缺氧条件下的蛋白质分离方法

专利名称：缺氧条件下的蛋白质分离方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质分离方法。更特别地，本发明提供了分离其天然构象中含有二硫键的蛋白质的方法。
背景技术：
人的肽激素胰岛素控制进食和禁食过程中血液中的葡萄糖水平并且通过肝脏和脂肪组织细胞的细胞表面受体发挥作用。除了控制葡萄糖的吸收、贮藏和产生之外，胰岛素还尤其参与脂类的产生和分解控制。
胰岛素供应不足导致血液中的葡萄糖浓度升高(高血糖症)，并且以慢性的形式通过糖尿病(DM)的典型症状显示。每天给患糖尿病的病人施用胰岛素。
成熟的人胰岛素是由通过两个链间二硫桥连接的A(alpha)链和B(beta)链组成的肽。第三个二硫桥连接A链的两个残基。在生物合成前体胰岛素原中，A链和B链通过C肽互相连接，C肽的作用是帮助A片段和B片段之间形成正确的二硫桥并且使胰岛素原分子正确折叠。在成熟的最后阶段，蛋白水解酶切割特异性氨基酸残基释放C肽从而形成成熟的胰岛素。
目前尤其以表达于例如大肠杆菌和酵母中的胰岛素原样多肽形式制造生物合成的重组人胰岛素(参见例US 5,593,860)。在大多数情况下，胰岛素原以一种融合蛋白质或重组杂合物的形式被生产出来，其中，胰岛素原通过甲硫氨酸残基与异源蛋白(如人铜/锌超氧化物歧化酶(hSOD))交联。通常地，这些杂合物以细胞内沉淀的蛋白质或包涵体的形式积聚在重组细胞中。
在制造重组胰岛素原的过程中，细胞裂解后离心得到的包涵体，用低浓度的去污剂或变性剂洗涤。重复这种处理以增加所需蛋白质的纯度。为了使分子间疏水作用和不正确二硫键的形成最小化，洗涤后的包涵体溶解在变性剂，如包括还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇的尿素或盐酸胍溶液中，并且通过沉淀回收。
为了从异源蛋白中释放胰岛素原多肽，通常用溴化氰(CNBr)分离和切割杂合物。胰岛素原通过氧化亚硫酸盐解被进一步修饰成胰岛素原S-磺酸盐(参见例如EP 0 055 945和EP 0 196 056)。然后在还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇等或氧化还原系统如谷胱甘肽将胰岛素原S-磺酸盐进一步纯化和折叠为天然构象。胰岛素原转化为胰岛素，也就是去除C肽，通过胰蛋白酶和羧肽酶B的联合作用完成。最后利用例如反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化胰岛素和任选结晶。
在整个分离过程中，从重组细胞裂解直到胰岛素原正确折叠，包含在(融合)蛋白质中的半胱氨酸残基的游离硫醇基，可能形成不正确或非特异性的分子内或分子间二硫桥。这导致混杂的肽和无活性的激素或所需蛋白质和污染蛋白质形成‘聚集体’(US 6,150,134)。因此，或者应该封闭游离的硫醇基以防止形成不正确的二硫桥或者程序应该包括选择性切割不正确的二硫键。
二硫键切割可尤其通过以下方法完成a)通过半胱磺酸氧化或过甲酸处理将半胱氨酸残基修饰为半胱磺酸；b)通过亚硫酸盐解将半胱氨酸修饰为S-磺基-半胱氨酸()；c)利用某些还原剂，如膦或硫醇的还原作用(参见例EP 0 379 162)。
然而，蛋白质分离后防止形成不正确的二硫键优于使用“氧化-变换(oxido-shuffling)”剂，并且为了达到这个目的，最常见的是，再一次使用几种还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、E-巯基乙胺或巯基乙酸。
然而，使用所有上述还原剂造成的问题是它们引起中毒的危险、它们很昂贵，以及它们污染产品需要额外纯化。
因此，合成重组胰岛素原的传统方法被证实不甚满意因为它包括了复杂的溶解和磺化、纯化、浓缩步骤，其中胰岛素原无效率地进行重折叠，导致所需蛋白质产率减少。
