专利名称：作为ep的制作方法
背景技术：
青光眼是一种眼睛变性疾病，因眼内压太高而不能正常发挥眼睛功能。结果，可能发生视神经乳头损害并导致不可逆的视觉功能丧失。如果不治疗，青光眼将可能最终导致失明。现在大多数眼科医师认为高眼压症，即无视神经乳头损害的眼内压增高病症或特征性青光眼视野缺陷病症，仅表现在青光眼发作初期。
以前用于治疗青光眼的许多药物经证实并不令人满意。现在治疗青光眼的方法包括使用治疗药物如匹鲁卡品、碳酸酐酶抑制剂、β-阻断剂、前列腺素等。然而，这些治疗药物常常引起不需要的局部效应。显然，目前有几种用于治疗青光眼和眼内压增高的治疗药物，但是这些治疗药物的功效方面和副作用方面并不理想。因此，仍需要有副作用小或无副作用的新且有效的治疗。
发明概要本发明涉及前列腺素E2受体EP4亚型的激动剂和它们的用途或制剂，它们用于治疗青光眼和涉及患者眼睛眼内压增高的其它病症。具体来讲，本发明涉及1，6-二取代哌啶-2-酮、3，4-二取代1，3-噁嗪烷-2-酮、3，4-二取代1，3-噻嗪烷-2-酮和4，5-二取代吗啉-3-酮衍生物系列化合物，以及它们治疗眼病和提供对哺乳动物物种特别是人眼睛的神经保护作用的用途。更具体地讲，本发明涉及具有结构式I的新EP4激动剂或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物
式I其中U表示H、C1-3烷基或当W为＝O时不存在；W表示0H或＝O，条件是当W为＝O时U不存在；z表示(CH2)n或CH＝CH；R1表示(CH2)p羟基、((CH2)pCO2R10或(CH2)n杂环基，所述杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代且任选包含酸性羟基；R2独立表示C1-10烷基、(CH2)mC6-10芳基、(CH2)mC5-10杂环基、(CH2)mC3-10杂环烷基、(CH2)mC3-8环烷基，所述烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代；R3和R4独立表示氢、卤素或C1-6烷基；R6表示氢或C1-4烷基；R10表示氢、C1-10烷基、C3-10环烷基、(CH2)pC6-10芳基、(CH2)pC5-10杂环基；Ra表示C1-6烷氧基、C1-6烷基、CF3、硝基、氨基、氰基、C1-6烷基氨基、卤素，或Ra还表示芳基和杂环基、SCl-6烷基、SC6-10芳基、SC5-10杂环基、OC6-10芳基、OC5-10杂环基、CO2R6、CH2OC1-6烷基、CH2SCl-6烷基、CH2O芳基、CH2S芳基； 表示双键或单键；p表示0-3；n表示0-4；且m表示0-8。
通过整体验证本发明可实现本发明的该方面和其它方面。
发明详述本文详细描述的本发明使用下文所定义的术语，除非另外说明。
本文使用的术语“治疗有效量”指本发明的式IEP4亚型受体激动剂或其他活性物质根据所需治疗方案给予的量，这个量给予后可引起所需的治疗效果或反应，或提供所需益处。涉及治疗反常骨吸收的优选治疗有效量为刺激骨骼生成的量。同样地，涉及治疗高眼压症或青光眼的优选治疗有效量为有效降低眼内压和/或治疗高眼压症和/或青光眼的量。
本文中使用的“药学上可接收的”一般指从毒性角度或安全角度考虑适用于给予哺乳动物包括人。
术语“前药”指药物前体化合物，在给药和吸收后，其在体内通过一些代谢途径释放要求保护的药物。本发明化合物前药的非限定性实例可为吡咯烷酮基团的酸，其中酸官能团的结构使其在给予患者后容易水解。示例性前药包括非麻醉剂、镇痛药/非甾体、抗炎药物的乙酸衍生物，具有典型连接至环系统的游离CH2COOH基团(其可以任选为药学上可接收的盐形式，如-CH2COO-Na+)，优选连接至芳环系统或杂芳环系统。
术语“烷基”指包含1-10个碳原子由单价烷烃(碳氢化合物)衍生的基团，除非另外定义。它可为直链、支链或环状。优选的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、环戊基和环己基。当描述用烷基取代烷基时，其与“支链烷基”互换使用。
环烷基为一种含有3-15个碳原子且碳原子间无交替双键或共振(resonating)双键的烷基。它可包含1-4个稠合环。环烷基的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
烷氧基指C1-C6烷基-O-，且烷基如本文所述任选取代。烷氧基的实例为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基及其异构基团。
卤素(卤基)指氯、氟、碘或溴。
芳基指芳环如苯基、取代苯基等，以及稠环如萘基、菲基等。因此，芳基含至少一个有至少6个原子的环，可存在最多可达5个这样的环，其中含最多可达22个原子，且在邻近碳原子间或合适的杂原子间有交替(共振)双键。优选的芳基为苯基、萘基和菲基。同样，芳基可按定义取代。优选的取代芳基包括苯基和萘基。
术语“杂环烷基”指有3-10个碳原子的环烷基(非芳族)且环中的一个碳原子被选自O、S或N的杂原子替换，而且其中最多可达三个其它碳原子可被杂原子替换。
术语“环烷基”指有3-10个碳原子的环状烷基(非芳族)。
术语“杂原子”指独立选择的O、S或N。
术语“杂芳基”指包含至少一个杂原子O、S或N、有5或6个环原子的单环芳烃基，或有8-10个原子的双环芳基，其中碳原子或氮原子为连接点，而且其中一个或两个其他碳原子任选被选自O或S的杂原子替换，其中1-3个其他碳原子任选被氮杂原子替换，所述杂芳基任选按本文所述取代。该类型基团的实例为吡咯、吡啶、噁唑、噻唑、四唑和噁嗪。对于本发明目的，四唑包括所有的互变异构形式。其他氮原子可与第一个氮和氧或硫一起存在，构成例如噻二唑。
本文使用的术语杂环基或杂环指饱和或不饱和的5-7元稳定单环杂环或8-11元稳定双环杂环，且其由碳原子和1-4个选自N、O和S的杂原子组成，并包括其中任何上述定义的杂环与苯环稠和的任何双环基团。杂环可在任何杂原子或碳原子处连接，导致稳定结构的形成。稠合杂环环系统可包括碳环且只需包括一个杂环。术语杂环或杂环的包括杂芳基部分。这些杂环部分的实例包括但不限于氮杂基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氢吡喃基、邻二氮萘基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噻喃基、二氢苯并噻喃基砜、1，3-二氧戊环基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异苯并二氢吡喃基、异二氢吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吗啉基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代氮杂基、噁唑基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基、噻吩基和三唑基。
对于本发明目的，含酸性羟基的杂环基为有酸性羟基原子的那些杂环基且pKa范围在3-7。含酸性羟基杂环基的非限定性实例为 或 G为-C(Rc)3、 -N(Re)2、O或S，且各Rc独立为H、氟、氰基或C1-4烷基；各Rd独立为H、C1-4烷基或药学上可接受的阳离子；各Re独立为H、-C(＝O)-Rf或-SO2Re，其中Rf为C1-4直链烷基或苯基本文使用的术语“激动剂”指与天然激动剂PGE2相比，与EP4受体相互作用可产生最大作用、超大作用、次最大作用的式IEP4亚型化合物。见Goodman and Gilman，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9版，1996，第2章。
