的样品的方法，包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞嘧啶或HCV核苷酸8443处的胞嘧啶互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷的杂交。
(viii)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒样品；(c)测定所述病毒的复制适合度；(d)测定是否样品中病毒的复制适合度小于野生型病毒的复制适合度，其表明具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性；和(e)给予那些具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的患者有效量的干扰素。
(ix)一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒培养物样品；(c)培养所述样品并比较样品与野生型病毒之间的噬菌斑生长；(d)测定是否所述样品的噬菌斑生长小于野生型的噬菌斑生长，其表明具有2’-支链核苷抗性；和(e)给予那些具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的患者有效量的干扰素。
(x)一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒存在的方法，包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；
(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸(图11)的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与所述序列的杂交以确定具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的存在。
(xi)一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒存在的方法；包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDVRNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷杂交，以确定具有2’-支链核苷，诸如β-D-2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，诸如β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物，或β-D-2’-支链嘌呤核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖A或β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤或前体药物，诸如3’-缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐抗性的黄病毒的存在。
所述公开的联合和/或交替用药方案在预防和治疗黄病毒感染中是有用的，所述黄病毒包括BVDV、BDV、CSFV、DHF、黄热病病毒、休克综合征和日本脑炎病毒和HCV。
此外，对于黄病毒带毒者对2’-支链核苷治疗的长期响应而言，黄病毒诊断标记物相应的氨基酸序列可确定自例证性的黄病毒核苷酸序列。
除鉴定用于鉴定与2’-支链核苷失效相关的黄病毒毒株目的的病毒标记物之外，本发明也可用于鉴定对2’-支链核苷治疗响应的黄病毒毒株。在该关系中，缺乏与2’-支链核苷治疗相关的病毒标记物可用于建议疗程，所述疗程包括对于那些携带缺乏与2’-支链核苷治疗失效相关的病毒标记物的黄病毒的个体而言，2’-支链核苷作为用药程式。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于扩增黄病毒核酸序列的寡核苷酸引物。在一个实施方案中，所述寡核苷酸具有至少14个核苷酸的长度，在序列特异性、严格杂交条件下，与含有与治疗失效相关标记物的核苷酸序列杂交。
用作为引物杂交区的寡核苷酸序列也可用作为探针的杂交区。引物序列用作为探针的适用性基于引物的杂交特性，同样地，用作为探针的寡核苷酸可用作为引物。
此外，本发明提供了一种检测含有是黄病毒带毒者对2’-支链核苷治疗长期响应的预兆的氨基酸(如本文中所广泛描述的)的蛋白质、肽或肽片段，或那些蛋白质、肽或肽片段的抗体的方法、物质和试剂盒。依据诊断物质的便利性和可能取决于其浓度，可对宿主血清或组织测试所述蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗体。
所述蛋白质、肽或肽片段可通过与抗体，优选单克隆抗体的反应得到证实，例如使用蛋白质印迹方法。此外，所述蛋白质或肽可通过任何本领域公知的方法得到分离和测序或以其它方式得到鉴定，包括用2D PAGE方法。在一个实施方案中，反应抗体结合黄病毒蛋白质或肽序列，所述序列包括在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中的苏氨酸，而非丝氨酸，所述苏氨酸例如位于BVDV基因组RNA聚合酶区的405位或位于HCV基因组RNA聚合酶区的282位。
在另一个实施方案中，反应抗体与肽序列特异性结合，所述序列包括在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中的苏氨酸，而非丝氨酸，所述苏氨酸例如位于BVDV基因组RNA聚合酶区的405位或位于HCV基因组RNA聚合酶区的282位，其代表了黄病毒RNA聚合酶区中与治疗失效相关的特异性点突变。
在具体的实施方案中，使用了结合至少一个为sequence ID Nos.1-31中核酸序列所编码的肽或肽片段的抗体。
在具体的实施方案中，使用了结合至少一个为sequence ID Nos.32-62中核酸序列所编码的肽或肽片段的抗体。
I.定义在本文中使用的术语“抗性病毒”指与首次用于实验的病毒比较，显示3，和更通常地，5或更多倍EC50增加的病毒。
术语“氨基酸”包括天然存在和合成的α、β、γ或δ氨基酸，包括但不限于，在蛋白中发现的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸是L-构型，但也可以是D-构型。可选地，所述氨基酸可以是丙氨酰、缬氨酰、亮氨酰、异亮氨酰、脯氨酰、苯丙氨酰、色氨酰、甲硫氨酰、甘氨酰、丝氨酰、苏氨酰、半胱氨酰、酪氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰胺酰、天冬氨酰、谷氨酰、赖氨酰、精氨酰、组氨酰、β-丙氨酰、β-缬氨酰、β-亮氨酰、β-异亮氨酰、β-脯氨酰、β-苯丙氨酰、β-色氨酰、β-甲硫氨酰、β-甘氨酰、β-丝氨酰、β-苏氨酰、β-半胱氨酰、β-酪氨酰、β-天冬酰胺酰、β-谷氨酰胺酰、β-天冬氨酰、β-谷氨酰、β-赖氨酰、β-精氨酰或β-组氨酰的衍生物。
本文中所使用的氨基酸的缩写描述于表1中。
表1
“扩增试剂”指各种缓冲液、酶、引物、脱氧核苷三磷酸(常规的和非常规的)，以及用于执行选择性扩增操作的引物。
“扩增(Amplifying)”或“扩增(Amplification)”，通常指靶核酸“指数式”增加，在本文中用于描述所选择的靶核酸序列数量的线性和指数式增加。
“基本上结合”指在寡核苷酸与靶序列之间的互补杂交，并包含较少的错配，通过减少杂交介质的严格程度可适用于获得PCR聚合酶所需引物或检测杂交信号。
“杂交”指两条单链核酸通过互补碱基配对结合。
“核酸”指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，除非另有限定，可包含公知的与天然存在的核苷酸以类似方式起作用的天然核苷酸类似物。
“核苷酸聚合酶”指能催化从核苷三磷酸前体合成DNA或RNA的酶。在扩增反应中，所述聚合酶是模板依赖性的，通常添加核苷酸至聚合酶所用模板的3’-末端。所述聚合酶如美国专利号4,889,818和5,079,352所述，是热稳定的。
术语“寡核苷酸”指一种包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，例如引物、探针、可被检测的核酸片段和核酸对照物。寡核苷酸确切的大小取决于许多因素和所述寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可通过任何合适的方法制备，包括，例如，适当序列的克隆和限制性酶切，以及直接化学合成，使用诸如Narang等.，Meth.Enzymol.1979，6890-99的磷酸三酯法、Brown等，Meth.Enzymol.，1979，68109-151的磷酸二酯法、Beaucage等.，Tetrahedron Lett.，1981，221859-1862的二乙基磷酰胺酸法和美国专利号4,458,066的固相载体法。
术语“引物”指一种寡核苷酸，无论是天然的或合成的，在其中引物延伸与所引发反应的核酸链互补的产物的合成条件下，即在四种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在适当的缓冲液中和在合适的温度下，都能作为开始DNA合成的起点。优选地，引物是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于所述引物预期的用途，但通常在约14或约15至25或30个核苷酸范围内。短的引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物无需表现为模板的确切序列，但应当与模板具足够的杂交互补性。
术语“引物”可指超过一种的引物，特别是在其中一些关于要被扩增的靶区域的一个或两个末端的信息不明确的情况下。举例来说，如果区域显示了显著水平的总体多态性，可制备引物的混合物以扩增可选择的序列。如果需要的话，引物可得到标记，掺入通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的标记。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(一般用于ELISA)、生物素或半抗原和抗血清或单克隆抗体可利用的蛋白质。标记也可用于“捕获”引物，更易于引物或诸如扩增的DNA的引物延伸产物在固相支持物上的固定。
“探针”指一种通过互补碱基配对与靶核酸的子序列结合的寡核苷酸。本领域技术人员应当理解探针一般基本上与靶序列结合，依据杂交条件的严格程度，所述靶序列缺乏与所述探针序列的完全互补性。所述探针优选直接用同位素标记或用诸如生物素间接标记，随后抗生物素蛋白链菌素复合物可结合该生物素，通过检验探针的存在或不存在可检测所述靶存在或不存在。
“子序列”指一种包含更长核酸序列一部分的核酸序列。
术语“靶区”指要被分析的核酸的一段区域，可包括多态性区域。
除非另有指明外，本文中使用的术语烷基指通常为1-10个碳原子的饱和直链、支链或环状、伯、仲或叔烃，具体而言包括甲基、CF3、CCl3、CFCl2、CF2Cl、乙基、CH2CF3、CF2CF3、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。该术语包括取代的和未取代的烷基，具体而言包括卤代烷基，更具体而言是氟化烷基。可用于取代烷基的部分选自卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，或者为未保护的，或者是根据需要进行保护的，为本领域技术人员所公知，例如，为Greene，等，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991所教导的，在此并入作为参考。
除非另有指明外，本文中使用的术语低级烷基指1-4个碳原子的饱和直链、支链，或如果合适的话，为环状(如，环丙基)烷基，包括取代的和未取代的两种情况。除非在本申请中另有指明，当烷基是合适部分时，低级烷基是优选的。同样地，当烷基或低级烷基是合适部分时，未取代的烷基或低级烷基是优选的。
术语烷基氨基或芳基氨基指分别具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基基团。
除非另有规定，本文中使用的术语“保护的”指在氧、氮或磷原子上添加的基团，以阻止其进一步反应或为其它目的。有机合成领域的技术人员已知多种氧和氮保护基团。
除非另有指明，本文中使用的术语芳基指苯基、联苯基或萘基，优选苯基。该术语包括取代的和未取代的两种情况。所述芳基可为一种或多种部分所取代，所述部分选自卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，或者是未保护的，或者根据需要进行保护的，为本领域技术人员所公知，例如，为Greene，等，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991所教导的，在此并入作为参考。
术语烷芳基或烷基芳基指具有一个芳基取代基的烷基。术语芳烷基或芳基烷基指具有一个烷基取代基的芳基。
本文中使用的术语卤代，包括氯、溴、碘和氟。
术语碱基指任何嘌呤或嘧啶碱基，包括但不限于，鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氯代嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤(其中酰基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基))、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔型嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟代胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮杂嘧啶，包括6-氮杂胞嘧啶、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶，包括5-氟代尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-苄基嘧啶、C5-卤代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔型嘧啶、C5-酰基嘧啶、C5-羟基烷基嘌呤、C5-酰氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基，碱基分子式
其中G和L各自独立地是CH或N；D是N、CH、C-CN、C-NO2、C-C1-3烷基、C-NHCONH2、C-CONQ11Q11、C-CSNQ11Q11、CCOOQ11、C-C(＝NH)NH2、C-羟基、C-C1-3烷氧基、C-氨基、C-C1-4烷基-氨基、C-二(C1-4烷基)氨基、C-卤素、C-(1，3-噁唑-2-基)、C-(1，3-噻唑-2-基)或C-(咪唑-2-基)；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；E是N或CQ5；W是O、S或NR；R是H、OH、烷基；Q6是H、OH、SH、NH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基或CF3；Q5是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-4烷基氨基、CF3、卤素、N、CN、NO2、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、卤素、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；Q7和Q14各自独立地选自H、CF3、OH、SH、OR、SR C1-4烷基、氨基、C1-4烷基氨基、C3-6环烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；Q11独立地是H或C1-6烷基；Q8是H、卤素、CN、羧基、C1-4烷氧基羰基、N3、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基、NH2、CN、NO2、C1-3烷基、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基，其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；碱基分子式 其中T1和T2独立地选自N、CH或C-Q16；Q16、U和Y独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；R4和R5独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；Z是S、SO、SO2、C＝O或NQ20；Q20是H或烷基；和V1和V2独立地选自CH或N；碱基分子式 其中T3和T4独立地选自N或CQ22；Q22独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；T5是NH；
R4和R5，独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12独立地选自N或CH；U2是H、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5；Y2是O、S、NH、NR或CQ24Q26，其中R是H、OH或烷基；Q24和Q26独立地选自H、烷基、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5。
更多的嘌呤碱基实例包括但不限于，鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氯嘌呤和6-N-甲氨基嘌呤。在必要或所需时，碱基上的氧和氮官能团可得到保护。合适的保护基团为本领域技术人员众所周知，包括三甲代甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、烷基和酰基、例如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基和对-甲苯磺酰基。
术语酰基或O-连接的酯指具有式C(O)R’的基团，其中R’是直链、支链、或环烷基(包括低级烷基)、氨基酸、芳基包括苯基、烷芳基、芳烷基包括苄基、烷氧基烷基包括甲氧基甲基、诸如苯氧基甲基的芳氧基烷基；或取代的烷基(包括低级烷基)、芳基包括任选地为氯、溴、氟、碘、C1至C4烷基或C1至C4烷氧基所取代的苯基、诸如烷基或芳烷基磺酰基的磺酸酯，包括甲磺酰基、单、二或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基-三苯甲基、取代的苄基、烷芳基、芳烷基包括苄基、烷氧基烷基包括甲氧基甲基、诸如苯氧基甲基的芳氧基烷基。所述酯中的芳基优选包含苯基。具体而言，酰基包括乙酰基、三氟代乙酰基、甲基乙酰基、环丙基乙酰基、丙酰基、丁酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、新-庚酰基、苯乙酰基、2-乙酸基-2-苯乙酰基、二苯乙酰基、α-甲氧基-α-三氟甲基-苯乙酰基、溴代乙酰基、2-硝基-苯乙酰基、4-氯-苯乙酰基、2-氯-2，2-二苯乙酰基、2-氯-2-苯乙酰基、三甲基乙酰基、氯二氟代乙酰基、全氟代乙酰基、氟代乙酰基、溴二氟代乙酰基、甲氧基乙酰基、2-噻吩乙酰基、氯磺酰基乙酰基、3-甲氧基苯乙酰基、苯氧基乙酰基、叔-丁基乙酰基、三氯代乙酰基、单氯-乙酰基、二氯代乙酰基、7H-十二氟-庚酰基、全氟-庚酰基、7H-十二-氟代庚酰基、7-氯十二氟-庚酰基、7-氯-十二氟-庚酰基、7H-十二氟代庚酰基、7H-十二-氟代庚酰基、壬-氟-3，6-二噁-庚酰基、壬氟-3，6-二噁庚酰基、全氟代庚酰基、甲氧基苯甲酰基、甲基3-氨基-5-苯基噻吩-2-羧基、3，6-二氯-2-甲氧基-苯甲酰基、4-(1，1，2，2-四氟-乙氧基)-苯甲酰基、2-溴-丙酰基、ω-氨基辛酰基、癸酰基、正-五癸酰基、硬脂酰基、3-环戊基-丙酰基、1-苯-羧基、O-乙酰基扁桃酰基、新戊酰基乙酰基、1-金刚烷-羧基、环己烷-羧基、2，6-吡啶二羧基、环丙烷-羧基、环丁烷-羧基、全氟代环己基羧基、4-甲基苯甲酰基、氯甲基异噁唑基羰基、全氟代环己基羧基、巴豆酰基、1-甲基-1H-吲唑-3-羰基、2-丙烯基、异戊酰基、1-吡咯烷羰基、4-苯基苯甲酰基。
本文中使用的术语“基本上不含有”或“基本上不存在”指核苷组合物包括至少95％-98％重量，甚至更优选99％-100％重量的所述核苷指定的对映体。在一个优选的实施方案中，本发明的方法和化合物中，所述化合物基本上不含有对映体。
同样地，术语“分离的”指核苷组合物包括至少95％-98％重量，甚至更优选99％-100％重量所述核苷，剩余物包含其他化学物质或对映体。
本文中使用的术语“宿主“指病毒在其中可复制的单细胞或多细胞生物体，包括细胞系和动物，优选人。或者，所述宿主可携带一部分黄病毒基因组，其复制或功能可为本发明的化合物所改变。术语宿主具体指感染的细胞、用黄病毒基因组的全部或一部分转染的细胞，动物，具体而言，灵长类(包括黑猩猩)和人。在大多数动物中应用本发明时，所述宿主是人类患者。然而，在某些适应症中，可明确预计本发明能用于牲畜医疗应用(如用于黑猩猩)。
II.2’-支链核苷及其前体药物在更多的实施方案中，本发明提供了一种治疗具有2’-支链核苷抗性的黄病毒感染的方法。在一个实施方案中，所述2’-支链核苷是嘌呤或诸如吡咯并-嘌呤的嘌呤衍生物。在一个优选的实施方案中，所述2’-支链核苷是嘧啶。其它的分实施方案包括2’-烷基和2’-甲基-支链嘧啶核苷，包括2’-支链尿嘧啶和2’-支链胞嘧啶核苷。在另一个实施方案中，所述2’-支链核苷是嘌呤。其它的分实施方案包括2’-烷基和2’-甲基-支链嘌呤核苷，包括2’-支链腺苷核苷和2’-支链6-N-甲氨基嘌呤核苷。
在一个具体的实施方案中，所述2’-支链嘧啶核苷是β-D-2’-CH3-核糖C化合物，其具有分子式 其中R3是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R3是H或磷酸根的化合物。
在另一个具体的实施方案中，所述2’-支链嘌呤核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤化合物，其是分子式 其中R3是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R3是H或磷酸根的化合物。
在本发明的一个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2；和碱基(Base)是如本文所进一步描述的嘌呤或嘧啶。
在本发明的另一个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中碱基(Base)是本文所定义的嘌呤或嘧啶碱基。
R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根)；直链、支链或环烷基(包括低级烷基)；酰基(包括低级酰基)；CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；R6是烷基(包括低级烷基和卤代烷基)、CH3、CF3、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、2-Br-乙基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、CF3、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；和R7是氢、OR3、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；和X是O、S、SO2或CH2。