相应地，需要一种改进方法以有效和少污染的方式分离天然构象中含有二硫键的蛋白质。
发明概述本发明人现在发现在含有二硫键的蛋白质分离中还原剂的使用可以通过在基本缺氧的气氛下实施所述分离来避免或至少相当程度地减少。
本发明提供了一种分离天然构象中含有二硫键的蛋白质的方法，所述方法包括在基本缺氧的条件下分离所述蛋白质。
利用本发明方法，现在可以不需要使用令人不快的还原剂从环境中提取和分离含有二硫键的蛋白质。本发明方法的一个优点是不再需要从被分离和被纯化的蛋白质产物中提取此类还原剂，因而使分离步骤更有效率。而且，本发明方法防止蛋白质混杂构象的形成并且产生高产率的处于稳定的天然构象的蛋白质。
附图描述

图1是本发明方法包括的主要程序步骤的示意流程图。
图2图解说明实施例2中所描述的喷射40mL分离的包涵体悬浮液等分试样的影响。
发明详述本文使用的术语“纯化”或“将……纯化”和“分离”和“将……分离”被定义为从成分的混合物中，例如从重组细胞的培养物中，释放和获得单个成分例如某一特定的大分子种类的方法。特别地，本文的分离步骤包括收获和裂解细胞，从由所述裂解得到的粗细胞提取物中提取特定蛋白质并且可能进一步包括从其他细胞成分例如核酸或多糖中分离亚细胞结构例如包含所需蛋白质的包涵体的各种步骤。更特别地，本文的纯化程序包括以一种相当纯的方式分离蛋白质的过程，也就是在分离时使其免于进一步杂质污染。
“被分离的”和“被纯化的”是指从其自然环境中分离出来并且是约60％至约99％，优选地80％至99％没有与之自然结合的其他成分的任何分子或化合物。
本文使用的术语“重组的”是指重组地或合成地产生的蛋白质或核酸结构，例如，在蛋白质的情况下，通过宿主细胞中与特定载体或质粒关联的指定核酸元件系列或表达盒的RNA转录本的翻译产生。本文使用的术语“重组的”不包括由于自然发生的事件(如，自发性突变、自然转化/转导/转座)例如那些没有故意的人为干预而发生的事件造成的细胞或载体的改变。
“宿主细胞”是指一种细胞，它包含载体或表达盒并支持其复制和/或表达。宿主细胞可能是原核细胞例如大肠杆菌，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物、植物细胞或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是细菌或原核细胞。生产胰岛素的一种特别优选的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，优选大肠杆菌菌株Sφ733。
正如本文所使用的，“载体”包括意指一种用于转染宿主细胞并可插入多核苷酸的核酸。载体通常是复制子。
本文使用的术语“蛋白质”是指多肽或其任何部分。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物而不是指特定长度的产物；因此，多肽的定义中包括了肽、寡肽和蛋白质。这个术语也不是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化作用、磷酸化作用等等。定义中包括的是，例如，含有一个或多个氨基酸(包括，例如，非天然氨基酸，等)类似物的多肽、有取代键的多肽、以及本领域已知的修饰，既包括自然发生的也包括非自然发生的修饰。
本文使用的术语“重组蛋白质”是指(1)利用重组DNA技术连接的不同来源的DNA分子组合表达产生的半合成或合成起源的多肽；(2)半合成或合成起源的多肽，凭借其起源或处理，其不再与自然状态下关联的蛋白质的全部或部分关联；(3)与其自然状态下连接的多肽以外的多肽连接的半合成或合成起源的多肽；或(4)在自然状态下不存在的半合成或合成起源的多肽。