当R1为(CH2)pCO2R10或(CH2)n杂环基、所述杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明的一个实施方案。
当R1为(CH2)mC5-10杂环基、所述杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明的另一个实施方案。当R2为(CH2)mC6-10芳基、所述芳基未取代或被1-3个Ra基团取代且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明的另一个实施方案。
当R1为(CH2)pCO2R10或(CH2)p-四唑基、所述四唑基未取代或被Ra基团取代且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明的一个亚实施方案。当R2为未取代苯基或被1-3个Ra基团取代的苯基且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明的还另一个实施方案。
当R1为(CH2)p-四唑基，R2为苯基，所述四唑基未取代或被Ra基团取代，苯基未取代或被1-3个Ra基团取代，且所有其他变量如最初所述时，可实现本发明再另一个实施方案。
当U为H且W为OH时，实现本发明的还另一个实施方案。
当U为C1-3烷基且W为OH时，实现本发明的还另一个实施方案。
本发明化合物为以下化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物1)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸；2)7-{(2R)-2-[(IE，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯；3)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸异丙酯；4)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸；5)7-{[(2R)-2-(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸；6)7-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯；7)6-[(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮；8)(6S)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌嗪-2-酮；9)(6R)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌啶-2-酮；10)7-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羟基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸。
本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，该组合物含有式IEP4激动剂和任选的药学上可接受载体。
本发明还另一个实施方案涉及一种降低增高的眼内压或治疗青光眼的方法，该方法通过给予含有式IEP4激动剂和任选的药学上可接受载体的组合物来实现，优选局部给药或前眼房(intracamaral)给药。本发明也包括式I化合物在制备用于治疗增高的眼内压或青光眼或其组合的药物中的用途。
本发明还涉及制备含有式I化合物的药用组合物的方法。
本发明还涉及制备含有式I化合物和药学上可接受载体的药用组合物的方法。
所要求保护的化合物强烈结合并作用于PGE2受体，特别是作用于EP4亚型受体，因此用于预防和/或治疗青光眼和高眼压症。
干眼症是一种常见的折磨成百万人的眼表面疾病。尽管，显然干眼症可由许多不相关致病因素引起，但是常见的最终结果是泪液膜的损坏，这导致眼睛暴露的外表面脱水。(Lemp，Report of the Nation EyeInstitute/Industry Workshop on Clinical Trials in Dry Eyes(国家眼学会/工业学部关于干眼症临床试验的报告)，The CLAO Journel，21(4)221-231(1995))。在人结膜(conjuctival)上皮细胞中已发现功能性EP4受体(见专利US6,344,477，该专利通过引用而整体结合至本文中)，而且认识到人角膜上皮细胞(Progess in Retinal and Eye Research，1681-98(1997))和结膜细胞(Dartt等Localization of nerves adjacent to goblet cells in ratconjucntiva(大鼠结膜中邻近杯状细胞神经的定位).Current EyeResearch，14993-1000(1995))能够分泌粘蛋白。因此，式I化合物可用于治疗干眼症。
黄斑水肿为眼睛后极非常重要的中心视力区内的视网膜肿胀。认为降低IOP的EP4激动剂可用于治疗黄斑疾病如黄斑水肿或黄斑变性。因此，本发明的另一方面为一种治疗黄斑水肿或黄斑变性的方法。
青光眼的特征在于视神经的进行性萎缩，并通常与增高的眼内压(IOP)相关。然而，使用赋予神经保护作用的药物而不必影响IOP也可治疗青光眼。见Arch.Ophthalmol.Vol.112，Jan 1994，pp.37-44；Investigative Ophthamol.& Visual Science，32，5，1991年4月，pp.1593-99。认为降低IOP的EP4激动剂可用于提供神经保护作用。也认为这些激动剂通过降低IOP可有效增加视网膜和视神经乳头的血液速度及增加视网膜和视神经的氧，这两种功效结合起来时有利于视神经健康。因此，本发明还涉及一种通过使用式IEP4激动剂来增加视网膜和视神经乳头的血液速度、或增加视网膜和视神经的氧张力、或提供神经保护作用或其组合的方法。
本发明制备的化合物容易地与已知并合适的药学上可接受赋形剂组合，以便制备可给予哺乳动物(包括人)的组合物，从而达到有效降低IOP。