和碱基(Base)是如本文所进一步描述的嘌呤或嘧啶。
在本发明另一个实施方案中，所述2’-支链核苷是分子式 其中碱基(Base)是如本文所定义的嘌呤或嘧啶碱基；
R6是烷基(包括低级烷基和卤代烷基)、CH3、CF3、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、2-Br-乙基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、CF3、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R7是OR2、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、卤代-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氟、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R9是氢、OR3、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2、-N(酰基)2；R10是H、烷基(包括低级烷基)、氟、氯、溴或碘；R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根)；直链、支链或环烷基(包括低级烷基)；酰基(包括低级酰基)；CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和X是O、S、SO2或CH2。
2’-支链核苷的常规合成1.用适当改性的糖糖基化核碱基该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H的合适取代的糖，具有合适的离去基团(LG)，例如酰基或氯、溴、氟或碘。所述糖可以购买获得，也可以通过任何公知的方法，包括标准差向异构、取代、氧化和还原技术制备。然后，在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该取代的糖进行氧化，得到2’-改性的糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VD氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
接着使有机金属碳亲核试剂，例如格氏(Grignard)试剂、有机锂、二烷基铜锂或在TBAF中的R4-SiMe3(其中R4定义如下)，与所述酮在合适的非质子溶剂中、在合适的温度下偶合，产生2′-烷基化糖。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic SYnthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选用酰基或甲硅烷基对烷基化的糖进行保护。
随后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在TownsendChemistry ofNucleosides and Nucleotides.Plenum Press，1994中教导的那样，使任选地保护的糖偶合在碱基(BASE)上。例如，在合适的溶剂中，在合适的温度下，采用路易斯酸，例如四氯化锡、四氯化钛或三氟甲磺酸三甲硅酯，使酰化的糖偶合在甲硅烷基化的碱基上。或者，在三氟甲磺酸三甲硅酯存在下，使卤代糖偶合在甲硅烷基化的碱基上。
随后，根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对核苷进行脱保护。
在一个具体实施方案中，2’-C-支链核糖核苷是所需的。流程1展示了核糖核苷的合成方法。或者，可使用脱氧核糖核苷。为获得这些核苷，可根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对形成的核糖核苷进行任选地保护，然后用适当的还原剂还原2’-OH。任选地，对所述2’-羟基进行活化以帮助其还原；即通过Barton还原反应。
流程1
其中LG是离去基团；R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2。
2.预形成的核苷的改性该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H合适取代的核苷。所述核苷可以购买获得，也可以通过任何公知方法，包括标准偶合技术制备。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在在Greene等.Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选地用酰基或甲硅烷基对该核苷进行保护。
随后在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该适当保护的核苷进行氧化，得到2’-改性的糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VI)氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
随后，根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对核苷进行脱保护。
在一个具体实施方案中，2’-C-支链核糖核苷是所需的。流程2展示了核糖核苷的合成方法。或者，可使用脱氧核糖核苷。为获得这些核苷，可根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对形成的核糖核苷进行任选地保护，然后用合适的还原剂还原2’-OH。任选地，对所述2’-羟基进行活化以帮助其还原；即通过Barton还原反应。
流程2
其中R1和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2。
2’-支链嘧啶核苷的常规合成1.用适当改性的糖糖基化嘧啶一种制备2’-支链嘧啶核苷的代表性常规方法概述于流程3中。该流程举例说明了以β-D-核糖构型存在的2’支链嘧啶核苷。或者，本领域技术人员可修改该常规流程以产生2’-(3-β-嘧啶核苷)。该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H的合适取代的糖，具有合适的离去基团(LG)，例如酰基或氯、溴、氟或碘。所述糖可以购买获得，也可以通过任何公知的方法，包括标准差向异构、取代、氧化和还原技术制备。然后，在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该取代的糖进行氧化，得到2’-改性的糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VI)氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
接着使有机金属碳亲核试剂，例如格氏(Grignard)试剂、有机锂、二烷基铜锂或在TBAF中的R4-SiMe3，与所述酮在合适的非质子溶剂中、在合适的温度下偶合，产生2’-烷基化糖。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选用酰基或甲硅烷基对烷基化的糖进行保护。
随后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在TownsendChemistry ofNucleosides and Nucleotides.Plenum Press，1994中教导的那样，使任选地保护的糖偶合在嘧啶碱基上。例如，在合适的溶剂中，在合适的温度下，采用路易斯酸，例如四氯化锡、四氯化钛或三氟甲磺酸三甲硅酯，使酰化的糖偶合在甲硅烷基化的嘧啶上，例如胞嘧啶。或者，在三氟甲磺酸三甲硅酯存在下，使卤代糖偶合在甲硅烷基化的嘧啶上，例如胞嘧啶。
流程3
其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2。
2.预形成的2’-支链嘧啶核苷的改性该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H合适取代的2’-支链嘧啶核苷。所述2’-支链嘧啶核苷可以购买获得，也可以通过任何公知方法，包括标准偶合技术制备。根据本领域技术人员众所周知的方法，如在在Greene等.ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选地用酰基或甲硅烷基对该2’-支链嘧啶核苷进行保护。
随后在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该适当保护的2’-支链嘧啶核苷进行氧化，得到2’-改性的糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VI)氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
随后，根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对2’-支链嘧啶核苷进行脱保护。
在一个具体实施方案中，2’-C-支链核糖核苷是所需的。流程4显示了核糖核苷的合成方法。或者，可使用脱氧核糖核苷。为获得这些核苷，可根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对形成的核糖核苷进行任选地保护，然后用合适的还原剂还原2’-OH。任选地，对所述2’-羟基进行活化以帮助其还原；即通过Barton还原反应。
流程4 其中
R1和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2。
2’-支链嘌呤核苷的常规合成1.用适当改性的糖糖基化嘌呤一种制备2’-支链嘌呤核苷的代表性常规方法概述于如下流程5中。该流程举例说明了以β-D-核糖构型存在的2’支链嘌呤核苷的合成。或者，本领域技术人员可充分理解使用合适的起始原料能制备β-L-核糖构型。所述起始原料是3，5-双保护的烷基呋喃糖苷，例如结构式(i)的甲基呋喃糖苷。接着用合适的氧化剂，例如三氧化铬或铬酸盐试剂或Dess-Mart试剂(Dess-Mart periodinane)氧化C-2羟基基团，或通过Swern氧化作用，以提供结构式(ii)的C-2酮。添加格氏(Grignard)试剂，例如烷基、链烯基或炔基卤化镁(例如，甲基溴化镁(MeMgBr)、乙基溴化镁(EtMgBr)、乙烯基溴化镁、烯丙基溴化镁和乙炔基溴化镁)或烷基、链烯基或炔基锂化物，例如甲基锂(MeLi)，在诸如四氢呋喃、二乙醚等的合适的有机溶剂中接触(ii)的羰基双键，提供了结构式(iii)的C-2叔醇。紧接着通过用在诸如溴化氢乙酸溶液的合适的有机溶剂中的卤化氢处理结构式(iii)的呋喃糖苷，将一种合适的离去基团(例如F、Cl、Br和I)导入呋喃糖衍生物的C-1(anorneric)位，以提供中间呋喃基卤化物(iv)。一种C-磺酸酯，例如甲磺酸酯(MeSO2O-)、三氟甲磺酸酯(CF3SO2O-)或对甲苯磺酸酯(-Ots)，在后继反应中也可作为有用的离去基团以产生糖苷(核苷)键。通过用诸如适当取代的4-卤-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶的适当取代的1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(v)的金属盐(例如锂、钠或钾)处理结构式(iv)的中间体形成了核苷键，所述金属盐可通过用在诸如乙腈、四氢呋喃、1-甲基-2-吡咯烷酮或N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)的合适的无水有机溶剂中的碱金属氢化物(例如氢化钠)、碱金属氢氧化物(例如氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钾)或碱金属六甲基二硅叠氮化物(hexamethyldisilazide)(例如NaHMDS)原位处理而产生。通过在两相系统(固-液或液-液)中使用诸如TDA-1或三乙基苄基氯化铵的相转移催化剂，取代反应可得到催化。接着在确定了诸如那些描述于T.W.Greene′和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis，”P编辑.，John Wiley & Sons，1999的脱保护方法后，裂解结构式(vi)的保护的核苷中的任选的保护基团。通过用诸如酒精氨或液态氨的合适的胺处理4-卤代中间体(vi)而实现在吡咯并[2，3-d]嘧啶核的4-位氨基基团任选的导入，以产生在C-4位(-NH2)的伯胺，烷基胺的导入以产生仲胺(-NHR)，或二烷基胺的导入以产生叔胺(-NRR′)。通过用诸如含水的氢氧化钠的含水碱水解(vi)而得到7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)酮化合物。1-6的醇解(例如甲醇分解)提供了C-4醇盐(-OR)，反之用烷基硫醇盐处理则提供了C-4硫代烷基(-SR)衍生物。为获得本发明所需的化合物，有机/药物化学领域的普通技术人员众所周知的后继化学处理可能是需要的。
流程5
其中P1和P2独立地是保护基团；或者，P1和P2可会合形成环状保护基团；R5和R6独立地是烷基基团；M是Li、Na或K；X1和X2独立地是F、Cl、Br或I；R7、R8和R9独立地是氢，、羟基、卤素、烷氧基、氨基、烷基氨基或烷基。
β-D-2’-CH3-核糖C的合成
β-D-2’-CH3-核糖C如下提供的合成是获得化合物β-D-2’-CH3-核糖C的非限制性步骤。本领域的技术人员可以任何公知的方式修改该合成以获得化合物β-D-2’-CH3-核糖C。
1.用适当改性的糖糖基化核碱基该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H的合适取代的糖，具有合适的离去基团(LG)，例如酰基或氯、溴、氟或碘。所述糖可以购买获得，也可以通过任何公知的方法，包括标准差向异构、取代、氧化和还原技术制备。然后，在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该取代的糖进行氧化，得到2’-改性的糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VI)氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
接着使有机金属碳亲核试剂，例如格氏(Grignard)试剂、有机锂、二烷基铜锂或在TBAF中的CH3-SiMe3，与所述酮在合适的非质子溶剂中、在合适的温度下偶合，产生2′-甲基糖。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选用酰基或甲硅烷基对甲基化的糖进行保护。
随后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在TownsendChemistry ofNucleosides and Nucleotides.Plenum Press，1994中教导的那样，使任选地保护的糖偶合在碱基(BASE)上。例如，在合适的溶剂中，在合适的温度下，采用路易斯酸，例如四氯化锡、四氯化钛或三氟甲磺酸三甲硅酯，使酰化的糖偶合在甲硅烷基化的碱基上。或者，在三氟甲磺酸三甲硅酯存在下，使卤代糖偶合在甲硅烷基化的碱基上。
随后，根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对2’一甲基-核苷进行脱保护。
2’-甲基-核苷的合成示于流程6中。
流程6 其中LG是离去基团；和R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物。
2.预形成的2’-甲基核苷的改性该方法的关键起始原料为具有2’-OH和2’-H的合适取代的2’-甲基-胞嘧啶核苷。所述核苷可以购买获得，也可以通过任何公知方法，包括标准偶合技术制备。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.Protective Groupsin Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，任选地用合适的保护基团，优选地用酰基或甲硅烷基对该核苷进行保护。
随后在合适的温度下，在可相容的溶剂中，采用合适的氧化剂对该适当保护的2’-甲基-胞嘧啶核苷进行氧化，得到2’-甲基糖。可能的氧化剂是琼斯(Jones)试剂(铬酸和硫酸的混合物)、科林氏(Collins’s)试剂(二吡啶Cr(VI)氧化物)、Corey氏试剂(氯代铬酸吡啶鎓)、重铬酸吡啶鎓、酸式重铬酸盐(acid dichromate)、高锰酸钾、MnO2、四氧化钌、诸如铬酸或聚合物负载的高锰酸的相转移催化剂、Cl2-吡啶、H2O2-钼酸铵、NaBrO2-CAN、NaOCl的HOAc溶液、亚铬酸铜、氧化铜、阮内(Raney)镍、乙酸钯、米尔文-庞道夫-沃莱(Meerwin-Pondorf-Verley)试剂(叔丁醇铝和另一种酮)和N-溴代琥珀酰亚胺。
随后，根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导的那样，对核苷进行脱保护。
2’-甲基-胞嘧啶核苷的合成示于流程7中。
流程7
其中R1和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1或R3独立地是H或磷酸根的化合物。
药学上可接受的前体药物在说明书全文中使用的术语“药学上可接受的前体药物和/或盐”描述了核苷化合物的任何药学上可接受的形式(例如酯、磷酸酯、酯或相关基团的盐)，其在给予患者的条件下，提供了所述的母体核苷化合物。药学上可接受的盐包括那些衍生自药学上可接受的无机或有机碱和酸的盐。合适的盐包括那些衍生自在制药领域中众所周知的众多其它酸中的诸如钾和钠的碱金属、诸如钙和镁的碱土金属的盐。药学上可接受的前体药物指在宿主体中得到代谢如水解或氧化以形成本发明化合物的化合物。前体药物的一般实例包括在活性化合物的官能团部分具有生物学不稳定保护基团的化合物。前体药物包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基、酰化、脱酰基、磷酸化、脱磷酸而产生活性化合物的化合物。本发明的化合物具有抗黄病毒的抗病毒活性，或得到代谢以产生具有该活性的化合物。
2’-支链核苷，包括2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或相关的化合物以酰化或核苷前体药物的形式给予，可用于联合或交替疗法中。
任一本文所述的核苷或其它含有羟基或胺官能的化合物可以核苷前体药物的形式给予以增加所述核苷的活性、生物利用度、稳定性或以其它方式改变所述核苷的特性。许多核苷前体药物配体是公知的。一般来说，所述化合物或所述核苷单、二或三磷酸根羟基的烷化、酰化或其它亲脂性修饰可增加核苷的稳定性。可在磷酸根部分或羟基上置换一个或多个氢的取代基团的实例是烷基、芳基、类固醇、碳水化合物，包括糖类、1，2-二酰甘油和乙醇。许多取代基团描述于R.Jones和N.Bischofberger，Antiviral Research，27(1995)1-17中。任一这些基团可与本文所公开的核苷或其它化合物结合使用以获得所需效果。
所述活性核苷或其它含有羟基的化合物也可以醚脂形式(具体而言是核苷的5’-醚脂形式)提供，公开于如下参考文献中Kucera，L S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.，和C.Piantadosi.1990.“Novelmembrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production andinduce defective virusformation.”AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F.Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，和E.J.Modest.1991.“Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates foranti-HIV activity.”J Med.Chem.341408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk和H.van den Bosch.1992.“Greatlyenhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM andHT4-6C cells by 3′-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol，a lipid produrgof 3，-deoxythymidine.”Antimicrob.Agents Chemother.362025.2029；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van den Bosch，和D.D.Richman，1990.“Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine andother antiviral nucleosides.”J.Biol.Chem.26561127。公开了可共价掺入核苷或其它含有羟基或胺的化合物，优选在核苷或亲脂性制备物的5’-OH位的合适的亲脂性取代基的美国专利的非限制性实例包括美国专利号5,149,794(1992年9月22日，Yatvin等)；5,194,654(1993年3月16日，Hostetler等)；5,223,263(1993年6月29日，Hostetler等)；5,256,641(1993年10月26日，Yatvin等)；5,411,947(1995年5月2日，Hostetler等)；5,463,092(1995年10月31日，Hostetler等)；5,543,389(1996年8月6日，Yatvin等)；5,543,390(1996年8月6日，Yatvin等)；5,543,391(1996年8月6日，Yatvin等)；和5,554,728(1996年9月10日，Basava等)，所有内容在此并入作为参考。公开了可与本发明的核苷连接的亲脂性取代基或亲脂性制备物的外国专利申请包括WO 89/02733、WO90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO 93/00910、WO 94/26273、WO96/15132、EP 0350 287、EP 93917054.4和WO 91/19721。
2’-支链β-D核苷的2’，3’和5’-前体药物，或含有这些化合物的它们的药学上可接受的盐或药学上可接受的制剂可用于治疗黄病毒感染。具体来说，表示为分子式 的β-D-2’-CH3-核糖C的3’-缬氨酸酯前体药物或其药学上可接受的盐，可给予受试者用于治疗黄病毒感染。
在一个实施方案中，2’-支链β-D核苷2’-前体药物包括在2’和/或5’位的生物学可裂解部分。优选的部分是天然或合成的D或L氨基酸酯，包括D或L-缬氨酰，但是优选地是L-氨基酸酯，例如L-缬氨酰，和烷基酯包括乙酰基。因此，本发明具体地包括具有任意所需的嘌呤或嘧啶碱基的2’-支链β-D或β-L核苷的2’-D或L-氨基酸酯和2’，5’-D或L-二氨基酸酯，优选L-氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于15微摩的EC50，以及更优选小于10微摩；具有任意所需的嘌呤或嘧啶碱基的2’-支链β-D或β-L核苷的2’-(烷基或芳基)酯或2’，5’-二(烷基或芳基)酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50；以及2’-支链β-D或β-L核苷的2’，5’-二酯的前体药物，其中(i)所述2’酯是天然或合成的D或L-氨基酸酯，但是优选L-氨基酸酯，以及所述5’-酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯独立地是天然或合成的D或L-氨基酸酯，但是优选两种都是L-氨基酸酯；(iii)两种酯独立地是烷基或芳基酯；和(iv)所述2’酯独立地是烷基或芳基酯和所述5’-酯是天然或合成的D或L-氨基酸酯，但是优选L-氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50。