术语“包涵体”和“折射体”是指由单个蛋白质非特异性沉淀产生的细胞内聚集体。包涵体和折射体的形成是细胞质中高水平的蛋白质产生的常见结果。它们是通过折叠中的中间产物而不是天然的或未折叠的蛋白质积聚形成。包涵体或折射体可由以下任一或全部原因形成所表达多肽的异源性；高蛋白质表达率；非共价结合导致的相对高数量的疏水蛋白质分子间聚集；伴侣蛋白如辅助蛋白缺乏或不能充分获得。
本文使用的术语“二硫键”被定义为由半胱氨酸残基氧化形成的多肽链间或一条多肽链的多个部分间的一个或多个交联。由此产生的二硫化物被称为胱氨酸。
本文使用的术语“基本缺氧”被定义为氧气极度不足或相当程度的缺乏并且可能的变动范围从空气中正常遇到的氧气水平的减少，到完全无氧条件的例如气氛、液体环境或组织。
“蛋白质构象”是指蛋白质特征性的三维形态，包括肽链的二级结构(螺旋、折叠)、超二级结构(基序)、三级结构(结构域)和四级结构(多体蛋白)。
本文使用的术语“天然构象”是指以生物学活性形式存在于活系统中的蛋白质特征性的状态、构成、形状或结构，其中它折叠为C.B.Anfinsen定义的(Nobe1 Lecture，1972年12月11日)总体吉布斯自由能最低。
“重折叠”是指在通过二硫键的还原性切割完全变性后蛋白质转化成天然构象蛋白质的体外过程。
除了巯基氧化还原酶外，含有二硫键的蛋白质通常不存在于细胞质中。然而，从细胞质输出的蛋白质，例如胰岛素和碱性磷酸酶，典型地含有二硫键。这通常归因于细胞质和细胞外环境间还原电位的差异，其中，细胞质中硫氧还蛋白还原酶的存在被认为构成一个重要的因素。有几项研究表明需要细胞活性和硫氧还蛋白还原酶活性来维持细胞外蛋白质以一种无活性和还原的形式存在于细胞质中，这些蛋白质的天然构象中将含有氧化的二硫键(Derman等，1993.Science 2621744-47；Derman和Bechwith.1995.J.Bacteriol.1773764-70)。
裂解(或细胞死亡或由于培养基耗尽停止生长)后硫氧还蛋白还原酶不再能使蛋白质中的半胱氨酸残基保持还原形式并且伴随着半胱氨酸残基氧化形成二硫键，蛋白质随意折叠开始。这个过程经常导致异常折叠或混杂蛋白。
为了从重组材料中获得天然构象的、含有二硫键存在的蛋白质纯提取物，例如胰岛素，关键步骤是形成正确的二硫键。
天然构象中含有二硫键的蛋白质分离的传统方法依赖于还原剂的存在。目前已发现，从硫氧还蛋白还原酶的还原能力减弱时直到蛋白质能够被稳定或提供了正确折叠的条件时应用缺氧条件，可以有效地防止混杂蛋白质的形成。
在第一个方面，本发明提供了一种天然构象中含有二硫键的蛋白质的分离方法，包括在基本缺氧的气氛下分离所述蛋白质。
使用本发明方法将得到分离的蛋白质产物，它基本上没有如上所述的污染的还原剂，其中蛋白质的大且实质性的部分都是有活性的并且处于天然构象状态并且有生物学活性。
可用于本发明方法的适宜的蛋白质基本上是天然构象中含有二硫键的蛋白质，但其他的肽也可能利用本发明方法分离。举例来说，非常合适的蛋白质是肽类激素如胰岛素、加压素、促生长素抑制素、善得定(octreotide)、内皮素I、knottin样蛋白，酶例如核糖核酸酶，表位例如Cn2蝎毒素的表位，芋螺毒素，和/或LDL受体表位模块。
通常地，富二硫化物的蛋白质、肽或其片段，或来源于病毒、细菌、真菌(包括酵母)、植物、动物或人类，对在例如药物设计中结构-活性关系研究很有价值。因此，对于这个科学领域，本发明更有效地获得天然构象的此类蛋白质的可能性有着重大的利益。
本发明方法适用于分离任何来源的天然构象中含有二硫键的蛋白质，例如与病毒或朊病毒结合的或由原核生物，例如细菌，产生的，或由真核生物，例如酵母、真菌、植物、动物或人类细胞产生的。优选的所述蛋白质是细胞外蛋白质，它在表达于生产的生物体细胞的胞质溶胶中时以还原形式或状态存在并且在氧化状态时获得其天然构象。
技术人员能够确定含有二硫键的蛋白质是否以天然构象正确地(重)折叠。举例来说，此类确定可能包括通过HPLC分析测量正确折叠的、氧化的和消化的赖氨酸-精氨酸-胰岛素中间产物。