因此，本发明也涉及治疗高眼压症、青光眼、黄斑水肿、黄斑变性的组合物和方法，通过单独给予有需要的患者一种式I化合物或将式I化合物与以下活性成分中的一种或多种联合给予，来增加视网膜和视神经乳头的血液速度、增加视网膜和视神经的氧张力、提供神经保护作用或其组合β-肾上腺素能阻断剂如噻吗洛尔、倍他洛尔、左旋倍他洛尔、卡替洛尔、左布诺洛尔；拟副交感神经药如匹鲁卡品；拟交感神经药如肾上腺素、阿可乐定、溴莫尼定、可乐定、对氨基可乐定；碳酸酐酶抑制剂如多佐胺、乙酰唑胺、甲醋唑胺或布林唑胺；COSOPT；Maxi-K通道阻断剂如Penitrem A、paspalicine、卡律蝎毒素(charybdotoxin)、iberiotoxin、Paxicillan、Aflitram、Verroculogen以及在WO03/105868(USSN60/389,205)、WO03/105724(60/389,222)、WO03/105847(60/458,981)、2002年11月8日提交的60/424790(代理人卷号21260PV)、2002年11月8日提交的60/424808(代理人卷号21281PV)、2001年1月17日提交的09/765716、2001年1月17日提交的09/764738和PCT公布WO02/077168和WO02/02060863中所公开的Maxi-K通道阻断剂，所有这些专利申请通过引用而整体结合到本文中，特别是Maxi-K通道阻断剂如1-(1-异丁基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2，2-二甲基丙基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(环己基甲基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(1-己基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2-乙基己基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(3-异丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)丁-2-酮；1-(3-异丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3-环戊基羰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-甲酸；和1-[3-(3-羟基丙酰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基]-3，3-二甲基丁-2-酮；前列腺素如拉坦前列素、曲伏前列素、乌诺前列酮、异丙基乌诺前列酮(rescula)、S1033(美国专利第5,889,052、5,296,504、5,422,368和5,151,444号中提及的化合物)；降血压性脂质如比马前列素(lumigan)和美国专利第5,352,708号中提及的化合物；美国专利第4,690,931号中公开的神经保护剂，特别是WO94/13275中提及的依利罗地和R-依利罗地，包括美金刚；和/或PCT/US00/31247中提及的5-HT2受体激动剂，特别是延胡索酸1-(2-氨基丙基)-3-甲基-1H-吲唑(imdazol)-6-醇和2-(3-氯-6-甲氧基-吲唑-1-基)-1-甲基-乙胺。
本发明也包括式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高眼压症、青光眼、黄斑水肿、黄斑变性，增加视网膜和视神经乳头的血液速度，增加视网膜和视神经的氧张力，提供神经保护作用或其组合。
用于本发明的EP4激动剂可以治疗有效量经静脉内(intravaneously)、皮下、局部、经皮、肠胃外或本领域技术人员已知的任何其他方法来给予。眼用药物组合物优选适用于以溶液剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂或固体插入物形式对眼睛局部给药。该化合物的眼用制剂可含0.001-5％、特别是0.001-0.1％的药物。例如，较高剂量最高可达约10％，或者可采用较低剂量，条件是该低剂量可有效降低眼内压、治疗青光眼、增加血液流速或氧张力。对于单剂量，可施用于人眼的化合物为0.001-5.0mg，优选0.005-2.0mg，特别为0.005-1.0mg。
含有化合物的药物制剂可方便地与无毒的药用有机载体混合，或与无毒的药用无机载体混合。典型地，药学上可接受的载体为例如水、水和水互溶性溶剂如低级烷醇或芳烷醇的混合物、植物油、花生油、聚亚烷基二醇、基于胶状物的石油、乙基纤维素、油酸乙酯、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、肉豆蔻酸异丙酯和其他常规采用的可接受载体。药物制剂也可含无毒的辅助物质如乳化剂、防腐剂、湿润剂、基础剂等，例如聚乙二醇200、300、400和600，聚氧乙烯二醇1,000、1,500、4,000、6,000和10,000；抗菌成分如季铵化合物、已知有低温(cold)杀菌特性且使用无害的苯汞盐、硫汞撒、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、苄醇、苯乙醇；缓冲成分如硼酸钠、乙酸钠、葡萄糖酸盐缓冲剂；以及其他常规成分如单月桂酸脱水山梨醇酯、三乙醇胺、油酸盐(酯)、聚氧化乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯、二辛基磺基琥珀酸钠、单硫代甘油、硫代山梨糖醇、乙二胺四乙酸等。另外，对于本发明目的，可作为载体介质使用的合适眼用媒介物包括常规磷酸盐缓冲剂溶媒系统、等渗的硼酸溶媒、等渗的氯化钠溶媒、等渗的硼酸钠溶媒等。药物制剂也可为微粒制剂形式。药物制剂也可为固体插入剂形式。例如可采用固体水溶性聚合物作为药物的载体。用于形成插入剂的聚合物可以为任何无毒的水溶性聚合物，例如纤维素衍生物如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、(羟基低级烷基纤维素)、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素；丙烯酸盐如聚丙烯酸盐、乙基丙烯酸盐、聚乙酰胺(polyactylamide)；天然产物如明胶、藻酸盐、果胶、黄芪胶、梧桐胶、角叉采胶、琼脂、阿拉伯胶；淀粉衍生物如淀粉醋酸酯、羟基甲基淀粉醚、羟基丙基淀粉；及其他合成衍生物如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚环氧乙烷、中性卡波泊尔和黄原胶、吉兰糖胶和所述聚合物的混合物。
给予本发明制剂的合适对象包括灵长类、人和其他动物，特别是人和驯养动物如猫、兔和狗。
药物制剂可含无毒的辅助物质如使用无害的抗菌成分，例如硫汞撒、氯化苄烷铵、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、benzyldodecinium溴化物、苄醇或苯乙醇；缓冲成分如氯化钠、硼酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠或葡萄糖酸盐缓冲液；及其他常规成分如单月桂酸脱水山梨醇酯、三乙醇胺、聚氧化乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯、乙二胺四乙酸等。
可按需要尽可能经常给予眼用溶液剂或混悬剂以保持眼睛的IOP为可接受水平。预计对哺乳动物眼睛给药每天可1次最多可达3次。
为眼睛局部给药，本发明的新制剂可采用溶液剂、凝胶剂、乳膏剂、混悬剂或固体插入剂的形式，配制后使在联合治疗的情况中，单位剂量包含治疗有效量的活性成分或其一些组合。
关于治疗眼病，式I激动剂的EC50值通常为约0.001nM至约100μM，尽管活性超过这个范围的激动剂也有用，但需依赖于剂量和给药途径。在本发明的亚类中，激动剂的EC50值为约0.01μM至约10μM。在本发明的再一个亚类中，激动剂的EC50值为约0.1μM至约10μM。EC50是一种测试激动剂活性的普通方法，为本领域技术人员所熟知，EC50定义为产生一半即50％最大效应所需激动剂的浓度或剂量。可参见Goodman and Gilman，The Pharmacologic Basis of Therapeuttics，第9版，1996，第2章，E.M Ross，Pharmacodynamics，Mechanisms ofDrug Action and the Relationship Between Drug Concentration and Effect和1999年10月12日提交的PCT US99/23757，这些文献通过引用而整体结合到本文中。