落入本发明前体药物的实例是β-D-2’-甲基-胞苷的2’-D或L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟胞苷的2’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的2’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的2’-乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’-乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’-乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’-乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’-乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟胞苷、尿苷或胸苷)的2’-酯类，或β-D-2’-甲基-胞苷或β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的2’-酯类，其中(i)所述2’酯是氨基酸酯；或(ii)所述2’酯是烷基或芳基酯。
落入本发明前体药物的额外实例是β-D-2’-甲基胞苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷(dival-2’，6-diMe-L-dC)；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的2’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的2’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，5’-二乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟-胞苷、尿苷或胸苷)的2’，5’-二酯类，或β-D-2’-甲基胞苷或β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的2’，5’-二酯类，其中(i)所述2’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯类都是氨基酸酯；(iii)两种酯类独立地是烷基或芳基酯；或(iv)所述2’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯。
在另一个实施方案中，所述2’-支链β-D核苷3’-前体药物包括在3’和/或5’位生物学可裂解部分。优选的部分是天然或合成的D或L氨基酸酯，例如缬氨酰，但是优选L-氨基酸，例如L-缬氨酰，和烷基酯包括乙酰基。因此，本发明具体包括具有任何所需嘌呤或嘧啶碱基的2’-支链β-D或β-L核苷的3’-L-氨基酸酯和3’，5’-L-二氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于15微摩的EC50，以及更优选小于10微摩；具有任意所需的嘌呤或嘧啶碱基的2’-支链β-D或β-L核苷的3’-(烷基或芳基)酯或3’，5’-L-二(烷基或芳基)酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50；以及2’-支链β-D或β-L核苷的3’，5’-二酯的前体药物，其中(i)所述3’酯是天然或合成的D或L-氨基酸酯，以及所述5’-酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯都是天然或合成的D或L-氨基酸酯；(iii)两种酯独立地是烷基或芳基酯；和(iv)所述3’酯独立地是烷基或芳基酯和所述5’-酯是天然或合成的D或L-氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50。
落入本发明前体药物的实例是β-D-2’-甲基-胞苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟胞苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的3’-L-缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的3’-乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的3’-乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的3’-乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的3’-乙酰酯；β-D-2’-甲基-胞苷的3’-乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的3’-乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟胞苷、尿苷或胸苷)的3’-酯类，或β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的3’-酯类，其中(i)所述3’酯是氨基酸酯；或(ii)所述3’酯是烷基或芳基酯。
落入本发明前体药物的额外实例是β-D-2’-甲基胞苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷(dival-2’，6-diMe-L-dC)；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的3’，5’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的3’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的3’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的3’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的3’，5’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的3’，5’-二乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟-胞苷、或β-D-2’-甲基-胞苷、尿苷或胸苷)的3’，5’-二酯类，或β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的3’，5’-二酯类，其中(i)所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯类都是氨基酸酯；(iii)两种酯类独立地是烷基或芳基酯；或(iv)所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯。
在另一个实施方案中，所述2’-支链β-D核苷前体药物包括在2’，3’和/或5’位生物学可裂解部分。优选的部分是天然或合成的D或L氨基酸酯，包括D或L-缬氨酰，但是优选L-氨基酸酯，例如L-缬氨酰，和烷基酯包括乙酰基。因此，本发明具体包括2’-支链β-D或β-L核苷的2’，3’-L或D-二氨基酸酯和2’，3’，5’-L或D-三氨基酸酯，优选L-氨基酸，具有任意所需的嘌呤或嘧啶碱基，其中所述母体药物任选地具有小于15微摩的EC50，以及更优选小于10微摩；具有任意所需的嘌呤或嘧啶碱基的2’-支链β-D或β-L核苷的2’，3’-二(烷基或芳基)酯或2’，3’，5’-三(烷基或芳基)酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50；以及2’-支链β-D或β-L核苷的2’，3’-二酯的前体药物，其中(i)所述2’酯是氨基酸酯和所述3’酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯都是氨基酸酯；(iii)两种酯独立地是烷基或芳基酯；和(iv)所述2’酯独立地是烷基或芳基酯和所述3’-酯是氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50。此外，2’-支链β-D或β-L核苷的2’，3’，5’-三酯，其中(i)所有三种酯类都是氨基酸酯；(ii)所有三种酯类独立地是烷基或芳基酯；(iii)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(iv)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(v)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯；(vi)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是氨基酸酯；(vii)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；和(viii)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯，其中所述母体药物任选地具有小于10或15微摩的EC50。
落入本发明前体药物的实例包括β-D-2’-甲基-胞苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷(dival-2’，6-diMe-L-dC)；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的2’，3’-L-二缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的2’，3’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，3’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，3’-二乙酰酯；β-D-2’-甲基-胞苷的2’，3’-二乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，3’-二乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，3’-二乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟胞苷、尿苷或胸苷)的2’，3’-二酯类，或β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的2’，3’-二酯类，其中(i)所述2’酯是氨基酸酯和所述3’-酯是烷基或芳基酯；(ii)两种酯类是氨基酸酯；(iii)两种酯类独立地是烷基或芳基酯；或(iv)所述2’酯是烷基或芳基酯和所述3’-酯是氨基酸酯。
落入本发明前体药物的额外实例包括β-D-2’-甲基-胞苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷(trival-2’，6-diMe-L-dC)；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-尿苷的2’，3’，5’-L-三缬氨酸酯；β-D-2’，6-二甲基-胞苷的2’，3’，5’-三乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-胸苷的2’，3’，5’-三乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-腺苷的2’，3’，5’-三乙酰酯；β-D-2’，8-二甲基-鸟苷的2’，3’，5’-三乙酰酯；β-D-2’，6-二甲基-5-氟-胞苷的2’，3’，5’-三乙酰酯；和β-D-2’，6-二甲基-(胞苷、5-氟胞苷、尿苷或胸苷)的2’，3’，5’-三酯类，和β-D-2’，8-二甲基-(鸟苷、腺苷或肌苷)的2’，3’，5’-三酯类，其中(i)所有三种酯类都是氨基酸酯；(ii)所有三种酯类独立地是烷基或芳基酯；(iii)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(iv)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；(v)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯；(vi)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是氨基酸酯；(vii)所述2’酯是烷基或芳基酯，所述3’酯是氨基酸酯和所述5’-酯是烷基或芳基酯；和(viii)所述2’酯是氨基酸酯，所述3’酯是烷基或芳基酯和所述5’-酯是氨基酸酯。
落入本发明前体药物的另一个实例包括公开于美国专利号6,284,748和6,312,662的前体药物。具体来说，本发明的前体药物包括具有如下结构式的化合物 其中V、W和W′是独立地选自-H、烷基、芳烷基、脂环族、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、1-链烯基和1-炔基；或通过额外3-5个原子V和Z被连接在一起形成一个含有5-7个原子的环状基团，任选1个杂原子，为连接在一个碳原子上的羟基，酰氧基，烷氧基羰氧基，或芳氧基羰氧基所取代，所述碳原子是连接到磷原子的两个氧原子之间的三个碳原子；或通过额外3-5个原子V和Z被连接在一起形成一个环状基团，任选含有1个杂原子，其稠合到芳基的β和γ位的连接有磷原子的氧上；或通过额外的3个碳原子V和W被连接在一起形成一种任选取代的含有6个碳原子的环状基团和为一种选自羟基、酰氧基、烷氧基羰氧基、烷基硫代羰氧基和芳氧基羰氧基的取代基所取代，该取代基连接到所述碳原子上，所述碳原子是连接到磷原子的氧原子的三个碳原子；通过额外的3-5个原子Z和W被连接在一起形成一种环状基团，任选含有一个杂原子，和V应当是芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；通过额外的2-5个原子W和W′被连接在一起形成一种环状基团，任选含有0-2个杂原子，和V应当是芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；Z选自-CHR2OH、-CHR2OC(O)R3、-CHR2OC(S)R3、-CHR2OC(S)OR3、-CHR2OC(O)SR3、-CHR2OCO2R3、-OR2、-SR2、-CHR2N3、-CH2芳基、-CH(芳基)OH、-CH(CH＝CR22)OH、-CH(C≡CR2)OH、-R2、-NR22、-OCOR3、-OCO2R3、-SCOR3、-SCO2R3、-NHCOR2、-NHCO2R3、-CH2NH芳基、-(CH2)p-OR12，和-(CH2)P-SR12；p是整数2或3；R2选自R.sup.3和-H；R3选自烷基、芳基、脂环族和芳烷基；R12选自-H和低级酰基；M是选自连接到PO32-、P2O63-、或P3O94-的基团，是2’-支链核苷，和通过碳、氧、硫或氮原子连接到磷原子的基团。
在一个非限制的实例中，所述前体药物是连接到核苷的，为如下化合物
2’和/或3’-前体药物的常规合成该方法的关键起始原料是适当取代的2’-支链β-D核苷。所述支链核苷可以购买获得，也可以通过任何已知的方法，包括本文中公开的技术制备。然后根据本领域技术人员众所周知的方法，如在Greene等.，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991中教导的那样，任选用合适的保护基团、优选地用甲硅烷基对所述支链核苷进行保护。接着在具有合适的质子或非质子溶剂、在合适的温度下，所述被保护的支链核苷可以与合适的酰基供体，例如酰氯和/或酰酐偶合，得到2’-支链β-D核苷的2’和/或3’前体药物。或者，接着在具有合适的非质子溶剂、在合适的温度下，任选用一种合适的偶合剂，所述保护的支链核苷可以与合适的酰基，例如羧酸，例如链烷酸和/或氨基酸残基偶合，得到2’-支链β-D核苷的2’和/或3’前体药物。可能的偶合剂是任何有助于偶合的试剂，包括但不限于，具有三苯基膦或各种碳二亚胺的Mitsunobu试剂(偶氮二甲酸二异丙酯和偶氮二甲酸二乙酯)。
例如，在回流的乙腈-苯混合物中，使用酰基氯可以酯化简单氨基-乙醇(参见如下流程8Synthetic Communications，1978，8(5)，327-333；在此并入作为参考)。或者，如在J Am.Chem.Soc.，1999，121(24)，5661-5664中所描述的，使用一种酐进行酯化。
流程8
III.β-D-2’-CH3-核糖C诱导的黄病毒基因组突变的检测在一个实施方案中，提供了一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)鉴定所述患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性；(iii)将有效量的一种或多种药物，与一种或多种直接或间接诱导黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给药。
在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗HCV感染的患者的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)鉴定所述患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性；(iii)给予有效量的一种或多种药物，所述药物直接或间接诱导黄病毒突变，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中282位的丝氨酸改变为诸如苏氨酸的不同氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗BVDV感染的宿主的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)鉴定所述宿主中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性；(iii)给予有效量的一种或多种药物，所述药物直接或间接诱导黄病毒突变，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中405位的丝氨酸改变为诸如苏氨酸的不同氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；
(ii)鉴定所述患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性；(iii)给予有效量的干扰素。
在某些实施方案中，鉴定患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性可通过病毒噬菌斑生长的表型分析来确定。在另一个实施方案中，鉴定患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性可通过病毒的复制适合度来确定。在另一个实施方案中，鉴定患者中病毒对β-D-2’-CH3-核糖C的抗性可通过检测BVDV的RNA聚合酶区的核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷的存在来确定。
在一个实施方案中，本发明包括了一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)从所述患者处获得病毒样品；(iii)培养所述样品并比较所述样品与野生型病毒之间的噬菌斑生长；(iv)测定是否所述样品的噬菌斑生长小于野生型的噬菌斑生长，其表明具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性；(v)给予那些具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的患者有效量的干扰素。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)从所述患者处获得病毒样品；(iii)测定病毒的复制适合度；(iv)测定是否所述样品中病毒的复制适合度小于野生型病毒的复制适合度，其表明具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性；(v)给予那些具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的患者有效量的干扰素。
在一个实施方案中，通过病毒噬菌斑测定可定量病毒噬菌斑生长和/或病毒复制适合度。在其他实施方案中，诸如感染中心测定、病毒诱导报道子测定、转化分析、终点稀释测定或RT-PCR技术的其他测定法可用于定量病毒滴度(Flint等.Principles of Virology(ASM)Chapter 2；Wagner & Hewlett. Basic Virology(Blackwell)，Chapters 9 & 10)。
可进行噬菌斑测定以定量病毒噬菌斑生长和/或复制适合度。病毒的稀释溶液可加入含有单层宿主细胞的培养皿中。所述细胞可用半固体层(例如粘性培养基，如琼脂)覆盖以防止病毒从一个感染的细胞扩散到另外的细胞。在温育后，可识别所述‘噬菌斑’，并估计在初识悬浮液中传染性病毒颗粒的数量。一种用于识别噬菌斑的方法自始至终使用抗体染色方法以检测单层细胞的感染细胞中的病毒抗原。接着，使用发色团或荧光标记的病毒特异性抗体可使这些感染的细胞显影。对于表型分析和/或计数测定病毒滴度而言，能观察到噬菌斑。病毒滴度可计算，单位为转化灶形成单位(FFU)/mL，使用如下方程式TFFU/mL＝N×5×D；其中T是病毒滴度，单位FFU/mL；N是每孔噬菌斑数量；和D是对于相应的病毒样品的稀释因子。(例如，如果在一个孔中发现12个噬菌斑，相应于10-5倍稀释的病毒样品，则T＝12×5×105＝6×106PFU/M1)，以及病毒复制适合度，在规定的宿主环境中其是产生感染后代的全部复制能力，然后可得到测定。
本发明另一方面是一种用于检测BVDV RNA聚合酶区的核苷酸1214 G至C突变(导致了在氨基酸405处丝氨酸突变为苏氨酸)存在的方法。因为识别的是Ser405，推定的BVDV功能性NS5B结构域B的氨基酸位置，在所有丙型肝炎病毒、瘟病毒和黄病毒基因组中高度保守(图11；Lai等.J Virol.，1999，73，10129-36)，所以其他突变的黄病毒的推定的功能性NS5B结构域B相应的丝氨酸残基可根据本发明的实施方案来检测。例如，BVDV RNA聚合酶结构域的Ser405相应于HCV RNA聚合酶结构域的Ser282。因此，本发明的实施方案也包含了HCV基因组核苷酸8443(其相应于BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214)的G至C的突变。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测指示β-D-2’-CH3-核糖C抗性的突变的方法，其包括将含有黄病毒核酸序列的样品与具有与包括所述突变的黄病毒基因组区段序列互补的寡核苷酸探针接触，以及接着测定是否所述寡核苷酸与病毒核酸杂交。