本发明方法优选用于分离重组生产的、天然构象中含有二硫键的蛋白质。重组生产的蛋白质既可以直接表达也可以作为融合蛋白质表达。表达的蛋白质的检测通过本领域已知的方法例如，举例来说，放射免疫测定法、蛋白质印迹技术或免疫沉淀法完成。
生产或(生物)合成(重组)蛋白质的方式与本发明方法无关。重组蛋白质原则上可以用本领域已知的任何方法制备，举例来说，用被用于制备重组蛋白质的方法，例如用重组酵母，更优选用重组细菌，最优选用重组大肠杆菌细胞，例如US 5,593,860中所述的那些来制备。在许多，但不必然是所有实例中，此类方法会导致形成融合蛋白质或杂合物。因此，本发明方法非常适用于分离融合蛋白质。
在另一个优选的实施方案中，本方法被用于分离可在包涵体中生产的蛋白质。在一个最优选的实施方案中，本发明方法被用于分离由重组大肠杆菌菌株Sφ733产生的包涵体中含有的胰岛素前体蛋白，该菌株携带和表达质粒pDBAST-RAT-N 71(Bio-Technology GeneralLtd.，Rehovot，Israel)，它来源于pDBAST-LAT载体(见US 6,001,604或WO96/20724)。
本方法包括了实施分离蛋白质的传统方法，其中本方法基本上在缺氧条件下进行。在本发明方法中，最初的收获、裂解和蛋白质提取步骤在缺氧条件下进行而不使用上述还原剂。
本发明方法包括在基本缺氧条件下分离蛋白质。优选地，通过给分离环境提供缺氧气氛，例如氮气氛、二氧化碳气氛、或氦气氛或其他惰性气体气氛，获得缺氧条件。最优选地，在分离天然构象中含有二硫键的蛋白质的过程中本发明方法利用N2气氛来提供缺氧条件。
优选地，本发明方法采用的缺氧条件是这样一种条件，它等于含0-1体积％，优选0-0.5体积％，更优选0-0.05％O2的气氛，或与所述气氛平衡的液体。在一个最优选的实施方案中，缺氧条件是等于含有基本上0体积％O2的气氛，或与所述气氛相平衡的液体的条件。
简而言之，本发明用于分离天然构象中含有二硫键的蛋白质的方法不包括细胞生长和/或蛋白质本身的生产。然而，本发明方法在生产蛋白质的材料，例如含有蛋白质的生产细胞上进行，从收获细胞开始，包括细胞收获后的洗涤，直到分离的蛋白质通过冷冻，例如，通过冷冻分离的包涵体而稳定化。
更具体地，当细胞的胞质溶胶中的还原电位作为硫氧还蛋白还原酶活性降低的后果而减小时，例如，当细胞停止生长时，例如，在收获和收获后洗涤时，细胞优选已经被置于缺氧条件下。缺氧条件优选地保持在整个过程中直至蛋白质开始重折叠。
本发明方法可适宜地包括细胞裂解等步骤，例如通过酶的预处理，接着破碎或断裂细胞，例如，利用超声处理、弗式压碎器处理或高剪切混合例如Ultra-Turrax处理，条件是所述裂解在缺氧条件下进行。本发明方法的更进一步的步骤可能包括在缺氧条件下从胞质溶胶中分开或分离包涵体，如果所需蛋白质在其中产生的话。这个步骤后可以贮藏分离的包涵体并且稳定包含在其中的蛋白质，例如通过冷冻(举例来说，在-20℃)，或冷藏(例如在2-8℃)。蛋白质分离和纯化中进一步的加工步骤不需要在缺氧条件下进行。
在储藏后，或直接在上述分离步骤后，被分离和任选进一步纯化的蛋白质可被重折叠为天然构象。一般地，为了避免形成非天然的分子间二硫桥，对于含有二硫键的蛋白质，此类重折叠在稀释溶液中进行。一个非常适合重折叠胰岛素的方法包括将蛋白质溶解在含有NaHCO3和EDTA、pH值为12.0的缓冲液中，将pH值降至11.2，用木炭处理和过滤。通过向溶液施加空气以氧化二硫化物来折叠多肽。