本文实施例举例说明但并不限定所要求保护的发明。所要求保护的每种化合物均为EP4激动剂，用于治疗许多生理性眼病和骨病。
本发明化合物可按美国专利第6,043,275号、EP0855389、WO03/047417(USSN60/337228)、WO03/047513(USSN60/338,117)、USSN60/406,530(Merck卷号No.MC060)和WO01/46140进行一些修改，所有这些文献通过引用而整体结合到本文中。以下通过举例说明给出的非限定性流程和实施例用于证明本发明。
制备实施例1 于60℃，向(+/-)-2-哌啶酸(395g，3.06摩尔)的MeOH(1.8L)浆液中加入L-酒石酸(459g，3.06摩尔)。将浆液升温至回流并老化1h(小时)。将浆液冷却至23℃，过滤，用MeOH(200mL)洗涤需要的(R)-2-哌啶酸/L-酒石酸滤饼。将该滤饼风干，分离出白色固体。经测定2-哌啶酸酒石酸盐的光学纯度典型为85-89％ee。
将盐(383g)的H2O/丙酮(2∶1)(380mL/190mL)浆液升温至回流(60-65℃)直至所有固体溶解。2h内，回流下加入丙酮(1330mL)。将浆液在1h内冷却至15-20℃，然后过滤，用丙酮/H2O(4∶1)(380mL)洗涤，然后于真空下风干。分离得到313g 2-哌啶酸酒石酸盐(＞99％ee)。
于0.5h内，向(R)-2-哌啶酸酒石酸盐(312g)的MeOH(3.0L)浆液中加入28％NH4OH(83mL，1.1eq)。将该白色浆液于环境温度下老化0.5h，然后过滤该酒石酸铵沉淀。滤饼用MeOH(300mL)冲洗。将滤液和冲洗液合并并浓缩至白色固体(1)。
制备实施例2 向2-哌啶酸(109.7g)和BOC2O(222.4g)的四氢呋喃(THF)/H2O(1∶1)(550/550mL)浆液中加入50％NaOH(45mL)。将该浆液升温至回流并于回流下老化5h。将该溶液冷却至23℃，然后用庚烷(550mL)洗涤除去未反应的BOC2O。然后用5N HCl(170mL)酸化水层至pH为4-5。所得浆液用550mL叔丁基甲基醚(MTBE)萃取。有机层用Na2SO4干燥，然后浓缩至白色固体(2)。
制备实施例3 向N-BOC-2-哌啶酸(166.5g，726毫摩尔)的500mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入MeI(123.7g，871毫摩尔)和K2CO3(100.4g，726摩尔)。在环境温度下4小时老化期间，于0.5h后反应混合物缓慢放热至40℃。加入MTBE(830mL)，然后用H2O(2×830mL)和20％盐水(300mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并浓缩至油状物(3)。
制备实施例4 向丁氧羰基(Boc)-甲酯(152.6g，627mmol)的MeCN(305mL)溶液中加入RuCl3(2.6g，12.5毫摩尔)。在2h内加入NaBrO3(142.0g，941毫摩尔)的H2O(760mL)溶液。于环境温度下老化该溶液12h。加入EtOAc(760mL)并除去水层。将黑色有机层用10％Na2SO3(305mL)洗涤至有机层变澄清而水层变灰色浑浊。有机层用饱和盐水(150mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，得到油状物(4)。
制备实施例5 于15min内，向BOC-内酰胺(135.4g，526mmol)的135mL异丙醇(IPA)溶液中加入5N HCl的263mL/1316mmol异丙醇(IPA)溶液。气体剧烈放出持续15min，然后于环境温度下老化该溶液2.5h。加入EtOAc(800mL)并用15％Na2CO3(350mL)洗涤。用EtOAc(400mL)萃取水层。合并的有机层用Na2SO4干燥并浓缩至油状物(5)。测定对映体纯度＞99％ee。
制备实施例6 于30分钟内，向内酰胺酯(8.10g，51.7mmol)的无水乙醇(500mL)溶液中以0.5g增量加入硼氢化钠(2.5g，1.2eq)。于室温搅拌该溶液3.5小时。然后用冰醋酸(2.8当量)处理该混合物，经硅藻土塞过滤除去沉淀物。在真空中浓缩滤液并将所得油在真空下放置固化。将该粗产物溶于CH2Cl2(50mL)中，用KHCO3(1.5当量)处理，老化1h，经硅藻土塞过滤，将所得滤液在真空中浓缩得到题述化合物6，该化合物可直接用于下一步骤而不需进一步纯化。
制备实施例7 于0℃、氮气氛下，向内酰胺醇(10g，77.5mmol，1.0当量)的无水CH2Cl2(50mL)溶液中加入咪唑(6.9g，100.8mmol，1.3当量，(调节咪唑的量以中和所有来自前面步骤的AcOH)和14g/93.0mmol/1.2当量叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)。将所得混合物升温至室温(RT)并老化4小时。一旦判定反应完成，加入CH2Cl2(100mL)，然后加入1N HCl溶液(30mL)。分离有机层，将水层用CH2Cl2(2×50mL)反萃取。合并有机层，用20％NaHCO3溶液(40mL)、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到需要的白色固体化合物。含硅副产物可于-78℃用冷庚烷(3mL/g)洗涤该固体除去，得到题述化合物7。
制备实施例8 向15℃内酰胺7(2.0g，8.22mmol)的THF(KF＜200ppm)溶液中加入1.90g/9.04毫摩尔二[三甲基甲硅烷基]氨基化钾(KHMDS)固体的20mL四氢呋喃(THF)溶液中，并于室温(rt)老化10min。将新制备的甲磺酸酯(0.93g，8.22mmol，KF＜800ppm)以纯油加入该溶液中，将反应物加热至50℃并老化2.5-3.5h。将反应物冷却至室温并用MTBE(20mL)和水(20mL)稀释。除去水层，有机层用饱和盐水(10mL)洗涤。用Na2SO4干燥后除去溶剂，得到黄色的粗油8。
制备实施例9 于0℃、氮气氛下，于15min内，向叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)-保护的内酰胺(10g，24.2mmol，1当量)的无水MTBE(40mL)溶液中加入70％HF·吡啶溶液(4.84g，169mmol，7当量)。将所得混合物升温至室温并老化12小时，通过HPLC和1HNMR分析判定反应完成。然后用MTBE(100mL)稀释该混合物，并用冷H2O(30mL)洗涤。用饱和Na2CO3(25mL)、盐水处理有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。所得粗油(9)直接用于下一步骤。如果需要，该醇可以经硅胶快速柱层析(40∶1 CH2Cl2∶MeOH)纯化。