在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含
(i)给予有效量的β-D-2’-CH3-核糖C或前体药物，例如β-D-2’-CH3-核糖C的3’缬氨酸酯前体药物，或其药学上可接受的盐；(ii)化验所述患者血液以对从野生型到病毒突变体的血清转化进行测试；(iii)给予有效量的干扰素。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于测定怀疑含有β-D-2’-CH3-核糖C抗性黄病毒的样品的方法；包含(i)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV基因组核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(ii)容许所述探针与所述序列杂交；(iii)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV基因组核苷酸8443处的胞苷的杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于测定怀疑在黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中包含Thr而非Ser的样品的方法，其表明病毒对干扰素治疗非常敏感，包含(i)将怀疑含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与在黄病毒RNA聚合酶区结构域B的保守连续序列XRXSGXXXT中的Ser位置上的编码Thr的密码子互补的序列；(ii)容许所述探针与所述序列杂交；(iii)检测所述探针与所述序列的杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于测定怀疑含有Thr，而非BVDVRNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或氨基酸405处的Ser的样品的方法，其表明病毒对干扰素治疗非常敏感，包含(i)将怀疑含有BVDV核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与RNA聚合酶区的核苷酸1214处的胞苷互补的序列；(ii)容许所述探针与所述序列杂交；(iii)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷的杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于测定怀疑含有Thr，而非在高保守的氨基酸282位处RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中的Ser或在HCV基因组的核苷酸8433处的胞苷的样品的方法，其表明病毒对干扰素治疗非常敏感，包含(i)将怀疑含有HCV核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与核苷酸8443处胞苷互补的序列；(ii)容许所述探针与所述序列杂交；(iii)检测所述探针与HCV基因组核苷酸8443处胞苷的杂交。
寡核苷酸探针所提供的寡核苷酸探针能检测2’-支链嘧啶核苷诱导的黄病毒突变的存在。所述探针与包括所述突变的病毒核酸序列互补。这些探针可用于方法和试剂盒中。所述寡核苷酸探针能检测BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处或HCV RNA聚合酶区核苷酸8443处的核苷酸胞苷，或能检测编码黄病毒基因组中RNA聚合酶结构域B的保守丝氨酸(图11)的黄病毒的其它核苷酸。
所述寡核苷酸优选具有至少14个核苷酸长度，在一个优选的实施方案中，具有至少15、20、25或30个核苷酸长度。通常并不优选使用大于约25或30个核苷酸长度的探针。在一个实施方案中，可设计所述寡核苷酸探针以鉴定在BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处鸟嘌呤至胞苷碱基的改变。在另一个实施方案中，可设计所述寡核苷酸探针以鉴定在HCV核苷酸8443处的鸟嘌呤至胞苷碱基的改变。可设计所述寡核苷酸探针使得突变区位于杂交片段的内部区段，或可选地可位于杂交片段的3’或5’末端。优选突变区位于接近探针的中部以容许有效杂交。
如下表2提供了用于说明的包括RNA聚合酶区的核苷酸1214位，或者称为核苷酸11，136位(参见Genebank目录号AJ133739；Vassilev和Donis(2000)Virus Res 69(2)95-107)的BVDV核苷酸序列的实施方案。根据所给出的这些序列，本领域技术人员使用标准算法可构建寡核苷酸探针，所述探针与如下核苷酸序列互补或基本上互补。互补配对的规则众所周知胞嘧啶(“C”)总是与鸟嘌呤(“G”)配对，胸腺嘧啶(“T”)或尿嘧啶(“U”)总是与腺嘌呤(“A”)配对。应当承认探针并不需要与靶核酸序列100％互补，只要所述探针能足够杂交和能识别待诊断的核苷酸。一定程度的碱基配对错配通常能得到容忍。
表2在BVDVRNA聚合酶区的核苷酸1214处(也称为11、136位，参见Genebank目录号AJ133739；Vassilev和DonisVirus Res2000，69(2)95-107)具有单位点突变的核酸序列的非限制性实例
因此，在一个实施方案中，所述寡核苷酸在与黄病毒核苷酸序列互补中具有1、2、3、4、5或6个错配。
本发明的其他方面提供了一种治疗黄病毒感染的方法，通过将治疗有效量的2’-支链核苷，例如2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C，或其药学上可接受的前体药物和/或盐与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为苏氨酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予需要治疗的人。在上述表2中密码子ACA、ACG或ACU，也编码苏氨酸，可为密码子ACC(粗体)所取代以检测BVDV RNA聚合酶区结构域B中苏氨酸的存在。
本发明的另一个方面提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主为黄病毒所感染，所述黄病毒包含在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸至苏氨酸的突变。因此，在本发明的其他实施方案中，在上述表2中密码子ACA、ACG或ACU，也编码苏氨酸，可为密码子ACC(粗体)所取代，例如用于检测BVDV RNA聚合酶区残基405处的苏氨酸的存在。
如下表3提供了用于说明的包括HCV基因组核苷酸8443位(Genebank目录号AJ238799；Lohmann等.(1999)Science 285(5424)110-113)的HCV核苷酸序列的实施方案。HCV基因组的核苷酸8443位相应于BVDV基因组的核苷酸11，136位并表示黄病毒RNA聚合酶的保守的丝氨酸残基(BVDV基因组的Ser405，其相应于HCV基因组的Ser282(参见图11))的突变是由于用β-D-2’-CH3-核糖C治疗所致。如上所述，根据所给出的这些序列，本领域技术人员使用标准算法可构建寡核苷酸探针，所述探针与如下核苷酸序列互补或基本上互补。
表3在HCV RNA聚合酶区的核苷酸8443处(Genebank目录号AJ238799；Lohmann等.(1999)Science285(5424)110-113)包含单位点突变的核酸序列的非限制性实例
因此，在一个实施方案中，所述寡核苷酸在与黄病毒核苷酸序列互补中具有1、2、3、4、5或6个错配。
本发明的其他方面提供了一种治疗黄病毒感染的方法，通过将治疗有效量的2’-支链核苷，例如2’-支链嘧啶核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C，或其药学上可接受的前体药物和/或盐与一种或多种直接或间接诱导黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为苏氨酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予需要治疗的人。如前，在表3中密码子ACA、ACG或ACU，也编码苏氨酸，可为密码子ACC(粗体)所取代，例如由于检测HCV RNA聚合酶区结构域B中苏氨酸的存在。
本发明的另一个方面提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主为黄病毒所感染，所述黄病毒包含在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸至苏氨酸的突变。在表3中密码子ACA、ACG或ACU，也编码苏氨酸，可为密码子ACC(粗体)所取代，如上，例如用于检测HCV RNA聚合酶区残基282处的苏氨酸的存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于扩增黄病毒核酸序列的寡核苷酸引物。在一个实施方案中，所述寡核苷酸具有至少14个核苷酸长度并能在序列特异性、严格杂交条件下与含有所述突变的核苷酸序列杂交。
用作为引物杂交区的寡核苷酸序列也可用作为探针的杂交区。引物序列用作为探针的适用性依赖于该引物的杂交特性。同样地，用作为探针的寡核苷酸可用作为引物。
本领域技术人员应当知道，有这些实施方案所提供，特异性引物和探针可制备自，例如，通过添加核苷酸至5’-或3’-末端，所述核苷酸与靶序列互补或不与靶序列互补。只要引物组合物作为靶序列延伸的起始点，以及只要在那些例证的实施方案中包括的所述引物和探针包含至少14个连续核苷酸，所述的组合物就落在本发明的范围内。
本文中所述探针可通过如下非限制性标准进行选择，其并不认为具独占性或限定性(1)所述探针选自黄病毒基因组含有所述突变的区域；(2)所述探针与预期将损害所述试验的病毒基因组的任一序列缺乏同源性；和(3)所述探针在扩增的核酸中缺乏形成二级结构的能力，例如，通过诸如大肠杆菌DNA聚合酶的扩增酶、诸如称为Klenow片段的所述DNA聚合酶的部分可干扰核酸延伸。防止二级结构形成可通过在扩增介质中使用高达约15％重量，优选5-10％重量的二甲基亚砜(DMSO)和/或提高扩增温度到30°-40℃以达到目的。
此外，所述探针可具有约50％含量的鸟嘌呤和胞嘧啶，在引物的3’-末端可不含有多个连续的腺嘌呤和胸腺嘧啶残基，其能产生较低稳定性的杂交。
本发明的探针可以是约10-30个核苷酸长，优选至少14、15、20、25或30个核苷酸长度。本发明中使用的核苷酸可以是核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸和改性核苷酸，所述改性核苷酸例如肌苷或含有改性基团的基本上不改变它们杂交特性的核苷酸。在说明书全文中探针序列表示为从5’-至3’-末端的单链DNA寡核苷酸。任一上述探针、或其互补形式、或其RNA形式(其中T为U所取代)可用于此。
根据本

发明内容
的探针可制备如下，通过克隆含有包括相应核苷酸序列的插入片段的重组质粒，任选地通过使用适当的核酸酶从所述克隆质粒裂解后者并回收它们，如通过根据分子重量的分级分离。根据本发明内容的探针也可化学合成，例如，通过常规的磷酸三酯或磷酸二酯法或其自动化的实施方案。在一个上述自动化的实施方案中，二乙基亚磷酰胺用作为起始原料并可被合成，如Beaucage等.，Tetrahedron Letters(1981)，221859-1862所述。一种用于在改性的固体载体上合成寡核苷酸的方法描述于美国专利号4,458,066。也有可能使用业已分离自生物学来源的引物(例如限制性核酸内切酶消化产物)。
用作为引物或探针的寡核苷酸也可包含核苷酸类似物，例如磷硫酰(Matsukura等.，1967)、烷基磷硫酰(Miller等.，1979)、肽核酸(Nielsen等.，1991；Nielsen等.，1993)、吗啉代核酸、锁定核酸(locked nucleic acids)、假性环寡核碱基(pseudocyclic oligonucleobases)、2’-O-4’-C-乙烯基桥联核酸或可含有嵌入剂(Asseline等.，1984)。
对于设计具有所需特性的探针而言，可应用如下为本领域技术人员所公知的有用的指导方针。因为杂交反应的程度和特异性受众多因素影响，对一种或多种那些因素的处理可决定特异探针的正确的灵敏性和特异性，无论与其靶序列完全互补与否。进一步解释于本文中的不同测定条件的重要性和影响作用为本领域技术人员所公知。
所述探针与靶核酸杂交的稳定性应当选择与测定条件所相容。可通过避免长的富AT-序列存在、通过用GC碱基对终止杂交和通过设计具有合适Tm的探针而实现之。应当选择所述探针的起点和终点以致所述长度和％GC产生的Tm较所要进行的最终试验的温度高约2-10℃。所述探针的碱基组合物具有特殊意义，因为由于额外的氢键G-C碱基对展示了较A-T碱基对更强的热稳定性。因而，包含更高G-C含量互补核酸的杂交可稳定于更高的温度。当设计探针时，应当考虑在诸如离子强度和温育温度的条件下可被使用的探针。已知当反应混合物离子强度增加时杂交能增加，杂交的热稳定性能随着离子强度的增加而增加。另一方面，诸如甲酰胺、尿素、DIVISO和乙醇的化学试剂，其破坏氢键，可增加杂交的严格性。通过上述能急剧减少Tm的试剂可对氢键脱稳定性。一般而言，对于合成的约10-50个碱基长度的寡核苷酸探针来说，最佳的杂交发生在低于给定的双链体解链温度约5℃的条件下。在低于最佳温度下温育可容许错配的碱基序列杂交并可因此产生减少的特异性。理想的探针应仅在高严格条件下杂交，其中仅高互补性的核酸杂交形成和/或不具足够程度互补性的杂交无法形成。因此，试验条件的严格性决定了形成杂交的两条核酸链之间的所需的互补性程度。选择严格性程度，例如，以最大化与靶和非靶核酸所形成的杂交之间稳定性的差异。在本发明中，需要检测单个碱基配对的改变，其需要非常高的严格条件。
也应考虑靶核酸序列的长度和探针序列的长度。在一些情况下，存在着来自特定区域的几个序列，改变了位置和长度，可产生具有所需杂交特性的探针。在其它情况下，一种序列可明显地好于另一种序列，不同之处仅在于单个碱基。
虽然有可能对于杂交而言核酸无法完全互补，但是最长的完全杂交碱基序列通常可决定杂交的稳定性。尽管可使用不同长度和碱基组合物的寡核苷酸探针，本发明优选的寡核苷酸探针在约14-30个碱基长度，任选地还具有与靶核酸序列完全互补的足够的序列长度。
较不优选已知在靶DNA或RNA内形成对杂交具强内部结构抑制性的区域。在一个实施方案中，应避免使用具有大量自互补的探针。如上所述，杂交是两条互补核酸单链结合形成氢键双链。暗示如果两条链的一条是完全或部分包含杂交，则几乎不可能参与形成新的杂交。如果具有足够的自互补能力，在单个探针分子中可形成分子内和分子间杂交。通过仔细地设计探针可避免上述结构。通过设计探针使得感兴趣序列的实质部分为单链的，可大大增加杂交的速率和程度。计算机程序可用于搜寻这种类型的相互作用。但是，在某些情况下，无法避免这种类型的相互作用。
特异性引物和序列特异性寡核苷酸探针可用于聚合酶链反应中，所述聚合酶链反应能扩增和检测病毒基因组序列。
本发明的一方面涉及特异性寡核苷酸引物。本发明提供了包含用于扩增黄病毒核酸的寡核苷酸引物的组合物，其中所述的引物适合用于从黄病毒突变株中扩增核酸子序列。举例来说，所述引物能检测BVDV RNA聚合酶区的核苷酸1214处G至C的核苷酸改变。在另一个实例中，所述引物能检测HCV基因组的核苷酸8443处G至C的核苷酸改变。
黄病毒突变的扩增和检测本发明的另一个方面涉及用于扩增和检测黄病毒突变存在的方法。
通过多种本领域公知的技术，DNA或RNA可抽提自身体样品，例如血液或组织材料，如肝脏。一种不纯的样品，如取自血浆、血清或血液的样品，在扩增前，可用一定量的试剂处理以有效地打开样品的细胞、液体、组织、病毒衣壳或动物细胞膜，并暴露和/或分离核酸的链。该暴露和分离链的裂解和核酸变性步骤可容许扩增更加容易发生。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测突变的方法，其中怀疑含有黄病毒核酸序列的样品得到扩增；将扩增序列与寡核苷酸探针接触，所述探针具有与所述突变核苷酸序列互补的序列；和通过将探针与所述序列杂交检测所述序列。在一个实施方案中，通过使用聚合酶链反应方法实现扩增。在另一个实施方案中，所述突变是BVDV基因组RNA聚合酶区1214位处G至C的核苷酸改变。在另一个实施方案中，所述突变是HCV基因组8443位处G至C的核苷酸改变。
扩增所使用的扩增方法可以是聚合酶链反应(PCR；Saiki等.，1988)、连接酶链反应(LCR；Landgren等.，1988；Wu和Wallace，1989；Barany，1991)、基于核酸序列的扩增技术(NASBA；Guatelli等.，1990；Compton，1991)、基于转录的扩增系统(TAS；Kwoh等.，1989)、链置换扩增技术(SDA；Duck，1990；Walker等.，1992)、依靠Q9复制酶的扩增技术(Lizardi等.，1988；Lomeli等.，1989)或本领域中公知的用于扩增核酸分子的任何其它合适方法。
聚合酶链反应用于扩增的PCR过程通常为本领域众所周知(参见，例如美国专利号4,683,202和4,683,194)。所述扩增过程可包括用于制备的酶链反应，相对于反应步骤的数量以指数数量存在，包括一种特异性核酸序列，假定对所需序列的末端了解足够详细，则将与它们杂交的寡核苷酸引物可得到合成，以及少量的能起始链反应的序列。一种引物是与负(-)链互补，其它引物是与正(+)链互补。引物从变性的核酸上退火，接着用诸如DNA聚合酶I大片段(Klenow)的酶和核苷酸进行延伸，产生含有靶序列的新合成的(+)和(-)链。因为这些新合成的序列也是引物的模板，所以重复变性、引物退火和延伸循环以产生指数式积累的为所述引物确定的所述区域。链反应的产物可以是分离的核酸双链体，其具有相应于所使用的特异性引物末端的末端。
通过本发明可产生任何特异性核酸序列。仅需要对所述序列两末端的足够数量的碱基了解得足够详细，以便两种与所需序列的不同链杂交的寡核苷酸引物可得到制备，以及位于所述序列前的相对位置使得从一种引物合成延伸产物，当其分离自其模板(互补的)时，可作为模板用于其它引物导入规定长度核酸的延伸。对所述序列两末端处碱基了解得越多，所述引物对靶核酸序列的特异性就越高，因而该过程就能更有效。应当理解在本文中使用的术语引物可指多于一种的引物，具体而言在一些要被扩增的片段末端序列相关信息含糊不清的情况下。举例来说，在核酸序列从蛋白质序列信息推断情况下，基于可用于每条链的遗传密码子的简并性，引物的集合包含代表所有可能的密码子变化的序列。来自该集合的一种引物可基本上与要被扩增的所需序列的末端保守。
通过使用包含作为模板的序列的诊断上有价值的标记物核酸产生特异性核酸序列。如果样品靶核酸序列包含两条链，则在它们可用作为模板前需要分离所述核酸的链，作为一步分离步骤或与所述引物延伸产物的合成同时进行。该链分离可使用任何合适的变性技术来完成，包括物理、化学或酶学方法，其中在本文中使用的术语“变性”包括属于上述方法。一种分离核酸链的物理方法包括加热核酸个体直至其变性。一般的加热变性可包括从约80-150℃范围内的温度和从约1-10分钟范围内的时间。链分离也可通过酶来诱发，所述酶来自已知为解旋酶或RecA酶类型的酶，其具有解旋酶活性和在核糖ATP存在的条件下已知能变性DNA。适用于用解旋酶分离核酸的链的反应条件描述于Kuhn Hoffmann-Berling，CSH-Quantitative Biology，4363(1978)，以及使用RecA的技术述评于C.Radding，Ann.Rev.Genetics，16405-37(1982)中。
如果包含要被扩增序列的起始核酸是单链，其互补物可通过添加一种或两种寡核苷酸引物来合成之。如果添加了合适的单个引物，引物延伸产物在所述引物、用于聚合的试剂和四种如下所述的核苷三磷酸存在下得到合成。所述产物可部分与单链核酸互补并可与所述核酸链杂交形成不等长度链的双链体，接着可按上述方法分离成单链以生成两种分离的互补单链。或者，两种合适的引物可添加到所述单链核酸中并进行反应。
如果起始核酸组成的序列要被扩增，所产生的引物延伸产物可完全或基本上与所述起始核酸的链互补，并与之杂交形成具相等长度的链的双链体，其会被分离成单链分子。
当所述的核酸的互补链得到分离时，无论所述核酸最初是双链或单链，所述链可预备用作为模板，用于另外核酸链的合成。该合成在容许引物与模板杂交发生的条件下进行。为获得杂交，其通常在缓冲水溶液中发生，例如，在pH7-9范围。摩尔过量的(对于基因组核酸，通常为约1081引物模板)两种寡核苷酸引物可添加到含有分离的模板链的缓冲液中。然而，可以理解如果所述方法用作为诊断应用，则无法得知互补链的数量，使得相对于互补链数量的引物数量无法确定无疑。但是，实际操作中当所述要被扩增的序列包含在复杂的长链核酸链的混合物时，引物数量通常以超过互补链(模板)数量的摩尔过量添加。优选大的摩尔过量以改善所述方法的效率。
脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和TTP也以合适的数量分别地或与所述引物一起添加到所述合成混合物中，将所产生的溶液加热至约90-100℃，持续约1-10分钟，例如约1-4分钟。在加热后，容许溶液冷却至室温，其有利于引物杂交。向冷却的混合物中添加用于实现引物延伸反应的合适试剂(在本文中称为“用于聚合的试剂”)，并容许反应在本领域公知的条件下发生。如果其它试剂耐热，则所述用于聚合的试剂也与其一起添加。该合成反应可在室温至超出室温的所述用于聚合的试剂不再有功能的温度范围内发生。因而，举例来说，如果DNA聚合酶用作为所述试剂，则所述温度通常不高于约40℃。最合适地，反应发生在室温。
用于聚合的试剂可以是任何能完成引物延伸产物合成功能的化合物或系统。包括酶。用于该目的的合适的酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其它可获得的DNA聚合酶、聚合酶突变蛋白质、逆转录酶和其它酶，包括耐热酶(即，那些在经历足够地提高以导致变性的温度后执行引物延伸的酶)，其能促进以适当的方式结合核苷以形成与每条核酸链互补的引物延伸产物。一般来说，所述合成可在每个引物的3’-末端起始和在5’方向沿着模板链进行直至合成终止，产生不同长度的分子。或者使用如上所述的同样方法，可以使用用于聚合的试剂在5’-末端起始反应并朝着3’-末端进行。
如果所述靶序列存在，在如上所述的杂交条件下，所述新合成的链和其互补核酸链可形成双链分子，以及该杂交被用于所述方法的后继步骤中。在下一步骤中，如果所述靶序列存在，使用任一如上所述的程序将在杂交条件下处理的样品经历变性条件，以提供单链分子。
在所述单链分子上合成新核酸。对于在上述规定条件下进行的反应而言，添加用于聚合的试剂，如果需要添加核苷和引物。此外，所述合成可在每条寡核苷酸引物的一个末端起始，并沿着模板单链进行以产生附加的核酸。在该步骤后，一半的延伸产物由两种引物所限定的特异性核酸序列组成。
每当需要扩增所述靶核酸序列至检测所需程度时，变性和延伸产物合成步骤可重复进行。更多细节描述如下，所产生的特异性核酸序列的数量可以指数方式积累。
当需要从起始核酸或核酸混合物中产生多于一种的特异性核酸序列时，可使用合适数量的不同寡核苷酸引物。例如，如果要产生两种不同的特异性核酸序列，使用四种引物。两种引物特异于一种特异性核酸序列，其它两种引物特异于第二种特异性核酸序列。在该方法中，两种不同的特异性序列的每种可通过本方法以指数式产生。
本发明可以逐步方式进行，其中在每步过后添加新的试剂，或同时进行或在单个步骤的方法中，其中所有试剂在起始步骤添加，或部分逐步进行和部分同时进行，其中新鲜试剂在特定数目的步骤后添加。如果变性方法，例如使用加热，其能使所述用于聚合的试剂失活，当在不耐热的酶存在下，则需要在每次链分离步骤后补充试剂。当酶学方法用作为链分离步骤时，可使用同时进行方法。在所述同时进行方法中，反应混合物可含有除具有所需序列的核酸链之外的链分离酶(如，解旋酶)，一种合适的用于链分离酶的能量来源(如，rATP)，四种核苷三磷酸、以摩尔过量存在的寡核苷酸引物和用于聚合的试剂(如，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段)。