对于融合产物，可利用适当的蛋白水解酶随后消化融合蛋白来释放所需重组蛋白质。本发明方法可能进一步包括利用本领域已知的标准技术纯化蛋白质至基本上纯，包括去污剂溶解、用硫酸铵类物质选择性沉淀、柱层析、免疫纯化法、亲合层析，以及其他方法。举例来说，参见R.Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice，Springer-VerlagNew York(1982)；Deutscher，Guideto Protein Purification，Academic Press(1990)。
现在通过下列非限制性的实施例来例证本发明。
实施例发酵后通过关闭压缩空气的加入、除去剩余压力并且用氮气冲洗培养基和处理液上方的顶端空间，培养液被置于缺氧环境。在所有的后续处理步骤中持续用氮冲洗顶端空间，这些步骤包括细胞的收获和洗涤、细胞裂解、以及包涵体的另外处理。氮冲洗也应用于加工设备例如容器、收集器以及辅助设备例如离心机、匀浆器、以及过滤器。利用固定管道进行氮气冲洗。
实施例1两个相同的450L规模的产生重组人胰岛素前体的生产菌株Sφ733/pDBAST-RAT-N-7-1的培养物是从相同工作细胞库安瓿的内容物生长起来的。随后进行发酵过程并且利用验证有效的分析程序分析两个培养物的样品。结果表明两种培养物以非常相似的方式进行并且所得到的吸光度、干重、蛋白质和相对的胰岛素前体最终浓度显示差异为8％或更低。
发酵后，两种培养物都经历了相同的包涵体(IB)回收程序，该程序图解地显示在图1的流程图中。
在IB回收程序过程中只有后一培养物采用了氮气覆盖；前一培养物在有氧环境中处理。
为了用HPLC测定正确折叠的胰岛素前体蛋白的量，在IB回收后将所得到的包涵体产物进行小规模重折叠和纯化。
分析表明每升有氧处理的培养物，正确氧化、折叠和消化的胰岛素前体的产率与缺氧处理的培养物的产率相比仅为8.1％。
实施例2我们已能够证实不同气氛条件对胰岛素肽分离的影响。利用将缺氧回收的包涵体悬浮液分成3个40mL的等分试样的实验证明这点。分别用相同流速的氮气、压缩空气、或氧气喷射这些等分试样16个小时。接着，将悬浮液和起始材料进行小规模重折叠和纯化以测量可得到的胰岛素的量。分析显示，用压缩空气或氧气喷射包涵体悬浮液导致正确折叠的蛋白质产率急剧减少，而用氮气喷射了16个小时没有对产率产生这种影响。这证实，使用本发明方法，当在处理过程中从胰岛素前体包涵体排除氧气时正确折叠的蛋白质的产率可以显著增加。实验结果显示于图2。
权利要求
1.天然构象中含有二硫键的蛋白质的分离方法，所述方法包括在基本缺氧的条件下分离所述蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其中所述基本缺氧的条件包括基本缺氧的气氛。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述蛋白质是作为重组细胞的包涵体存在的重组杂合蛋白。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的分离包括收获和破碎所述细胞，分离所述包涵体和/或使分离的产物稳定。
5.根据任何一个前述的权利要求的方法，其中所述的蛋白质是前体蛋白。
6.根据任何一个前述的权利要求的方法，其中所述的蛋白质是胰岛素。
7.根据任何一个前述的权利要求的方法，其中所述的基本缺氧的气氛是氮气氛。
8.根据任何一个前述的权利要求的方法，其中所述的重组细胞是携带和表达质粒pDBAST-RAT-N-7-1的大肠杆菌菌株Sφ733的细胞。
全文摘要
本发明涉及一种天然构象中含有二硫键的蛋白质的分离方法。基本上，本发明方法使还原剂例如β－巯基乙醇或二硫苏糖醇在蛋白质分离方法中的使用过时。本发明方法特别适合从重组细胞中分离前体蛋白例如胰岛素原。
文档编号C07K14/62GK1745092SQ200480003097
公开日2006年3月8日 申请日期2004年1月29日 优先权日2003年1月31日
发明者P·范德梅耶丹, G·W·K·范德丹姆, M·H·M·艾平克, R·W·瓦瑟纳尔 申请人:阿克佐诺贝尔公司