制备实施例10 在15分钟内，向醇9(9.46g，31.6mmol)、DMSO(237.3mmol，16.9mL，7.5当量)和Hunig碱(16.5mL，94.9mmol，3当量)的二氯甲烷(95mL)冷溶液(0℃)中加入固体SO3·吡啶(15g，94.9mmol，3当量)。将所得溶液在0℃老化1.5h，同时观测起始原料的完全消耗。然后将该反应混合物用EtOAc(150mL)稀释并用4N冷盐酸(35mL)洗涤。将有机层分离并依次用饱和NaHCO3溶液和盐水处理。将该溶液用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到相应的醛(7.8g，83％测定收率)，该醛可直接用于下一步骤而不需进一步纯化。
制备实施例11制备膦酸钠14步骤1 于15℃、氮气氛下，向苯甲酰基甲酸甲酯(PhCOCO2Me，25g，0.15mol，1当量)的纯溶液中以维持内部温度低于45℃的速度加入纯三氟化二乙氨基硫(DAST，34.4g，0.21mol，1.4当量)。加完后，将所得褐色溶液冷却至室温并再老化3小时，此时通过高效液相色谱(HPLC)和气相色谱/质谱(GC/MS)检测起始原料全部反应。然后将反应混合物慢慢倾入冰/H2O(注意发热！)混合物中，该产物用MTBE(3×)萃取。然后将合并的有机层用20％的冷Na2CO3水溶液缓慢中和至pH为7(注意气体放出)，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将该粗产物经真空蒸馏(bp＝103-105℃，24-25托)纯化得到需要的产物(13)，为浅黄色油状物。
步骤2 在-78℃、氮气氛下，于15min内向甲基膦酸二甲酯(28g，0.23mol，1.05当量)的无水THF(400mL，KF＝30ppm)溶液中缓缓加入2M二(三甲基甲硅烷基)氨基化钠的THF溶液(115mL，0.23mol，1.05当量)。将所得溶液老化30min，然后于15min内用纯二氟甲酯(PhCF2CO2Me，40g，0.22mol，1.0当量)处理。将反应混合物于-78℃老化1h，缓慢升温至室温并浓缩至其原体积的约四分之一，于0.5h内加入MTBE(400mL)。将所得悬浮液于室温进一步老化0.5h并过滤。湿滤饼用MTBE(100mL)洗涤并在氮气流下真空干燥。分离得到白色固体产物(14)。
制备实施例12制备化合物16步骤1 向水(250mL)、IPA(1250mL)和浓硫酸(600mL，11.1mol)的10℃溶液中一次性加入固体过硫酸钾(600g，2.22mol)。将环庚酮(131.5mL)用IPA稀释至总体积250mL，并将该溶液于15min内经加料漏斗加入过硫酸盐浆液中，整个加入过程保持温度＜15℃。将反应物于15℃老化16-20h。一旦所有环庚酮反应完，将反应物过滤以除去盐，保持滤液低温。将滤液用MTBE(1250mL)、饱和盐水(1L)和水(500mL)稀释，并保持温度＜30℃。转移至分液漏斗后，使各相澄清1h并除去水层。将有机层用饱和Na2CO3(2×1L)洗涤，或洗涤直至除去水层保持碱性。将该溶液用己烷(1.25L)稀释并经Na2SO4干燥1h。于真空下除去溶剂，将油真空蒸馏得到纯酯(16)。(bp125℃@4mm Hg)步骤2 向酯(10g，0.05mol)和三乙胺(11.1mL，0.08mol)的-10℃无水THF(100mL)溶液中加入甲磺酰氯(MsCl-4.75mL，0.06mol)(按1∶1用THF稀释)，整个加入过程保持温度＜10℃。将反应物于0-5℃老化30min。完成后，将反应物用己烷(100mL)稀释并用水(50mL)猝灭。除去水层并将有机层经Na2SO4干燥30min。在真空下除去溶剂得到黄色油状物(16)。甲磺酸应在内酰胺烷基化前新鲜制备以将杂质降到最少。
实施例17-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯 于0℃、氮气氛下，向膦酸钠14(13.7g，45.7mmol，1.4当量)的THF(130mL)溶液中加入znCl2(3.33g，24.5mmol，0.75当量)。将所得混合物于室温搅拌15min，然后用醛10(9.7g，32.66mmol，1当量)的THF(10mL)溶液处理。将所得悬浮液加热至50℃保持50h，此时观测到94-97％转化。然后将混合物浓缩至体积约为其原体积的三分之一，用EtOAc(130mL)稀释，用H2O(30mL)和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到黄色油状物(11)，该油状物可经快速硅胶层析(19∶1→9∶1甲苯丙酮)纯化。
实施例27-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸酯(12) 在室温、氮气氛下，向烯酮(450mg，1mmol，1.0当量)的0.5M/～4.5mL/g无水PhCH3或二氯甲烷(DCM)溶液中加入Et3N(0.14mL，1mmol，1.0当量)和HCO2H(0.05mL，1.2mmol，1.2当量)。将所得溶液搅拌10mm，同时用固体(R，R)-(-)-Ru-TsDPEN-伞花烃络合物1(19mg，0.03mmol，0.03当量)处理。然后将反应混合物于室温老化2h，此时观测起始原料全部消耗。加入叔丁基甲基醚-MTBE(5mL)，然后加入1NHCl(2mL)。将有机层分离，用饱和Na2CO3、盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到粘油状最终化合物。(40-60∶1非对映体比例，83-85％测定收率)。
在0.04摩尔当量的1M KOtBu的THF(四氢呋喃)溶液存在下，通过在DCM(二氯甲烷)中混合0.02摩尔当量[RuCl2(对-伞花烃)2]和0.04摩尔当量(R，R)-N-甲苯磺酰基-1，2-二苯乙烯-1，2-二胺也可在原位产生催化剂。于室温老化10min后，依次加入Et3N、HCO2H和烯酮的DCM溶液。
于80℃，通过将1摩尔当量[RuCl2(对-伞花烃)2]、2摩尔当量(R，R)-N-甲苯磺酰基-1，2-二苯乙烯-1，2-二胺和4.2摩尔当量Et3N在iPrOH中混合1h(小时)，可制备催化剂。除去溶剂后，固体用冷水洗涤并从MeOH重结晶得到橙色固体状催化剂。(65-75％收率)。
实施例37-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸流程1 步骤17-[(2R)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-6-氧代哌啶-1-基]庚酸异丙酯 向7(1.0g，4.1mmol，根据文献方法Synthesis 1998，1141-1144经7步顺式合成)的12mL DMF(二甲基甲酰胺)溶液中加入60％氢化钠(172mg，4.3mmol)，将所得溶液于50℃搅拌30min，然后加入异丙基-7-碘庚酸酯17(1.9g，1.6mL，8.2mmol)和四丁基碘化铵(50mg)。于50℃搅拌该溶液过夜后，冷却至室温，慢慢倾入饱和氯化铵水溶液中并用乙醚萃取。将有机相合并，依次用H2O、盐水洗涤并经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速层析用75-100％乙酸乙酯/己烷纯化该化合物，得到无色油状物9。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ4.95(m，1H)，3.75(m，3H)，3.50(m，1H)，2.97(m，1H)，2.25(2t，4H)，2.00(m，1H)，1.93(m，1H)，1.82(m，1H)，1.70-1.56(m，4H)，1.52(m，1H)，1.40-1.28(m，4H)，1.22(2s，6H)，0.93(s，9H)，0.11(s，6H).