如果在同时进行方法中对于变性使用加热，可使用诸如耐热聚合酶的耐热试剂，在提高的温度条件下操作，例如基于所述试剂从约50-105℃，在该温度所述核酸可由处于平衡的单链和双链组成。对于较小长度的核酸而言，可使用约40-50℃的较低温度。较高温度范围可基于酶降解的温度或在超过该温度没有足够水平的引物杂交发生的温度。所述的耐热酶描述于，如A.S.Kaledin等.，Biokhimiya，45，644-651(1980)中。对于成功进行恒温反应而言，引物彼此在它们的3’末端具有6-8个碱基对。尽管最初存在着所有试剂，所述方法的每一步骤可按顺序发生。如果需要可添加额外的原料。在产生所需数量的特异性核酸序列的合适的时间长度后，反应可通过以任何已知的方法使酶失活或通过分离反应成分而停止。
也可使用循环变温反应进行扩增，其中所述温度的增量容许使用耐热酶进行延伸、退火和变性。
本发明的方法可连续进行。在一个自动化方法的实施方案中，所述反应可通过变性期、试剂添加期和反应期循环。在另一个实施方案中，用于合成引物延伸产物的酶可固定在柱上。其它的反应成分可通过泵连续循环通过柱和串联的加热旋管，因而所产生的核酸可重复变性而不使酶失活。
使用本领域常规PCR技术对黄病毒进行基因分型。此外，在业已对怀疑含有黄病毒的样品使用PCR后，可对黄病毒基因组测序。
探针和靶序列杂交的检测用于检测探针和样品中靶核酸序列之间形成杂交的合适的测定法为本领域所公知(Sambrook等.，1985)。无论核酸是否扩增，皆可实现杂交的检测。
一种检测方法是通过使用标记的探针，该标记的探针能与未扩增或扩增的核酸序列杂交并确定是否所述探针已被杂交。上述探针必需含有所述怀疑是突变的核苷酸，例如BVDV RNA聚合酶的1214或HCV基因组的核苷酸8443。
寡核苷酸可通过掺入标记得到标记，该标记通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的。有用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(一般用于ELISA)、生物素或半抗原和抗血清或单克隆抗体可利用的蛋白质。
所述核酸可通过使用或不使用放射性探针的Northern或Southern印迹分析得到检测。在一个实施方案中，DNA形式的小量样品，来自如怀疑含有黄病毒的外周血，通过使用寡核苷酸探针的Southern印迹技术检测特异性核酸病毒标记物而进行分析。在另一个实施方案中，DNA形式的小量样品，来自如怀疑含有黄病毒的外周血，首先进行扩增，接着通过使用寡核苷酸探针的Southern印迹技术检测特异性核酸病毒标记物而进行分析。
另一种方法包括寡聚体限制切技术(例如描述于美国专利号4,683,194中)。在该方法中，扩增的核酸变性并在溶液中与标记的寡核苷酸探针杂交，所述探针与靶序列特异性杂交(即，通过所述引物跨越所包含的特定保守区)并跨越至少一个感兴趣的限制切位点。在靶和探针之间所形成的双链体可重建限制位点，以及当用诸如BglI、PvuII或HifI的限制性内切酶裂解时，释放出标记的探针片段，所述探针片段通过凝胶电泳从全长探针中确定。接着将所产生的凝胶放射自显影。通过该方法扩增产物的分析可快速进行，即在几小时内。
另一种可用于分析扩增产物的方法是斑点印迹法。在斑点印迹法中，扩增的靶DNA固定在诸如尼龙膜的固相载体上。所述膜-靶复合物与标记的探针在合适的杂交条件下温育，未杂交的探针通过在合适的严格条件下洗涤除去，并监测膜上结合的探针的存在。
一种可选的方法是“反相”斑点印迹法，其中扩增的靶DNA被标记，探针固定在诸如尼龙膜的固相载体上(参见Saiki等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230，和PCT专利申请公开号89/11548)。所述靶DNA通常在扩增过程中通过掺入一种或多种标记的引物而得到标记。一种或两种所述引物可得到标记。所述膜-探针复合物与标记的扩增靶DNA在合适的杂交条件下温育，未杂交的靶DNA通过在合适的严格条件下洗涤除去，接着监测滤纸上结合的靶DNA的存在。
或者，所述反相斑点印迹法可使用具有多个探针杂交位点或孔的固相载体来进行。例如，在本发明方法的大规模临床应用中微孔板是特别有用的。探针可通过被动固定或通过诸如牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质中间物固定到微孔板，所述蛋白质中间物粘着在微孔板上。在微孔板中进行的反相斑点印迹法描述于美国专利号5,232,829和Loeffelholz等，1992，J.Clin.Microbiol.30(11)2847-2851中。在本发明的另一个实施方案中，一种反相斑点印迹法使用微孔板进行，引物用生物素标记，描述于Levenson和Chang，1989，in PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications，(Innis等.，编辑.，Academic Press.San Diego)99-112页。探针用BSA缀合(参见Tung等.，1991，Bioconjugate Chem.2464-465，在此并入作为参考)并固定在微孔板上。接着使用标记的引物扩增，并使用固定的探针杂交，扩增的核酸通过首先将生物素与抗生物素蛋白-辣根过氧化酶(A-HRP)或抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化酶(SAHRP)结合，接着通过检测其中进行的HRP催化发色团颜色改变的反应而得到检测。
在可选的固定用于检测的杂交双链体的方法中，BSA-缀合的探针结合到磁性微粒上。所述结合的探针在溶液中与标记的扩增产物杂交。杂交后，将有磁力的探针-靶双链体从溶液中除去，接着检测所述有磁力地固定的杂交双链体。
另一种检测方法称为5’-核酸酶测定，其中标记的检测探针在PCR扩增过程中添加。改性所述探针以便阻止它们作为DNA合成的引物。在每一合成步骤中，即在引物延伸过程中，任何与靶DNA杂交的探针通过诸如Taq DNA聚合酶的DNA聚合酶的5’到3’外切核酸酶被降解。接着检测来自探针的降解产物。因而，探针分解产物的存在表明在探针和靶DNA之间发生杂交以及发生了所述的扩增反应。也参见，例如美国专利号5,210,015。
如上所述的测定方法通常使用标记的寡核苷酸以便于检测杂交的双链体。寡核苷酸可通过任何在前提及的技术被标记，例如掺入可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的标记。有用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(一般用于ELISA)、生物素或半抗原和抗血清或单克隆抗体可利用的蛋白质。
一种用于检测黄病毒核酸扩增的可选的方法是通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加(如Higuchi等.，1992，Bio/Technology 10413-417；Higuchi等.，1993，Bio/Technology 111026-1030；及欧洲专利公开号487,218和512,334所描述的)。所述双链靶DNA的检测取决于当结合到双链DNA时，溴乙锭(EtBr)和其它DNA结合标记所展示的增加的荧光。由靶序列的合成产生的双链DNA的增加，导致了可检测荧光的增加。
另一种用于检测黄病毒突变的方法是通过反相杂交检测法。如果包含多种探针，则其是特别有用的。在一个实施方案中，所选择的探针组以已知的不同分布(斑点、线或其它图形)被固定在固相载体上。在另一个实施方案中，所选择的探针组以线性方式被固定在膜条上。所述探针可单独固定或以混合物固定以描绘在所述固相载体上的分布。在一个具体的实施方案中，一种线性探针检测法可用于检测含有本发明所述突变的黄病毒基因型。所述线性探针检测法包括以平行线方式固定在膜上的多种探针，接着进行扩增的核酸片段的反相杂交。然后，通过与非放射性显色系统偶合的生物素-抗生物素蛋白链菌素检测所述杂交。参见，例如WO 97/40193。
黄病毒基因分型技术也用于分析黄病毒突变的存在。例如，可使用基于系统进化分析法的测序、差示杂交、PCR或片段长度多态性。
黄病毒蛋白质/肽标记物的检测在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测用于长期2’-支链核苷治疗黄病毒感染失效诊断的病毒标记物的方法，其中对包含黄病毒蛋白质、肽或肽片段的样品分析上述病毒标记物。所述与治疗失效的相关的蛋白质、肽或肽片段可通过任何为本领域公知的通常可适用的蛋白质检测技术得到检测，包括蛋白质印迹法、二维凝胶电泳、酶联免疫吸附测定(ELISA)、增强化学发光(ECL)、免疫组化、ELI-Spot测定、肽测序、或基于蛋白质阵列技术的抗体。例如用于2’-支链核苷治疗诊断的黄病毒病毒标记物的蛋白质表达可用经典的免疫组化方法分析。在这些方法中，通过一级抗体(多克隆或单克隆)提供对特异性病毒标记物的特异性识别，但二级检测系统可利用荧光、酶或其它缀合的二级抗体。结果是获得了用于病理检查的免疫组化染色的黄病毒感染的组织切片。
另一种用于检测黄病毒携带者对2’-支链核苷治疗的长期响应具有诊断价值的蛋白质、肽或肽片段的方法是蛋白质印迹法。简言之，含有黄病毒蛋白质、肽或肽片段的样品通过凝胶电泳的方法得到分离。然后，将所述分离的蛋白质转移至诸如硝酸纤维素的介质上。接着，将具有诸如抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶的可检测标记的抗体与硝酸纤维素介质上包含的黄病毒氨基酸序列接触，所述抗体与特异性黄病毒氨基酸序列反应，所述特异性黄病毒氨基酸序列与2’-支链核苷失效相关。反应抗体可与相应的黄病毒氨基酸序列结合，并可使用诸如四唑氮蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)的试剂检测。参见，例如，Jalkanen，M.，等.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.，等.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987)。
或者，存在于黄病毒携带者血清中的反应抗体可用于检测黄病毒病毒标记物的存在，所述标记物用于2’-支链核苷治疗的诊断。任何为本领域技术人员所公知的已知抗体测定技术，包括酶免疫分析法(EIA)，可得到使用。举例来说，在一个实施方案中，将来自黄病毒携带者的包含黄病毒特异性抗体的样品与包含特异性黄病毒肽的固相载体阵列接触，所述特异性黄病毒肽与2’-支链核苷治疗成功和/或失效相关。接着，使用标记有抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶的兔抗人IgG抗体和含有暴露于四唑氮蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯的试剂检测反应抗体。
任何其它用于检测黄病毒携带者对2’-支链核苷治疗的长期响应具有诊断价值的蛋白质、肽或肽片段的方法是通过使用本领域技术人员公知的技术对所述蛋白质、肽或肽片段测序。(参见，例如，Matsudaira，P.，J Biol Chem 26210035-10038，(1987)；Salinovich，O.和Montelano，R.，Anal.Biochem.156341，(1986)；Tarr，G.E.Manual Edman Sequencing System.InShively，J.E.，(编)Methods of Protein Microcharacterization.The Humana Press Inc.，Clifton，NJ，1986，pp.155-194；及Femandez，J.，Andrews，L和Mische，S.，Anal.Biochem.218112-117，(1994))。例如，可以使用Edman技术来测定肽的氨基酸序列。简言之，所述Edman化学反应从蛋白质/肽的N-末端除去氨基酸残基，在序列中一次一个地除去。需要除去每个氨基酸残基的每个Edman化学反应循环由三个步骤组成在温和的碱性条件下与异硫氰酸苯酯(PITC)偶合形成苯氨基硫甲酰基(PTC)-肽；裂解以释放第一个残基，以其苯胺基噻唑啉酮(ATZ)-氨基酸衍生物形式释放；将所述ATZ衍生物转化为更稳定的乙内酰苯硫脲(PTH)-氨基酸衍生物。所述在每次Edman降解循环中被除去的PTH-氨基酸残基通过小孔或微孔柱RP-HPLC得到鉴定。所述方法的完整描述和可能存在的缺陷给定于Tarr，G.E.Manual EdmanSequencing System.InShively，J.E.，(编)Methods of ProteinMicrocharacterization.The Humana Press Inc.，Clifton，NJ，1986，pp.155-194。或者，如果样品不产生N-末端序列，则N-末端残基是封闭的，在预备程序中降解，或由于立体化学的原因对于Edman化学试剂而言难以获得，接着所述样品可经历受控的特异性蛋白质水解，其中肽得到分级分离并接着被分析。该分级分离法描述于Fernandez，J.，Andrews，L.和Mische，S.An improved procedure forenzymatic digestion of polyvinylidene difluoride-bound proteins for internal sequenceanalysis.Anal.Biochem.218112-117，1994。
阵列本发明的另一方面提供了使用DNA、RNA或肽阵列检测黄病毒核酸病毒标记物。上述阵列包括DNA大阵列(DNA macroarrays)、DNA微阵列和DNA微芯片。DNA阵列，例如，业已描述于美国专利号5,837,832，美国专利号5,807,522，美国专利号6,007,987，美国专利号6,110,426，WO99/05324，99/05591，WO00/58516，WO95/11995，WO95/35505A1，WO99/42813，JP10503841T2，GR3030430T3，ES2134481T3，EP804731B1，DE69509925C0，CA2192095AA，AU2862995A1，AU709276B2，AT180570，EP 1066506和AU 2780499。当所述阵列与制备的样品核苷酸接触时，上述阵列可结合计算机方法用于分析杂交结果，例如，描述于PCT公开号WO 99/05574和美国专利号5,754,524；6,228,575；5,593,839和5,856,101。用于筛选疾病标记物的方法也已为本领域所公知，例如，描述于美国专利号6,228,586；6,160,104；6,083,698；6,268,398；6,228,578和6,265,174。DNA阵列方法的更多描述，例如，可发现于Shoemaker D.D.等.，Nature 409(6822)922-927(2001)；Kane M.D.，等.，Nucleic Acids Res 28(22)4552-7(2000)；Taton TA，等.，Science.289(5485)1757-60 (2000)；Jorg Reichert等.，Anal.Chem.，72(24)6025-6029(2000)；Reinke V，Mol Cell 6(3)605-16(2000)；Marx J.Science 2891670-1672(2000)；Lockhart D.J.等.，Nature 405(6788)827-836(2000)；Cortese J.D.，The Scientist 14[17]25(2000)；Cortese J.D.，The Scientist 14[11]26(2000)；Fritz J.等.，Science.288(5464)316-8(2000)；Mark Schena(编)，Microarray Biochip Technolog，Eaton Publishing Company，Distributed by TeleChem/arrayit.com；Scherf U.，等.，Nat Genet.24(3)236-44(2000)；Ross D.T.等.，Nat Genet.24(3)227-35(2000)；Walt D.R.，Science 287451-452(2000)；Afshari C.A.等.，Cancer Res 59(19)4759-60(1999)；Gwynne P.和Page G.，Science，1999 August 6.(特别广告增刊；具有微阵列相关公司的目录)；Baldwin D.等.，CurrOpin Plant Biol 2(2)96-103(1999)；Pollack J.R.等.，Nat Genet 23(1)41-6(1999)；Khan J.等.，Electrophoresis 20(2)223-9(1999)；Gerhold D.等.，Trends Biochem Sci 24(5)168-73(1999)；Ekins R.和Chu F.W.，Trends in Biotechnology 17217-218(1999)；Nuwaysir，E.F.等.，MolecularCarcinogenesis 24153-159(1999)；Sinclair，B.The Scientist，13(11)18-20(1999)；The Chipping Forecast，Nature Genetics(1999年1月增刊)；Schena，M.和Davis，R.W.Genes，Genomes and Chips.In DNA MicroarraysA Practical Approach(M.Schena编)，Oxford University Press，Oxford，UK，1999；Marton M.J.等.，Nat Med.4 (11)1293-301(1998)；Wang D.G.等.，Science 280(5366)1077-82(1998)；Schena，M.和R.W.Davis.Parallel Analysis with Biological Chips.in PCRMethods Manual(M.Innis，D.Gelfand，J.Sninsky编)，Academic Press，San Diego，1998；Lemieux，B.等.，Molecular Breeding 4277-289(1998)；Schena，M.等.，Trends in Biotechnology 16301-306(1998)；Service，R.F.，Science 282(5388)396-399(1998)；Service，R.F.，Science 282(5388)399-401(1998)；Kricka，L.，Nature Biotechnology 16513(1998)；Housman，D.，Nature Biotechnology 16(6)492-493(1998)；Ramsay，G.，Nature Biotechnology 16(1)40-44(1998)；Marshall，A.等.，Nature Biotechnology 16(1)27-31(1998)；Kononen J.等.，Nat.Med.4(7)844-847(19998)；Blanchard，A.P.(1998) Synthetic DNA Arrays；in GeneticEngineering，Vol.20，pp.111-123，J.K.Setlow 编，Plenum Press，New York；Proudnikov D.等.，Anal Biochem 259(1)34-41(1998)；Chen J.J.等.，Genomics51(3)313-24(1998)；Wallace R.W.，Molecular Medicine Today 3384-389(1998)；Covacci，A.等.，Drug Development Research 41180-192(1997)；Forozan，F.等.，Trends in Genetics 13405-409(1997)；Blanchard，A.P和L.Hood，NatureBiotechnology 141649(1996)；Blanchard，A.P.等.，Biosensors & Bioelectronics 11687-690(1996)；DeRisi J.等.，Nat Genet 14(4)457-60(1996)；Shalon D.等.，Genome Res 6(7)639-45(1996)；Schena M.等.，Proc Natl Acad Sci USA 93(20)10614-9(1996)；和Schena M.等.，Science 270(5235)467-70(1995)。
在阵列上的探针可具有不同长度，包括，但不限于，短至10-30个核苷酸长，或长达完整的黄病毒基因或黄病毒克隆，能长达几千个碱基。此外，如表2和3中所描述的那些不同长度的序列(Seq ID Nos.1-62)可用作为探针。可设计所述阵列使得所有在该阵列上的探针在大约相同的杂交严格性下能与它们相应的基因杂交。在所使用的杂交严格性下，用于阵列的探针应当是唯一的。唯一的探针仅能与每个靶的一种类型核酸杂交。如果在所使用的杂交严格性下，不是唯一的探针，其与源自两种不同基因的核酸杂交，即相关基因或非同源性序列。当测试所选择的样品时，所述探针对基因的序列同源性和所使用的杂交严格性可帮助确定探针是否是唯一的。探针也可以不与源自相同基因的不同核酸杂交，即剪接变体。因为所述感兴趣的剪接变体是已知的，所以从感兴趣的靶基因序列中可选择几种不同的探针序列用于阵列，使得每一种探针仅能与源自一种剪接变体的核酸杂交。在一个实施方案中，在容许选择性杂交的杂交条件下，使用包含Seq ID Nos.1-62的阵列。在选择性杂交条件下，探针仅与来自一种鉴定的序列的核酸杂交。在选择性杂交条件下，探针仅与来自一种鉴定的序列的核酸杂交。在另一个实施方案中，在容许选择性杂交的杂交条件下，使用包含任何感兴趣的黄病毒序列的阵列。在选择性杂交条件下，探针仅与来自一种鉴定的序列的核酸杂交。
在一个实施方案中，使用微阵列首先需要扩增感兴趣的基因，例如通过逆转录mRNA或总RNA，接着使用本领域公知方法进行聚合酶链反应。当所述核酸被复制时，其标记了能在本领域公知的检测和定量方法中使用的标记物。所述核酸可用放射性或非放射性标记物标记，但优选包含荧光标记。将所述标记的核酸导入至包含感兴趣的探针序列的微阵列，并容许反应持续一段时间。其后，洗涤底物至不含有外来杂质，使核酸离开结合到固定的探针分子的靶上，所述探针分子容许通过本领域公知方法检测和定量，例如通过放射自显影、液体闪烁记数和/或荧光。当杂交和检测技术得到改良时，它们能容易地为本领域技术人员所应用。本领域众所周知，如果探针分子和靶分子通过在两个分子间形成强的非共价键杂交，若退火和洗涤步骤在高严格条件下进行，则可合理地假定所述探针和靶核酸是基本上完全互补。所述可检测的标记提供了一种用于检测杂交是否已发生的方法。通过诸如放射自显影、液体闪烁记数和/或荧光的本领域公知方法检测和定量获得的阵列图像，通过比较阵列上特定位置的强度，可确定黄病毒基因序列是否存在或以什么程度存在。高定量信号表示特定序列存在于制备的样品中，以及不存在的定量信号显示特定序列并不存在。在不同条件下存在的不同基因序列可直接比较，例如在2’-支链核苷治疗前和在2’-支链核苷治疗期间。同样地，可确定什么序列对某些诸如2’-支链核苷的刺激物存在响应。
在一个实施方案中，使用DNA阵列技术可全程追踪患者的黄病毒序列分布图。在一个可选的实施方案中，对于前述黄病毒基因组序列响应治疗的改变而言，接受2’-支链核苷作为用药程式，或接受其它抗黄病毒用药程式的带有黄病毒的患者可全程得到监测。
包含Seq ID Nos.1-62或任何其它鉴定的感兴趣的黄病毒序列的阵列可通过任何本领域公知的阵列合成方法得到制备，例如点样技术或通过照相平板印刷术的固相合成。阵列也可印刷在固体基质上，如玻璃载玻片。在印刷前，制备载玻片以提供用于结合的基质，如本领域所公知。阵列可使用任何本领域公知的印刷技术和机械进行印刷。印刷包括将探针放置在基质上，将探针与基质连接和封闭基质以防止本领域公知的非特异性杂交。优选地，本发明的阵列通过联合使用照相平板印刷术和组合化学的固相合成法被合成。探针选择和阵列设计的某些关键因素是所有阵列生产中所共有的。优化探针杂交的策略，例如，总是包括于探针选择的过程中。在特定pH、盐和温度条件下的杂交可通过考虑解链温度和通过使用与所需杂交行为相关的经验法则得到优化(描述于Keller，G.H.，和M.M.Manak(1987)DNA Probes，Stockton Press，New York，N.Y.，pp.169-170，在此并入作为参考)。计算模型可用于预测探针杂交的强度的浓度依赖性。
本领域公知用于杂交的中等至高严格条件。一种用于印迹的高严格条件的实例是在68℃下，在5xSSC/5x Denhardt氏溶液/0.1％SDS中杂交，并在室温下，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤。一种中等严格条件的实例是在68℃下，在5xSSC/5xDenhardt氏溶液/0.1％SDS中杂交，并在42℃下，在3xSSC中洗涤。温度和盐浓度参数可改变以达到在探针和靶核酸间所需的序列同一性水平。参见，例如，Ausubel等.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，用于进一步指导杂交条件。所述解链温度描述于如下公式(Beltz，G.A.等.， Methodsof Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[Eds.]Academic Press，New York 100266-285)。Tm＝81.5℃.+16.6Log[Na+]+0.41(+G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链体碱基对长度。
在本发明中有用的核酸可通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳证实。PCR是核酸序列重复的、酶的、使用引物的合成。该方法众所周知并为本领域技术人员常用(参见，例如，Mullis，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；Saiki等.，Science 2301350-1354(1985))。PCR用于酶扩增感兴趣的DNA片段，是通过将两个杂交到靶序列的相反链寡核苷酸引物侧接到感兴趣的DNA片段。所述引物定向于3’-末端位点，并彼此相向。模板热变性、引物退火至它们的互补序列以及用DNA聚合酶延伸退火引物的重复循环导致PCR引物的5’-末端所限定的区段的扩增。因为每条引物的延伸产物可作为其它引物的模板，每次循环基本上加倍了在前一循环中DNA模板的数量。其导致特异性靶片段的指数式累积，在几小时内高达几百万倍。通过使用诸如Taq聚合酶的耐热DNA聚合酶，所述Taq聚合酶分离自嗜热细菌水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)，扩增过程可完全自动化。本领域技术人员公知其它可使用的酶。
或者，由肽核酸(PNAs)组成的探针可作为寡核苷酸形成的探针的替代物，用于如上所述相同的用途。本领域众所周知PNAs对寡核苷酸的替代作用通过业已描述的预成的单体合成肽核酸，例如，于PCT专利申请WO 92/20702和WO 92/20703中。也业已报道了PNAs合成、结构、生物特性和用途的新发展。参见，例如，PCT专利申请WO 93/12129、Neilsen P.E.等的美国专利US 6617422、Cook等的美国专利号5,539,083、美国专利申请US20030059789A1、Kleiber等的美国专利US6475721、Egholm等.，Nature365，566-568(1993)、Nielsen等.，Science 2541497-1500(1991)；和Egholm等.，J.Am.Chem.Soc.，1141895-1897(1992)。
试剂盒一种在测定法中用于测定黄病毒样本对2’-支链核苷抗性状态的合适的检验试剂盒使用了根据本发明一方面内容的方法学，包含(1)与野生型DNA序列(或其相应的RNA)的区域或与本文中所述的突变DNA序列的区域互补的寡核苷酸；(2)对于核酸从所述寡核苷酸3’-末端起始聚合必需的物质；和(3)用于测定寡核苷酸引物延伸的产物存在的工具。聚合用的物质如必要的话包括合适的酶、缓冲液、洗涤溶液、标记物和标记物底物。如果PCR被用于扩增核酸，则诸如合适的寡核苷酸引物的添加物质可扩增野生型DNA序列(或其相应的RNA)的区域或本文中所描述的突变DNA(或其相应的RNA)的区域，应当包括dNTP′s(脱氧核苷三磷酸)。也应包括指导所述测定的说明书。
一种在测定法中用于测定黄病毒样本对干扰素敏感性的合适的检验试剂盒使用了根据本发明另一方面内容的方法学，包含与野生型DNA序列(或其相应的RNA)的区域或与突变DNA序列相关的区域互补的寡核苷酸，以及容许杂交所必需的物质。上述物质如必要的话包括合适的缓冲液、洗涤溶液、标记物和标记物底物。在一个实施方案中，所述寡核苷酸被标记。如果在杂交前使用PCR扩增核酸，则诸如合适的寡核苷酸引物的添加物质可扩增野生型DNA序列(或其相应的RNA)的区域或突变DNA序列的区域，应当包括合适的酶和dNTP′s(脱氧核苷三磷酸)。也应包括指导所述测定的说明书。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测对黄病毒感染的长期2’-支链核苷治疗具抗性的标记物的试剂盒。所述试剂盒可包含一个含有寡核苷酸探针的隔室，所述探针基本上与黄病毒的核酸子序列结合，所述子序列包含诊断标记物。或者，所述试剂盒包含肽核酸(PNA)或其它取代所述寡核苷酸的反义模拟物探针。所述试剂盒也可包含用于检测探针与黄病毒核酸病毒标记物杂交的试剂。本发明也包括可含有用于黄病毒核酸PCR扩增的引物的试剂盒。试剂盒也可包含用于检测扩增的黄病毒核酸的工具，例如寡核苷酸或肽核酸探针。在一些情况下，所述探针固定在合适的支持膜上。所述试剂盒其它任选的成分包括，例如，催化引物延伸产物合成的试剂、底物核苷三磷酸、用于标记的工具(例如，如果所述标记是生物素，抗生物素蛋白-酶缀合物和酶底物和发色团)、用于PCR或杂交反应的合适缓冲液和用于执行本方法的说明书。
此外，所述试剂盒可具有一种容器，其包括含有一种或多种核酸的阳性对照，所述核酸具有与治疗失效相关的黄病毒病毒基因组序列，和/或一种包括不含有上述核酸的阴性对照的容器。此外，所述试剂盒可具有一种容器，其用于限制性内切酶可在包含于所述探针序列中的位点裂解含有靶序列的核酸。
本发明也提供了一种用于检测和/或遗传分析一种或多种黄病毒的病毒标记物的试剂盒，所述标记物与治疗失效相关，可存在于生物样品中，所述试剂盒包含如下成分(i)如果合适，一种用于释放、分离或浓缩样品中存在的核酸的工具；(ii)如果合适，至少一种合适的引物对；(iii)至少两种如上所述的探针，可能固定在固体载体上；(iv)一种杂交缓冲液，或必需用于产生所述缓冲液的成分；(v)一种洗涤溶液，或必需用于产生所述溶液的成分；(vi)如果合适，一种用于检测前述杂交所产生的杂种的工具；(vii)如果合适，一种用于将所述探针连接到固体载体已知位置的工具；和/或(viii)用于执行本方法的说明书。
此外，本发明也提供了一种包含相应于病毒标记物的肽或肽片段的试剂盒，所述病毒标记物与2’-支链核苷治疗失效相关，所述试剂盒可用于免疫测定中以检测样品中反应抗体的存在。所述肽能以稳定的溶液或冻干的形式存在。上述试剂盒可包含一种用于水解冻干肽的合适溶液。所述试剂盒也可包含一种合适的固体介质，用于将上述肽印迹于上。所述试剂盒也可包含一种合适的试剂，其用于检测与所述肽反应的抗体的存在，例如标记有抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶的抗人IgG抗体。此外，所述试剂盒可包含一种检测试剂，例如四唑氮蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)。
或者，所述试剂盒可包含与特异性肽序列反应的抗体，所述肽序列与2’-支链核苷治疗相关。
IV.黄病毒感染的治疗用抗黄病毒剂的联合或交替治疗黄病毒的药物抗性变体可在用抗病毒剂长期治疗后出现。药物抗性最通常通过编码用于病毒复制的酶的基因突变而出现。通过与第二种，和有可能第三种抗病毒化合物联合或交替给予所述化合物，其诱发与所述基本(principle)药物所导致的不同的突变，抗黄病毒感染的药物功效可得到延长、增加或恢复。联合治疗诱导了多种同时发生的对病毒的压制。通过上述联合或交替治疗，所述药物的药物代谢动力学、生物分布或其它药物参数可得到改变。
本发明提供了用于实现黄病毒感染优化治疗的方法，通过将2’-支链核苷或其药学上可接受的前体药物和/或盐，与一种或多种直接或间接诱导病毒基因组突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予需要治疗的人。
黄病毒突变株感染的干扰素治疗本发明的另一个方面提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主为黄病毒所感染，所述黄病毒包含在黄病毒的RNA聚合酶区结构域B的保守丝氨酸残基处丝氨酸至苏氨酸突变(图11)。在一个实施方案中，提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈BVDV感染的方法，所述BVDV包含在RNA聚合酶区氨基酸405位处丝氨酸至苏氨酸突变。在另一个实施方案中，提供了一种通过给予治疗有效量的干扰素，以治疗和/或基本上治愈HCV感染的方法，所述HCV包含在RNA聚合酶区氨基酸282位处丝氨酸至苏氨酸突变。在一个具体的实施方案中，给予干扰素α-2b以治疗和/或基本上治愈所述黄病毒感染。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主怀疑为BVDV所感染，包含(i)从宿主处获得病毒样品；(ii)鉴定是否样品中的黄病毒包含在RNA聚合酶氨基酸残基405处的苏氨酸；和(iii)给予宿主有效量的干扰素，所述宿主为包含在RNA聚合酶区氨基酸405处的丝氨酸至苏氨酸突变的黄病毒所感染。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗和/或基本上治愈宿主中黄病毒感染的方法，所述宿主怀疑为HCV所感染，包含(i)从宿主处获得病毒样品；(ii)鉴定是否样品中的黄病毒包含在RNA聚合酶氨基酸残基282处的苏氨酸；和(iii)给予宿主有效量的干扰素，所述宿主为包含在RNA聚合酶区氨基酸282处的丝氨酸至苏氨酸突变的黄病毒所感染。
干扰素包括Schering的Intron-A(干扰素α-2b)、Schering的PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roche的Roferon-A(干扰素α-2a)、Roche的PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、InterMune的INFERGEN(干扰素α-1)、Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)、Human Genome Sciences的ALBUFERON、Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)、BioMedicine的ω干扰素、Amarillo Biosciences的口服α干扰素和InterMune的干扰素γ-1b。
对BVDV RNA聚合酶区氨基酸405位的丝氨酸至苏氨酸的突变，或HCVRNA聚合酶区氨基酸282位的丝氨酸至苏氨酸的突变的鉴定可通过检测黄病毒基因组突变的存在得以完成，所述突变容许丝氨酸至苏氨酸的氨基酸改变。在一个实施方案中，在BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处胞苷的存在(其中RNA聚合酶区核苷酸1214相应于BVDV基因组核苷酸11，136)可用于检测所述氨基酸改变。在另一个实施方案中，如下双重突变可得到检测1214(G至C)和1215(C至A)；1214(G至C)和1215(C至G)；或1214(G至C)和1215(C至U)，其导致了BVDV RNA聚合酶区405位丝氨酸至苏氨酸的氨基酸改变。在另一个实施方案中，在HCV基因组核苷酸8443处胞苷的存在可用于检测所述氨基酸改变。在另一个实施方案中，如下双重突变可得到检测8443(G至C)和8444(C至A)；8443(G至C)和8444(C至G)；或8443(G至C)和8444(C至U)，其导致了HCV RNA聚合酶区282位丝氨酸至苏氨酸的氨基酸改变。所述突变可使用任一上述检测技术，例如标记的探针、反相杂交检测法、DNA印迹或任何其它本领域技术人员公知的检测技术，得到检测。
V.药物组合物的制备可通过将有效量的2’-支链核苷或其药学上可接受的前体药物和/或盐，例如β-D-2’-CH3-核糖C或其3’缬氨酸酯前体药物，在药学上可接受的载体或稀释剂存在下，适用于任一本文中所详细描述的给药指示或方式，与一种诱发所述病毒基因组突变的药物联合或交替给予所述患者，所述突变位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同氨基酸的核苷酸突变，治疗包括人的任何宿主展示的黄病毒所导致的感染。所述2’-支链核苷，例如β-D-2’-CH3-核糖C或其药学上可接受的前体药物和/或盐可单独给药或与其它本文中所述的抗病毒剂联合或交替给药。所述活性物质可通过任何合适的途径，例如，经口、肠胃外、静脉、经皮、皮下或局部，以液体或固体形式给予。
化合物优选的剂量约为每公斤体重每天1-50mg，优选1-20mg，更通常为患者每公斤体重每天0.1-约100mg。可基于待释放的母体核苷的重量来计算药学上可接受的盐和前体药物的有效剂量范围。如果所述盐或前体药物本身具有活性，则可使用所述前体药物和/或盐的重量估计有效剂量，或通过本领域技术人员公知的其它方法。
以任何合适的剂型单位方便地给予化合物，包括但不限于每剂型单位中含有7-3000mg，优选70-1400mg的活性成分。例如，50-1000mg活性成分的口服剂量通常是方便的。
理想地，所述活性成分应给予以使所述活性化合物的血浆峰浓度达到约为0.2-70μM，优选约1.0-10μM。例如，可通过静脉注射0.1-5％活性成分的溶液，任选为盐溶液，或以大丸剂给予所述活性成分来实现之。
药物组合物中活性化合物的浓度取决于所述药物的吸收、失活和排泄率，也取决于本领域技术人员公知的其它因素。应当注意剂量也应随着要缓解病症的严重程度而有所变化。应当进一步理解，对于任何特定受试者而言，特定的给药方案应当根据个体的需要和给予或监督所述组合物给药的人士的专业判断随时进行调整，而且前述的浓度范围仅仅是示例性的，并不意在限制所要求保护的组合物的范围或实施。可一次性给予所述活性成分，也可将其分为许多小剂量以不同的时间间隔给予。
所述活性化合物的优选给药方式为经口给药。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。可将其装入明胶胶囊中，也可将其压制为片剂。用于经口给药治疗时，可将所述活性化合物与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。所述组合物中也可包括药学上相容的粘合剂、和/或佐剂。
所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任何下列成分或类似性质的化合物诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶的粘合剂；诸如淀粉或乳糖的赋形剂，诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotes的润滑剂；诸如胶体二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或诸如薄荷油、水杨酸甲酯或橙类调味剂(orange flavoring)的调味剂。当所述单位剂型为胶囊时，除上述类型物质外，还可含有诸如脂肪油的液体载体。此外，单位剂型还可含有各种可改变该剂型物理形式的其它物质，例如糖包衣物、虫胶或其它肠包衣剂。
也可以将所述化合物作为酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、咀嚼胶等组分给予。除所述活性成分外，糖浆剂可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂及调味剂。
也可以将所述化合物或其药学上可接受的前体药物或盐与其它不影响所需作用的活性物质、或者与补充所需作用的物质混合，例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂或其它抗病毒剂，包括其它的核苷化合物。用于肠胃外、皮内、皮下或局部使用的溶液或悬浮液可包括如下组分诸如注射用水的无菌稀释剂、盐水溶液、固定油(fixed oils)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸的螯合剂；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲剂，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可装入安瓿、一次性注射器或多剂量的玻璃或塑料小瓶中。
如果通过静脉注射给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。
在一个优选实施方案中，将所述活性化合物与可保护该化合物不从体内快速清除的载体一起制备为制剂，如控释制剂，包括植入物和微囊递药系统。可以采用可生物降解和生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对于本领域技术人员而言，制备此类制剂的方法是显而易见的。上述物质也可购自Alza Corporation。
脂质体悬浮剂(包括靶向侵染细胞的具有病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也是优选的药学上可接受的载体。可根据本领域技术人员公知的方法，如描述于美国专利号4,522,811，在此全文并入作为参考的方法，制备这样的制剂。举例来说，通过将合适的脂质，如硬脂酰磷脂乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于无机溶剂中，然后蒸发并在容器表面留下干燥的脂质薄膜以制备脂质体制剂。随后向容器中加入所述活性化合物或其单磷酸根、二磷酸根和/或三磷酸根衍生物的水溶液。接着用手旋转容器使脂质物质与容器表面脱离并使脂质聚合体分散，由此形成脂质体悬浮剂。
所述活性化合物包含于足够数量的药学上可接受的载体或稀释剂中以递送给患者治疗有效量的化合物，以抑制病毒体内复制，具体是黄病毒复制，而不在所治疗的患者中产生严重的毒性作用。“抑制量”指足够发挥抑制作用的活性成分数量，例如，可通过一种诸如本文所描述的测定法进行测定。
控释制剂自从Kulkami等在1966年(“Polylactic acid for surgical implants，”Arch.Surg.，93839)报道了聚乳酸的合成和生物可降解性以来，生物可降解聚合物领域发展迅猛。其它业已报道作为递送设备基质材料的聚合物实例包括聚酐、诸如聚乙醇酸交脂和聚交酯-共-乙交酯的聚酯、诸如多聚赖氨酸的多聚氨基酸、聚氧化乙烯、丙烯酸封端聚氧化乙烯、聚酰胺、聚氨酯、聚原酸酯、聚丙烯腈和聚磷腈的聚合物和共聚物。参见，例如，Langer的美国专利号4,891,225和4,906,474(聚酐)、Hutchinson的美国专利号4,767,628(聚交酯、聚交酯-共-乙交酯)和Tice等的美国专利号4,530,840(聚交酯、聚乙醇酸交脂和共聚物)。也参见Hubbell等的美国专利号5,626,863，其描述了光聚合生物可降解水凝胶作为组织接触材料和控释载体(聚合的和交联的大分子单体水凝胶，包含具有生物可降解单体或低聚延伸物的亲水低聚物，其末端加帽的单体或低聚物能聚合并交联)；和Focal，Inc的WO 97/05185，指导多封端生物可降解水凝胶作为控释剂用于药物递送和组织治疗剂。
诸如交联明胶的生物学来源的可降解材料是众所周知的。透明质酸业已交联并用作为可降解溶胀聚物，用于生物医学应用(Della Valle等的美国专利4,957,744；(1991)“Surface modification of polymeric biomaterials for reducedthrombogenicity，”Polym.Mater.Sci.Eng，62731-735])。
目前许多分散系统在使用中，或正研究用作为物质载体，具体是生物学上活性化合物的载体。用于药物和化妆品制剂的分散系统可分类为悬浮液和乳状液。悬浮液定义为从几纳米至几百微米范围的固体颗粒，使用悬浮剂在液体介质中分散。固体颗粒包括微球、微胶囊和毫微球。乳状液定义为一种液体在另一种液体中分散，通过诸如表面活性剂和脂质的乳化剂的界面膜稳定。乳状液制剂包括油包水和水包油乳剂、多层乳剂、微乳剂、微滴和脂质体。微滴是由内部具有油相的球状脂质层组成的单层磷脂囊泡，详细说明于Haynes的美国专利号4,622,219和4,725,442。脂质体是通过将水不溶性的极性脂质与水溶液混合制备的磷脂囊泡。通过在水中混合不溶的脂质导致的不利的熵值产生了在水溶液中高度有序的磷脂同心闭合膜。
Dunn等的美国专利号4,938,763也公开了另一种通过原位形成植入物的用于药物递送的方法，即通过在生物可相容的、水溶性溶剂中溶解非反应的、水不溶性热可塑性聚合物以形成液体，将液体置于体内，容许溶剂分散以产生固体植入物。所述聚合物溶液可通过注射置于体内。所述植入物可采用与其周围腔体相合的外形。在一个可选的实施方案中，由不含有溶剂的反应的、液体低聚聚合物制备所述植入物，并在适当位置固化形成固体，通常添加有固化催化剂。
几个专利公开了药物递送系统可用于将2’-支链核苷或其药学上可接受的前体药物和/或盐，与一种诱发病毒基因组突变的药物联合或交替给予许多患者，所述突变位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同氨基酸的核苷酸突变。美国专利号5,749,847公开了通过电穿孔(electrophoration)递送核苷酸进入生物体的方法。美国专利号5,718,921公开了使用包含聚合物和其中分散有药物的微球体作为递送系统。美国专利号5,629,009公开了一种用于生物活性因子控释的递送系统。美国专利号5,578,325公开了使用非线型亲水疏水多封端共聚物的毫微球和微球体用于药物递送。美国专利号5,545,409公开了一种用于生物活性因子控释的递送系统。美国专利号5,494,682公开了使用离子交联聚合微胶囊作为药物递送系统。
Andrx Pharmaceuticals，Inc.的美国专利号5,728,402描述了一种控释制剂，包括一种包含活性药物、其盐或前体药物的内相，与水凝胶成形剂混合，和一种包含在胃中抗分解包衣的外相。Andrx Pharmaceuticals，Inc.的美国专利号5,736,159和5,558,879公开了用于药物的具有极低水溶性的控释制剂，其中在原位形成通道。Andrx Pharmaceuticals，Inc.的美国专利号5,567,441公开了一种每天一次的控释制剂。美国专利号5,508,040公开了一种多微粒脉冲释药系统。美国专利号5,472,708公开了一种基于脉冲微粒的药物递送系统。美国专利号5,458,888描述了一种控释片剂，使用具有包含药物的内相和包含聚乙二醇聚合物的外相的混合物制备之，所述聚乙二醇聚合物具有3,000-10,000的平均分子量。美国专利号5,419,917公开了用于改进形成水凝胶的药物的释放速率的方法，其基于使用有效量的药学上可接受的可电离的化合物，所述化合物能提供基本上为零级释放速率的形成水凝胶的药物。美国专利号5,458,888公开了一种控释片剂。