步骤27-[(2R)-2-(羟甲基)-6-氧代哌啶-1-基]庚酸异丙酯 于室温下，向8(0.80g，2.3mmol)的10mL溶液中加入TBAF-四丁基氟化铵(0.25mL的1M THF溶液)并搅拌18小时。然后用饱和NaHCO3猝灭该溶液，并用乙酸乙酯萃取。合并有机层，依次用水和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状物9。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ4.95(m，6H)，3.97(t，1H，OH)，3.76(m，1H)，3.66(m，2H)，3.48(m，1H)，2.98(m，1H)，2.24(m，41)，2.08(m，1H)，1.90(m，1H)，1.79(m，1H)，1.70-1.56(m，4H)，1.50(m，1H)，1.40-1.27(m，4H)，1.22(2s，6H).
步骤37-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯 向用氮气吹扫的烧瓶中加入CH2C12(40mL)，然后加入二甲亚砜(0.115g，0.10mL，1.48mmol)。将该溶液冷却至-78℃，在剧烈搅拌下滴加入草酰氯(0.17g，0.12mL，1.3mmol)。30min后经插管加入9(0.35g，1.2mmol)的5mL CH2Cl2溶液。于-78℃再继续搅拌30min。滴加入三乙胺(0.31g，0.43mL，3.1mmol)，搅拌15min后，不用浴真空浓缩。使用乙醚/乙酸乙酯(100mL)(1∶1)溶液滤除三乙胺盐，将溶液真空浓缩。然后将粗醛10用5mL THF稀释，并于0℃加至已经预混1小时的(2-氧代-3-苯基-丙基)-膦酸二甲酯(0.34g，1.4mmol)和60％氢化钠(52mg，1.3mmol)的15mL THF溶液中。加入氯化锌(x mL的1M THF溶液)，于50℃搅拌反应混合物过夜。将该溶液用饱和氯化铵水溶液猝灭并用乙酸乙酯萃取。然后合并有机相，依次用H2O、盐水洗涤并用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速层析用50-80％乙酸乙酯/己烷纯化该化合物，得到无色油状物11。
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.65-7.55(m，5H)，7.11(dd，1H)，6.67(d，1H)，4.95(m，1H)，4.40(m，1H)，3.78(m，1H)，2.60(m，1H)，2.25(m，4H)，2.02(m，1H)，1.90(m，1H)，1.68(m，2H)，1.53-1.36(m，4H)，1.35-1.17(m，10H).
步骤47-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯 A在甲苯中合成丁基-(S)-CBS向(S)-CBS配体(11.53g，45.5mmol)的甲苯(110mL)溶液中加入丁基硼酸(5.1g，47.8mmol)，将该混合物加热至回流过夜，使用Dean stark。最终溶液为0.48M并直接使用。
B.还原在氮气氛下，向冷却至-78℃的儿茶酚硼烷(3.35mL，31.4mmol)的甲苯(400mL)溶液中加入68mL(32.6mmol)(S)-2-丁基-CBS噁唑硼烷(oxazaborolidine)溶液，于该温度下搅拌该混合物1小时。在氮气氛下于1h内滴加入酮11(7g，15.6mmol)的甲苯(420mL)溶液，于该温度下搅拌该混合物直至所有起始原料消失(通常在30min内)。然后向该混合物中加入200mL 1N HCl，在剧烈搅拌下将该混合物升温至室温。用乙酸乙酯萃取该混合物(在萃取过程中乳化，将悬浮液经硅藻土过滤除去乳化)。将该粗产物经快速层析纯化。用EA/己烷(70-100％)洗脱得到需要的醇，该醇为两种非对映异构体12∶1比例的混合物。用手性Pak AD柱，50％iPrOH/己烷作洗脱剂(在入214nm检测)，将该混合物经制备HPLC(高效色相色谱)容易分离。先出来的是不需要的异构体，随后出来的是需要的异构体12。
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.6-7.5(m，2H)，7.5-7.4(m，3H)，5.80(dd，1H)，5.6(dd，1H)，5.0-4.9(m，2H)，4.7-4.6(m，1H)，4.1-4.0(m，1H)，3.8-3.7(m，1H)，2.6-2.5(m，1H)，2.3-2.2(m，4H)，1.9-1.8(m，1H)，1.75-1.55(m，5H)，1.55-1.4(m，2H)，1.4-1.22(m，4H)，1.22(d，6H).
步骤57-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸 于0℃，向12(39mg，0.089mmol)的2.75mL THF∶MeOH∶水(2.5∶2.5∶1)溶液中加入氢氧化锂(145μl的2M水溶液)，将所得溶液升温至室温并搅拌过夜。向该溶液中加入1M盐酸(1mL)，并用乙酸乙酯萃取该溶液。然后合并有机相，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速层析用49-45％/1-5％/1滴CH2Cl2/甲醇/乙酸纯化该化合物，得到无色油状物18。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ7.6-7.5(m，5H)，5.8(dd，1H)，5.6(dd，1H)，5.6(bs，1H)，4.6(m，1H)，4.1(m，1H)，3.7(m，1H)，2.6(m，1H)，2.4～2.2(m，4H)，1.9-1.2(m，12H).
下面的实施例4-13化合物可依照实施例1-3方法制备，并作适当修改。
实施例47-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羟基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸MS(+ESI)M/Z 490.1(M+1)+。
实施例57-{[(2R)-2-(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸1H NMR(400MHZ，CD3OD)δ7.3-7.1(M，5H)，3.8-3.7(M，2H)，3.4(M，1H)，2.9-2.7(M，3H)，2.3(M，4H)，1.9-1.3(M，16H)；MS(-ESI)M/Z 374.2(M-1)-.
实施例65-{3-[(2R)-2-((1E)-(3S)3-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸甲酯1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.6(d，1H)，7.2-7.1(m，5H)，6.7(d，1H)，5.5(m，2H)，4.3(m，1H)，3.8-3.7(m，2H)，3.8(s，3H)，2.8-2.6(m，6H)，2.3-2.2(m，2H)，1.9-1.2(m，6H).
实施例75-{3-[(2R)-2-((1E)-(3S)3-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸1H NMR(400MHZ，CD3OD)δ7.6(D，1H)，7.2-7.1(M，5H)，6.9(D，1H)，5.5(M，2H)，4.3(M，1H)，3.9(M，1H)，3.7(M，1H)，2.9-2.6(M，5H)，2.2(M，2H)，1.9-1.5(M，6H)；MS(-ESI)M/Z
实施例85-{3-[(2R)-2-((3S)3-羟基-4-苯基-丁基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸1H NMR(400MHZ，CD3OD).δ7.6(D，1H)，7.3-7.1(M，5H)，6.9(D，1H)，3.8(M，2H)，3.4(M，1H)，3.0-2.9(M，1H)，2.8-2.5(M，4H)，2.3(M，2H)，2.0-1.3(M，10H)；MS(-ESI)M/Z 414.1(M-1)-.
实施例95-{3-[(2R)-2-((1E)-(3D)3-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸异丙酯1H NMR(400MHz，CDCl3)87.6(d，1H)7.3-7.1(m，5H)，6.8(d，1H)，5.5(m，2H)，5.1(m，1H)，4.4(m，1H)，3.9-3.8(m，2H)，3.3(br s，1H)，2.8(m，4H)，2.7(m，1H)，2.3(m，2H)，1.9-1.6(m，6H)，1.3(dd，6H)；MS(+ESI)M/Z 456.4(M+1)+.
实施例105-{3-[(2R)-2-((3S)3-羟基-4-苯基-丁基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸异丙酯1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.6(d，1H)，7.3-7.1(m，5H)，6.8(d，1H)，5.2(m，1H)，3.9-3.8(M，2H)，3.3(m，1H)，2.9-2.8(m，4H)，2.7-2.6(m，1H)，2.4-2.3(m，3H)，2.0-1.2(m，10H)，1.3(d，6H)；MS(+ESI)M/Z 458.2(M+1)+.
实施例116-[(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.3-7.1(m，5H)，3.8-3.7(m，2H)，3.3(m，1H)，2.9-2.7(m，5H)，2.3(m，2H)，1.9-1.3(m，16H)；MS(+ESI)M/Z 400.3(M+1)+.
实施例12(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸异丙酯MS(+ESI)M/Z 450.3(M+1)+。
实施例13(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸MS(-ESI)m/z 406.1(M-1)-。
I.EP4激动剂对兔和猴眼内压(IOP)的作用动物该研究中使用Drug- 雄性Dutch Belted兔和雌性食蟹猴(cynomolgus monkeys)。这项研究中动物的护理和处理依据国立卫生研究院(NIH)的指导方针，以及视觉与眼科研究协会(ARVO)关于研究使用动物的决议。所有试验方法经Merck and Company实验动物管理及使用委员会批准。
药物制剂和给药药物浓度根据活性成分(碱)来表示。将本发明化合物溶于生理盐水中配成0.01％、0.001％、0.0001％溶液用于兔研究，配成0.05％、0.005％溶液用于猴研究。典型地，单侧或双侧局部给予药物或溶媒等分试样(25μl)。在单侧使用中，对侧的眼睛使用等体积的盐水。在测量眼压前先将丙美卡因(0.5％)施用于角膜以便将不适降到最低。用气动压力计(Alcon Applanation Pneumatonograph)或等价物记录眼内压(IOP)。
分析结果以从给予药物或溶媒前测量的基础水平开始的IOP变化表示，表示为平均值加上或减去标准偏差。使用Student t-检验对非配对数据和配对数据进行统计学比较，非配对数据为药物处理的动物反应和溶媒处理的动物反应之间的数据，配对数据为在可比较时间间隔内同侧眼睛和对侧眼睛之间的数据。使用Dunnett“t”检验根据“t-0”值也可确定数据的显著性差异。星号表示p＜0.05的显著水平。
A.兔眼内压的测量将体重2.5-4.0kg的雄性Dutch Belted兔维持在12小时光亮/黑暗周期和兔食物中。所有试验在相同时间进行以便将与昼夜节律相关的可变性降到最小。处理前测量IOP，然后将本发明化合物或溶媒滴注(一滴25μl)到一只眼睛或双眼中，滴注后，于30、60、120、180、240、300和360分钟测量IOP。在一些情况中，对只用溶媒两侧处理的相同数量动物作为平行对照进行评价，并与药物处理的动物进行比较。
B.猴眼内压的测量使用Lee等(1985)的方法，用氩激光系统(Coherent NOVUS 2000，Palo Alto，USA)通过小梁状网状组织的激光凝固法将体重2-3kg的雌性食蟹猴诱发右眼单侧的高眼压症。眼内压(IOP)长时间增高可导致视神经乳头发生改变，类似于青光眼患者中所发现的那些改变。
为了测量IOP，在试验期间将猴放在约束椅(restraint chairs)保持坐姿。每次IOP测量前约5分钟肌内注射盐酸氯胺酮(3-5mg/kg)将动物轻度麻醉，记录IOP前滴注一滴0.5％的丙美卡因。使用气动压力计(Alcon Applanation压力计)或Digilab眼压计(Bio-Rad OphthalmicDivision，Cambridge，MA，USA)测量IOP。
在处理前和处理后通常30、60、124、180、300和360分钟测量IOP。基础值也通常在处理前两天或三天的这些时间点测得。处理由滴注一滴25μl的本发明化合物(0.05％和0.005％)或溶媒(盐水)组成。在同一动物进行测试前采用至少一周的间歇期(washout)。常压(高压对侧)眼睛用完全类似于高眼压眼睛的方式处理。测量双眼的IOP，并与同一时间点的相应基础值比较。结果以平均值加或减标准偏差、单位为mm Hg表示。用于眼睛使用的本发明化合物活性范围为0.01-100,000nM。
II.放射性配体结合试验用于测试这些化合物的试验基本上按Abramovitz M、Adam M、Boie Y、Carriere M、Denis D、Godbout C、Lamontagne S、Rochette C、Sawyer N、Tremblay NM、Belley M、Gallant M、Dufresne C Gareau Y、Ruel R、Juteau H、Labelle M、Ouimet N、Metters KM描述的方法进行。利用重组前列腺素类受体测定前列腺素和相关类似物的亲和力和选择性。Biochim Biophys Acta 2000 Jan 17；1483(2)285-293和如下论述人胚(HEK)293(EBNA)细胞系中前列腺素类受体的稳定表达将对应全长编码序列的前列腺素类受体(PG)cDNA亚克隆至哺乳动物表达溶媒pCEP4(Invitrogen)的适当位置。根据制造商的说明，pCEP4PG质粒DNA用Qiagen质粒制备试剂盒(QIAGEN)制备，用LipofectAMINE@(GIBCO-BRL)转染至HEK293(EBNA)细胞。在Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)中选择表达cDNA以及潮霉素抗性基因的HEK293(EBNA)细胞，DMEM补加10％热灭活胎牛血清、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素-G、100μg/ml硫酸链霉素、250μg/ml活性GENETICINTM(G418)(所有均来自Life Technologies，Inc./BRL)和200μg/ml潮霉素(Calbiochem)。生长2-3周后用克隆环方法选择性分离单独集落，随后扩展至克隆细胞系。受体cDNA的表达通过受体结合试验评价。
于37℃、空气中6％CO2的潮湿气氛中，在补加DMEM完全培养基中使HEK293(EBNA)细胞生长，然后收获并通过差示离心法(1000×g 10分钟，然后160,000×g 30分钟，都设定在4℃)制备膜，接着在蛋白酶抑制剂(2mM苯甲磺酰氟、10μM E-64、100μM亮抑酶肽和0.05mg/ml抑胃酶肽)的存在下，在冰上通过氮气蚀以800psi溶胞30分钟。在大约5-10mg/ml蛋白质时，通过Dounce匀化作用(Dounce A；10个脉冲(strokes))将160,000×g粒状物再悬浮在含1mM EDTA的10mM HEPES/KOH(pH7.4)中，将其冷冻在液氮中并于-80℃储存。