Elan Corporation，plc的美国专利号5,641,745公开了一种控释药物配方，其包含在生物可降解聚合物中形成微球体或毫微球的活性药物。所述生物可降解聚合物是合适的聚-D，L-丙交酯或聚-D，L-丙交酯和聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯混合物。Elan Corporation plc的美国专利号5,616,345描述了一种用于每天一次给药的控制吸收制剂，包括与有机酸交联的活性化合物，和环绕核的多层膜并包含较大比例的药学上可接受的膜成形水不溶性合成聚合物和较小比例的药学上可接受的膜成形水溶性合成聚合物。美国专利号5,641,515公开了一种基于生物可降解毫微球的控释制剂。美国专利号5,637,320公开了一种用于每天一次给药的控制吸收制剂。美国专利号5,580,580和5,540,938给出了一种制剂及其在神经系统疾病治疗中的用途。美国专利号5,533,995给出了一种具有控制药物递送的被动经皮肤设备。美国专利号5,505,962描述了一种控释药物制剂。
如下实施例用于举例说明本发明的不同实施方案，并不意在限制任何方面内容。
实施例实施例1β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV的分离通过用非细胞致病(ncp)BVDV(I-N-dIns株；Nebraska，Lincoln，NE的Dr.R.Donis，U.)体外感染原初细胞，已确定在MDBK细胞系(ATCC，Manassas，VA，目录号CCL-22)中持续的BVDV感染。感染复数(MOI)是0.01。细胞每周传代两次(分流比1∶15)直至达到稳定的高水平感染(106-107转化灶形成单位(FFU)/毫升)，通过转化灶化验测定。下一步，所述持续感染的细胞在含有8μM或不含有β-D-2’-CH3-核糖C(Idenix Pharmaceuticals)的6孔培养板中生长，。细胞培养物每3-4天通过分裂传代，具有1∶15-1∶20的分流比。传代8次后，在存在β-D-2’-CH3-核糖C的条件下生长的细胞培养物在T-75培养瓶中展开，冻/融两次，并作为β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV的病毒原种用于进一步的鉴定。在每一传代末期通过病毒转化灶化验监测细胞培养物中的病毒滴度。
为进行病毒转化灶化验，将MDBK细胞接种在6孔培养板上，每孔含有2×105个细胞，使用前在37℃/5％CO2下生长至少5小时。测试样品(培养物上清液和单层细胞)冻/融两次，在培养基中连续稀释10倍，并在6孔培养板中用于接种测试细胞，每孔0.2mL。在1小时的吸附后除去接种物，在添加有8％马血清、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和25mM HEPES)完全菌种生长培养基(1X DMEM(Cellgro)中，细胞用3mL 0.5％琼脂糖覆盖。在37℃/5％CO2下温育3天后，培养板用3mL7.4％甲醛PBS溶液固定1小时，并用PBS洗涤。单层细胞用1mL PBS-0.25％Triton X-100每孔透化处理10分钟，并与0.5mL羊抗BVDV抗血清(VMDR，Inc.；在PBS-0.25％Triton X-100中稀释到1∶1000)温育1小时。然后，除去抗血清，用PBS洗涤单层细胞(两次，持续15分钟)，并与0.5mL过氧化酶缀合的驴抗羊抗体(在PBS-0.25％Triton X-100中稀释到1∶1000)温育另外1小时。在除去抗体后，单层细胞用PBS洗涤(两次，持续15分钟)，并与0.5mL二氨基联苯(DAB)过氧化酶底物溶液(VectorLaboratories)在室温下温育，直至病毒转化灶可见(约15分钟)。所有温育均进行摇动。通过用水洗涤终止染色，容许培养板风干。病毒滴度以FFU/mL计算，使用如下方程式TFFU/mL＝N×5×D；其中T是病毒滴度，单位FFU/mL；N是每孔转化灶数量；和D是对于相应的病毒样品的稀释因子。(例如，如果在一个孔中发现12个转化灶，相应于10-5倍稀释的病毒样品，则T＝12×5×105＝6×106FFU/mL)。
一般而言，在2-3次传代后病毒滴度达到106-107FFU/mL，在超过至少2个月的进一步传代后，并不明显改变。当用8μMβ-D-2’-CH3-核糖C处理上述持续感染的细胞系时，病毒滴度快速下降，在两次传代后不再检测到病毒(图1)。但是，在存在所述抑制剂条件下再次传代后，病毒再次在培养物中出现(一般而言，在3-5代)，且病毒滴度在105FFU/mL处达到停滞期，较未处理的培养物低约10倍(图1)。该10倍病毒滴度差异甚至在处理28天后仍观察到。重复该实验3次并获得类似的结果。再出现的病毒的表型明显不同于最初的野生型病毒其生长着十分小的转化灶，一般来说，较那些野生型病毒直径小3-10倍(图2)。在所述抑制剂存在的条件下，在培养物中延长传代至少72天后，该表型没有改变，但在中止所述处理后，其快速回复到野生型表型(大的转化灶)。
总的来说，这些数据证实了在处理后野生型病毒从细胞培养物中消失，并证实β-D-2’-CH3-核糖C抗性病毒变体在组织培养物中具有较小的复制适合度。
实施例2病毒生长动力学比较野生型和β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV的生长动力学。MDBK细胞在6孔培养板上接种(2×105细胞/孔)，并在37℃/5％CO2下生长过夜。用BVDVI-N-dIns、β-D-2’-CH3-核糖C抗性突变株或I-N-dIns β-D-2’-CH3-核糖C-R感染细胞，感染复数为0.1。在1小时吸附后，除去接种物，并用PBS洗涤细胞，接着用2mL新鲜的生长培养基覆盖。对于BVDV I-N-dIns β-D-2’-CH3-核糖C-R而言，在存在或不存在8μMβ-D-2’-CH3-核糖C下制备双份孔。细胞培养物在37℃/5％CO2下温育。在感染后0(吸附期终点)、6、12、24、36、48、60、72小时，将培养物冻/融两次，通过如上所述的转化灶化验定量病毒滴度。
在感染后12小时，野生型病毒后代达到超过104FFU/mL的显著水平，与BVDV完整的生活周期一致，是8-14小时。反之，抗性病毒变体的后代在该时间点仍无法检测到(图3)。抗性病毒的复制在感染后24小时首次检测到。在感染后36小时，抗性病毒的复制效率仍然是小于野生型病毒约100倍。这些数据清楚地证实了β-D-2’-CH3-核糖C抗性BVDV复制明显慢于野生型病毒，特别在感染的早期阶段。这些数据也与图1和2所列出的结果一致。
实施例3评估β-D-2’-CH3-核糖C抗性所选择的BVDV变体(I-N-dIns-β-D-2’-CH3-核糖C-R)较野生型BVDV对β-D-2’-CH3-核糖C更具抗性，因为其在MDBK细胞中在所述化合物长期存在下(至少72天)能稳定地复制达到相当高的水平，并不改变表型和病毒滴度水平。为定量该抗性，使用野生型和变体病毒进行病毒产率减少测定(virus yieldreduction assay)。
为进行病毒产率减少测定，MDBK细胞接种在24孔培养板上(1×105细胞/孔)并在37℃/5％CO2下生长过夜。用BVDV在0.1的感染复数下感染细胞。吸附1小时后，除去接种物，用PBS洗涤细胞，接着用1mL新鲜的生长培养基覆盖，所述培养基包含连续2倍稀释的所述测试化合物(0-32μMβ-D-2’-CH3-核糖C和0-800 IU/mL IntronA)。在37℃/5％CO2下温育48小时后，培养板在-70℃冻/融两次以溶解细胞培养物。通过如上所述的转化灶化验定量细胞培养物中的病毒滴度。对于所述测试化合物而言，50％、90％和4-log有效浓度(平均值±标准差)是基于双份孔的。使用XLFit软件，通过曲线拟合导出EC50、EC90和EC4-log值。所述EC50、EC90和EC4-log是测试化合物分别减少病毒滴度50％、90％和99.99％时的浓度。
传染性的野生型BVDV颗粒的产生被β-D-2’-CH3-核糖C十分有效地抑制，EC50和EC90值分别为0.59±0.12μM和1.49±0.28μM(图4和表4)。在β-D-2’-CH3-核糖C浓度为7.14±1.26μM时，野生型病毒产率减少了4logs，以及在16μM时，病毒滴度下降到检测极限下(＜10FFU/mL)。反之，在高浓度β-D-2’-CH3-核糖C测试时(32μM)，没有观察到对抗性病毒产率的影响。因而，基于通过病毒产率减少测定获得的EC50值(＞32μM对0.59±0.12μM)，I-N-dIns β-D-2’-CH3-核糖C-R病毒较野生型病毒对抑制剂至少多54倍抗性，。
表4BVDV产率减少测定结果

cp＝细胞病变；ncp＝非细胞病变实施例4核酸序列分析造成β-D-2’-CH3-核糖C-抗性表型遗传突变的鉴定基于抑制剂本性，即所述核苷类似物的特性，病毒聚合酶被考虑作为似乎可能的分子靶。因而，我们开始对野生型和β-D-2’-CH3-核糖C-抗性BVDV的NS5B区测序。在用或不用β-D-2’-CH3-核糖C治疗传代8次后，从组织培养物溶菌液中抽提所述病毒RNA(图1)，对完整的NS5B区进行RT-PCR并测序。使用QIAamp病毒RNA迷你型试剂盒(Viral RNA Mini Kit)(QIAGEN)，根据产品说明书从细胞培养物中抽提病毒RNA。使用QIAGEN一步RT-PCR试剂盒(OneStep RT-PCR Kit)转录并扩增完整的NS5B区。使用QIA quickPCR纯化试剂盒(PCR Purification Kit)(QIAGEN)纯化PCR产物，以及在Tufts CoreFacility，Boston，MA的自动化ABI DNA测序仪(Perkin-Elmer)上使用ABIPRISM测序方案进行测序。
使用至少两种独立的RT-PCR产物，对每个区在两个方向都进行测序。当与先前公开的BVDV(I-N-dIns株)全长基因组的序列(Vassilev，V. B.和R.O.Donis.(2000)Virus Res.69(2)95-107)比较时，在野生型病毒中没有发现突变。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)诱导了与增加的细胞内病毒累积相关的细胞凋亡。在I-N-dInsβ-D-2’-CH3-核糖C-R病毒中仅发现一种核苷酸取代1214G至C，在405位氨基酸残基丝氨酸改变为苏氨酸。有趣地，该氨基酸位置是位于推定具有功能的NS5B结构域B(图5)，通过突变分析得到鉴定(Lai V.C.，Kao C.C.，FerrariE.，Park J.，Uss A.S.，Wright-Minogue J.，Hong Z.，和J.Y.Lau.“Mutationalanalysis of bovine viral diarrhea virus RNA-dependent RNA polymerase”J Virol.，1999，73，10129-36)。该结构域也发现于HCV基因组和其它黄病毒基因组的NS5B区中。此外，所述氨基酸位置Ser405在所有的瘟病毒和黄病毒基因组中高度保守。
实施例5对Intron A超敏性在重新感染的MDBK细胞中使用如上所述的病毒产率减少测定法比较野生型I-N-dIns病毒和I-N-dIns β-D-2’-CH3-核糖C-R变体对Intron A的敏感性。再次，我们发现两种病毒之间具有明显差异。Intron A适度抑制野生型病毒，具有119±34.1μM的EC90值，和在最高的药物浓度测试下，具有约1.5log减少的病毒产率(图6)。反之，发现I-N-dIns β-D-2’-CH3-核糖C-R病毒变体对Intron A更加敏感，具有3.15±0.72μM的EC90值和约4log的病毒产率最大减少(图6)。基于EC90值比较的结果，β-D-2’-CH3-核糖C-抗性病毒较野生型BVDV对IntronA更敏感约40倍。
实施例6β-D-2’-CH3-核糖C与Intron A联合治疗Intron A单独治疗或与β-D-2’-CH3-核糖C联合治疗对野生型BVDV的效果在持续感染的MDBK细胞中得到了进一步研究。在一种实验设置中，在用几种抑制剂浓度单次或两次处理7天后(2次传代)，测定病毒滴度。该实验的结果列于表5A和5B中，也见图7和8，总结如下β-D-2’-CH3-核糖C单独治疗，在所述的实验条件下以剂量依赖性方式强烈地抑制BVDV(I-N-dIns株)增殖。用8μMβ-D-2’-CH3-核糖C减少病毒滴度6.2logs(图7)。干扰素α-2b单独治疗具有最小的抗病毒效果(0.1log病毒滴度减少)。用2μMβ-D-2’-CH3-核糖C或2000IU/mL干扰素α-2b单独治疗分别减少病毒滴度1.61logs和0.1log。用同样浓度的联合治疗效果为2.22logs，较计算的累加效应(1.71log)高0.51log。用4μMβ-D-2’-CH3-核糖C或2000IU/mL干扰素α-2b单独治疗分别减少病毒滴度2.06logs和0.1log(表5B，图8)。用同样浓度的联合治疗效果为4.56logs，较计算的累加效应(2.16log)高2.4logs。因而，β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b以协同方式作用来抑制BVDV，具体而言当β-D-2’-CH3-核糖C在4μM浓度下使用时。
表5A.β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b对持续感染的MDBK细胞中BVDV(I-N-dIns株)滴度的影响。数字代表BVDV滴度值，单位FFU/mL。

表5B.β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b对持续感染的MDBK细胞中BVDV(I-N-dIns株)滴度的影响。数字代表BVDV滴度的log值。

在另一种实验设置中，治疗时间延长到10天并在每次传代后(每3-4天)监测病毒滴度(NY-1株)。再次，观察到类似的β-D-2’-CH3-核糖C和干扰素α-2b协同作用的抑制效果(图9)。值得注意的是，当细胞培养物用8μMβ-D-2’-CH3-核糖C与200IU/mL Intron A联合处理时，在处理7天后病毒变得无法检测，以及在进一步传代至少27天后不再出现。这些数据符合先前所述的发现，即在持续感染的细胞治疗后出现的β-D-2’-CH3-核糖C-抗性BVDV变体对Intron A敏感。综上所述，这些数据进一步暗示在用β-D-2’-CH3-核糖C治疗持续病毒感染后，出现的抗性病毒群体可通过用Intron A的后继治疗而被清除。
根据具体的实施方案，本发明业已得到描述。根据在前本发明的详细描述，本发明的变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的。
权利要求
1.一种有效用于治疗宿主中黄病毒感染的药物组合物，其包含有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受载体或稀释剂中，和一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物是直接或间接诱发或与黄病毒突变相关的药物，所述突变所在位置不同于BVDV RNA聚合酶区的核苷酸1214(G至C)或405 Ser至Thr或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCVRNA聚合酶区的282 Ser至Thr。
3.一种有效用于治疗宿主中黄病毒感染的药物组合物，其包含有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受载体或稀释剂中，和干扰素。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述干扰素选自Intron-A(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roferon-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、INFERGEN(干扰素α-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、ALBUFERON、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服α干扰素和干扰素γ-1b。
5.权利要求1-4任一所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘧啶核苷。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C。
7.权利要求5所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-氨基酸前体药物。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-L-缬氨酸前体药物。
9.权利要求1-4任一所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘌呤核苷。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A。
11.权利要求9所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-氨基酸前体药物。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-L-缬氨酸前体药物。
13.权利要求9所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤。
14.权利要求9所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-氨基酸前体药物。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-L-缬氨酸前体药物。
16.权利要求1-4任一所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2；以及碱基(Base)是嘌呤或嘧啶。
17.权利要求16所述的药物组合物，其中碱基选自腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤(其中酰基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基))、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔型嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟代胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮杂嘧啶，包括6-氮杂胞嘧啶、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶，包括5-氟代尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-苄基嘧啶、C5-卤代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔型嘧啶、C5-酰基嘧啶、C5-羟基烷基嘌呤、C5-酰氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。
18.权利要求16所述的药物组合物，其中碱基是分子式 其中G和L各自独立地是CH或N；D是N、CH、C-CN、C-NO2、C-C1-3烷基、C-NHCONH2、C-CONQ11Q11、C-CSNQ11Q11、CCOOQ11、C-C(＝NH)NH2、C-羟基、C-C1-3烷氧基、C-氨基、C-C1-4烷基-氨基、C-二(C1-4烷基)氨基、C-卤素、C-(1，3-噁唑-2-基)、C-(1，3-噻唑-2-基)或C-(咪唑-2-基)；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；E是N或CQ5；W是O、S或NR；R是H、OH、烷基；Q6是H、OH、SH、NH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基或CF3；Q5是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-4烷基氨基、CF3、卤素、N、CN、NO2、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、卤素、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；Q7和Q14各自独立地选自H、CF3、OH、SH、OR、SR C1-4烷基、氨基、C1-4烷基氨基、C3-6环烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；Q11独立地是H或C1-6烷基；Q8是H、卤素、CN、羧基、C1-4烷氧基羰基、N3、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基、NH2、CN、NO2、C1-3烷基、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基，其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；
19.权利要求16所述的药物组合物，其中碱基是分子式 其中T1和T2独立地选自N、CH或C-Q16；Q16、U和Y独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；R4和R5独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；Z是S、SO、SO2、C＝O或NQ20Q20是H或烷基；和V1和V2独立地选自CH或N；
20.权利要求16所述的药物组合物，其中碱基是分子式 其中T3和T4独立地选自N或CQ22；Q22独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；T5是NH；R4和R5独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12独立地选自N或CH；U2是H、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5；Y2是O、S、NH、NR或CQ24Q26，其中R是H、OH或烷基；Q24和Q26独立地选自H、烷基、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5。
21.一种有效用于治疗宿主中黄病毒感染的药物组合物，包含有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；和一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物。
22.权利要求21所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是2’-支链嘧啶核苷的2’，3’和/或5’-前体药物。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的2’，3’和/或5’-前体药物。
24.权利要求23所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-氨基酸前体药物。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-L-缬氨酸前体药物。
26.权利要求21所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是2’-支链嘌呤核苷的2’，3’和/或5’-前体药物。
27.权利要求26所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的2’，3’和/或5’-前体药物。
28.权利要求27所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-氨基酸前体药物。
29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-L-缬氨酸前体药物。
30.权利要求26所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的2’，3’和/或5’-前体药物。
31.权利要求30所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的3’-氨基酸前体药物。
32.权利要求31所述的药物组合物，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的3’-L-缬氨酸前体药物。
33.一种用于治疗宿主中黄病毒感染的方法，包含将治疗有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给予所述宿主。
34.权利要求33所述的方法，其中所述药物是直接或间接诱发或与黄病毒突变相关的药物，所述突变所在位置不同于BVDV RNA聚合酶区的核苷酸1214(G至C)或405 Ser至Thr或HCV基因组的核苷酸8443(G至C)或HCV RNA聚合酶区的282 Ser至Thr。
35.一种用于治疗宿主中黄病毒感染的方法，包含将治疗有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，与干扰素联合和/或交替给予所述宿主。
36.权利要求35所述的方法，其中所述干扰素选自Intron-A(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roferon-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、INFERGEN(干扰素α-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、ALBUFERON、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服α干扰素和干扰素γ-1b。
37.权利要求33-36任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘧啶核苷。
38.权利要求37所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C。
39.权利要求37所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-氨基酸前体药物。
40.权利要求39所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-L-缬氨酸前体药物。
41.权利要求33-36任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘌呤核苷。
42.权利要求41所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A。
43.权利要求41所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-氨基酸前体药物。
44.权利要求43所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-L-缬氨酸前体药物。
45.权利要求41所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤。
46.权利要求41所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-氨基酸前体药物。
47.权利要求46所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-L-缬氨酸前体药物。
48.权利要求33-36任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2；以及碱基(Base)是嘌呤或嘧啶。
49.权利要求48所述的方法，其中碱基选自腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤(其中酰基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基))、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔型嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟代胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮杂嘧啶，包括6-氮杂胞嘧啶、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶，包括5-氟代尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-苄基嘧啶、C5-卤代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔型嘧啶、C5-酰基嘧啶、C5-羟基烷基嘌呤、C5-酰氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。
50.权利要求49所述的方法，其中碱基是分子式 其中G和L各自独立地是CH或N；D是N、CH、C-CN、C-NO2、C-C1-3烷基、C-NHCONH2、C-CONQ11Q11、C-CSNQ11Q11、CCOOQ11、C-C(＝NH)NH2、C-羟基、C-C1-3烷氧基、C-氨基、C-C1-4烷基-氨基、C-二(C1-4烷基)氨基、C-卤素、C-(1，3-噁唑-2-基)、C-(1，3-噻唑-2-基)或C-(咪唑-2-基)；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；E是N或CQ5；W是O、S或NR；R是H、OH、烷基；Q6是H、OH、SH、NH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基或CF3；Q5是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-4烷基氨基、CF3、卤素、N、CN、NO2、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、卤素、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基；其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；Q7和Q14各自独立地选自H、CF3、OH、SH、OR、SR C1-4烷基、氨基、C1-4烷基氨基、C3-6环烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；Q11独立地是H或C1-6烷基；Q8是H、卤素、CN、羧基、C1-4烷氧基羰基、N3、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基、NH2、CN、NO2、C1-3烷基、NHCONH2、CONQ11Q11、CSNQ11Q11、COOQ11、C(＝NH)NH2、1，3-噁唑-2-基、1，3-噻唑-2-基或咪唑-2-基，其中烷基是未取代的或为一至三种独立地选自卤素、氨基、羟基、羧基和C1-3烷氧基的基团所取代；
51.权利要求49所述的方法，其中碱基是分子式 其中T1和T2独立地选自N、CH或C-Q16；Q16、U和Y独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；R4和R5独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；Z是S、SO、SO2、C＝O或NQ20；Q20是H或烷基；和V1和V2独立地选自CH或N；
52.权利要求49所述的方法，其中碱基是分子式 其中T3和T4独立地选自N或CQ22；Q22独立地选自H、OH、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的链烯基、取代的或未取代的炔基、环烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5、Br-乙烯基、-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-芳基、-O-芳烷基、-O-酰基、-O-环烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、NH-酰基、N-芳基、N-芳烷基、NH-环烷基、SH、S-烷基、S-酰基、S-芳基、S-环烷基、S-芳烷基、CN、N3、COOH、CONH2、CO2-烷基、CONH-烷基、CON-二烷基、OH、CF3、CH2OH、(CH2)mOH、(CH2)mNH2、(CH2)mCOOH、(CH2)mCN、(CH2)mNO2、(CH2)mCONH2、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、C1-6硫代烷基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或-NHC(＝NH)NH2；T5是NH；R4和R5独立地选自氢、酰基(包括低级酰基)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12独立地选自N或CH；U2是H、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5；Y2是O、S、NH、NR或CQ24Q26，其中R是H、OH或烷基；Q24和Q26独立地选自H、烷基、直链、支链或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、氯、溴、氟、碘、OR4、NR4R5或SR5。
53.一种用于治疗黄病毒科病毒感染的患者的方法，所述黄病毒科病毒具有2’-支链核苷抗性，包含给予有效量的干扰素，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，任选地以基本上消除病毒载量的方式。
54.一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含将有效量的2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；与一种或多种直接或间接诱发黄病毒突变的药物，所述突变所在位置不同于导致RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变，和/或一种或多种与上述突变相关的药物联合和/或交替给药。
55.权利要求54所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是2’-支链嘧啶核苷的2’，3’和/或5’-前体药物。
56.权利要求55所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的2’，3’和/或5’-前体药物。
57.权利要求56所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-氨基酸前体药物。
58.权利要求57所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-L-缬氨酸前体药物。
59.权利要求54所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是2’-支链嘌呤核苷的2’，3’和/或5’-前体药物。
60.权利要求59所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的2’，3’和/或5’-前体药物。
61.权利要求60所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-氨基酸前体药物。
62.权利要求61所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-L-缬氨酸前体药物。
63.权利要求59所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的2’，3’和/或5’-前体药物。
64.权利要求63所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的3’-氨基酸前体药物。
65.权利要求64所述的方法，其中所述2’-支链核苷的2’，3’和/或5’-前体药物是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基-嘌呤的3’-L-缬氨酸前体药物。
66.一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予所述患者有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的盐或前体药物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)化验所述患者血液以对从野生型到病毒突变体的血清转化进行测试；(c)给予有效量的干扰素；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
67.一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的盐或前体药物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒样品；(c)测定所述病毒的复制适合度；(d)测定是否样品中所述病毒的复制适合度小于野生型病毒的复制适合度，其表明具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性；(e)给予那些具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的患者有效量的干扰素。
68.一种用于治疗黄病毒感染的患者的方法，包含(a)给予有效量的2’-支链核苷，或其药学上可接受的盐或前体药物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；(b)从所述患者处获得病毒培养物样品；(c)培养所述样品并比较所述样品与野生型病毒之间的噬菌斑生长；(d)测定是否所述样品的噬菌斑生长小于野生型的噬菌斑生长，其表明具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性；(e)给予那些具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的患者有效量的干扰素。
69.权利要求66-68任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘧啶核苷。
70.权利要求69所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C。
71.权利要求69所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-氨基酸前体药物。
72.权利要求71所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖C的3’-L-缬氨酸前体药物。
73.权利要求66-68任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是2’-支链嘌呤核苷。
74.权利要求73所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A。
75.权利要求73所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-氨基酸前体药物。
76.权利要求75所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖A的3’-L-缬氨酸前体药物。
77.权利要求73所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤。
78.权利要求73所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-氨基酸前体药物。
79.权利要求78所述的方法，其中所述2’-支链核苷是β-D-2’-CH3-核糖-6-N-甲氨基嘌呤的3’-L-缬氨酸前体药物。
80.权利要求66-68任一所述的方法，其中所述2’-支链核苷是分子式 或其药学上可接受的前体药物和/或盐，其中R1、R2和R3独立地是H、磷酸根(包括单、二或三磷酸根和稳定的磷酸根前体药物)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)；磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)；苄基，其中苯基任选为一个或多个与本文给定的芳基的定义中所描述的取代基所取代；脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或药学上可接受的离去基团，当体内给予时，其提供了其中R1、R2或R3独立地是H或磷酸根的化合物；和R4是氢、羟基、烷基(包括低级烷基)、叠氮基、氰基、链烯基、炔基、Br-乙烯基、-C(O)O(烷基)、-C(O)O(低级烷基)、-O(酰基)、-O(低级酰基)、-O(烷基)、-O(低级烷基)、-O(链烯基)、氯、溴、氟、碘、NO2、NH2、-NH(低级烷基)、-NH(酰基)、-N(低级烷基)2或-N(酰基)2；以及碱基(Base)是嘌呤或嘧啶。
81.一种用于鉴定怀疑包含具有2’-支链核苷抗性的黄病毒的样品的方法，包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；(c)检测所述探针与所述序列的杂交。
82.一种用于鉴定怀疑包含具有2’-支链核苷抗性的黄病毒的样品的方法，包含(a)将含有黄病毒核酸序列的样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷的杂交。
83.一种用于鉴定怀疑包含具有2’-支链核苷抗性的黄病毒的样品的试剂盒，包含(a)一含有黄病毒核酸序列的样品和一可检测的寡核苷酸探针，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸的密码子互补的序列；(b)一种用于检测所述探针与所述序列杂交的工具；和(c)任选地具有指导的材料。
84.一种用于鉴定怀疑包含具有2’-支链核苷抗性的黄病毒的样品的试剂盒，包含(a)一含有黄病毒核酸序列的样品和一可检测的寡核苷酸探针，所述探针具有与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)一种用于检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷的杂交的工具；和(c)任选地具有指导的材料。
85.一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷抗性的黄病毒存在的方法，包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与编码黄病毒RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中丝氨酸的密码子互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与所述序列的杂交以确定具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的黄病毒的存在。
86.一种用于诊断患者中具有2’-支链核苷抗性的黄病毒存在的方法，包含(a)获得怀疑含有黄病毒核酸序列的样品；(b)将所述样品与可检测的寡核苷酸探针接触，所述探针具有与BVDVRNA聚合酶区核苷酸1214处的胞苷或HCV核苷酸8443处的胞苷互补的序列；(b)容许所述探针与所述序列杂交；和(c)检测所述探针与BVDV RNA聚合酶区核苷酸1214处的或HCV核苷酸8443处的胞苷杂交以确定具有β-D-2’-CH3-核糖C抗性的黄病毒的存在。
87.权利要求1-32任一所述的药物组合物用于宿主中黄病毒感染治疗的用途。
88.干扰素，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，用于宿主中具有2’-支链核苷抗性的黄病毒感染治疗的用途。
89.权利要求86所述的用途，其中干扰素选自Intron-A(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roferon-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、INFERGEN(干扰素α-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、ALBUFERON、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服α干扰素和干扰素γ-1b。
90.权利要求1-32任一所述的药物组合物在制造用于宿主中黄病毒感染治疗的药物中的用途。
91.干扰素，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，在制造用于宿主中具有2’-支链核苷抗性的黄病毒感染治疗的药物中的用途。
92.权利要求91所述的用途，其中干扰素选自Intron-A(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇缀合的干扰素α-2b)、Roferon-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇缀合的干扰素α-2a)、INFERGEN(干扰素α-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、ALBUFERON、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服α干扰素和干扰素γ-1b。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗黄病毒感染的方法，包括将2′－支链核苷，或其药学上可接受的前体药物和/或盐，与一种直接或间接诱发病毒基因组中突变或与上述突变相关的药物联合或交替给予需要治疗的人，所述突变所在位置不同于导致在RNA聚合酶区结构域B的高保守连续序列XRXSGXXXT中从丝氨酸改变为不同的氨基酸的核苷酸突变。本发明也包括一种检测黄病毒突变株的方法和一种对其治疗的方法。
文档编号C07K14/18GK1849142SQ200380108747
公开日2006年10月18日 申请日期2003年11月17日 优先权日2002年11月15日
发明者让-皮埃尔·索马多西, 波罗·拉科拉, 戴维·斯坦德林, 瓦迪姆·比奇科, 曲林 申请人:埃迪尼克斯(开曼)有限公司, 卡利亚里大学