前列腺素类受体结合试验前列腺素类受体结合试验在0.2ml 10mM MES/KOH(pH6.0)(EP亚型、FP和TP)或10mM HEPES/KOH(pH7.4)(DP和IP)中的最终温育体积中进行，含1mM EDTA、10mM MgCl2(EP亚型)或10mMMnCl2(DP、FP、IP和TP)和放射性配体[用于EP亚型的0.5-1.0nM[3H]PGE2(181Ci/mmol)、用于DP的0.7nM[3H]PGD2(115Ci/mmol)、用于FP的0.95nM[3H]PGF2α(170Ci/mmol)、用于IP的5nM[3H]伊洛前列素(16Ci/mmol)和用于TP的1.8nM[3H]SQ 29548(46Ci/mmol)]。EP3试验也含100μM GTPγS。通过加入来自160,000×g份的膜蛋白(大约30μg用于EP1、20μg用于EP2、2μg用于EP3、10μg用于EP4、60μg用于FP、30μg用于DP、10μg用于IP和10μg用于TP)引发反应。向所有温育物中保持在1％(v/v)不变的二甲基亚砜(Me2SO)中加入配体。在1μM相应非放射性前列腺素类化合物的存在下测定非特异性结合。于30℃(EP亚型、DP、FP和TP)或室温(IP)进行温育60分钟(EP亚型、FP和TP)或30分钟(DP和TP)，通过96-孔Unifilter GF/C(Canberra Packard)快速过滤来中止，Unifilter用不含EDTA(4℃)的试验温育缓冲液预湿，用Tomtec Mach III 96-孔半自动细胞收集器收集。滤器用3-4ml相同的缓冲液洗涤，于55℃干燥90分钟，结合于单独滤器的剩余放射性通过加入50μl Ultima Gold F(Canberra Packard)使用1450 MicroBeta(Wallac)经闪烁计数来测定。特异性结合通过从全部结合中减去非特异性结合来计算。特异性结合占全部结合的90-95％，与所使用的放射性配体和蛋白的浓度成线性。全部结合占加至温育培养基的放射性配体的5-10％。
用于骨病用途的本发明化合物活性范围为0.01-100,000nM。
权利要求
1.一种具有结构式I的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物 式I其中U表示H、C1-3烷基或当W为＝O时不存在；W表示OH或＝O，条件是当W为＝O时U不存在；Z表示(CH2)n或CH＝CH；R1表示(CH2)p羟基、(CH2)pCO2R10或(CH2)n杂环基，所述杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代且任选含有酸性羟基；R2独立表示C1-10烷基、(CH2)mC6-10芳基、(CH2)mC5-10杂环基、(CH2)mC3-10杂环烷基、(CH2)mC3-8环烷基，所述烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂环基未取代或被1-3个Ra基团取代；R3和R4独立表示氢、卤素或C1-6烷基；R6表示氢或C1-4烷基；R10表示氢、C1-10烷基、C3-10环烷基、(CH2)pC6-10芳基、(CH2)pC5-10杂环基；Ra表示C1-6烷氧基、C1-6烷基、CF3、硝基、氨基、氰基、C1-6烷基氨基、卤素，或Ra还表示芳基和杂环基、SC1-6烷基、SC6-10芳基、SC5-10杂环基、OC6-10芳基、OC5-10杂环基、CO2R6、CH2OC1-6烷基、CH2SC1-6烷基、CH2O芳基、CH2S芳基； 表示双键或单键；p表示0-3；n表示0-4；且m表示0-8。
2.权利要求1的化合物，其中R1为(CH2)pCO2R10，R3和R4为卤素，且R2为(CH2)mC6-10芳基，所述芳基未取代或被1-3个Ra基团取代。
3.一种化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物，所述化合物为1)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸；2)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯；3)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4--二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸异丙酯；4)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸；5)7-{[(2R)-2-(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸；6)7-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸异丙酯；7)6-[(3R)-3-羟基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮；8)(6S)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌嗪-2-酮；9)(6R)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羟基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌啶-2-酮；10)7-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羟基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸。
4.一种治疗高眼压症或青光眼的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求1的化合物。
5.一种药用组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和权利要求1、2或3的式I化合物，所述组合物作为溶液剂或混悬剂以局部用制剂给药。
6.权利要求4的组合物，其中有一种或多种活性成分加入所述局部用制剂中，所述活性成分属于β-肾上腺素能阻断剂、拟副交感神经药、拟交感神经药、碳酸酐酶抑制剂、Maxi-K通道阻断剂和前列腺素、降血压性脂质、神经保护剂和5-HT2受体激动剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述β-肾上腺素能阻断剂为噻吗洛尔、倍他洛尔、左旋倍他洛尔、卡替洛尔或左旋布诺洛尔；所述拟副交感神经药为匹鲁卡品；所述拟交感神经药为肾上腺素、溴莫尼定、阿可乐定、可乐定或对氨基可乐定，所述碳酸酐酶抑制剂为多佐胺、乙酰唑胺、甲醋唑胺或布林唑胺；COSOPT，所述Maxi-K为PenitremA、paspalicine、卡律蝎毒素、iberiotoxin、Paxicillan、Aflitram、Verroculogen、1-(1-异丁基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2，2-二甲基丙基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(环己基甲基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(1-己基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2-乙基己基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(3-异丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)丁-2-酮；1-(3-异丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3-环戊基羰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-甲酸；和1-[3-(3-羟基丙酰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基]-3，3-二甲基丁-2-酮，所述前列腺素为拉坦前列素、曲伏前列素、乌诺前列酮、异丙基乌诺前列酮或S1033，所述降血压性脂质为比马前列素，所述神经保护剂为依利罗地、R-依利罗地或美金刚；和所述5-HT2受体激动剂为延胡索酸1-(2-氨基丙基)-3-甲基-1H-吲唑-6-醇或2-(3-氯-6-甲氧基-吲唑-1-基)-1-甲基-乙胺。
8.一种治疗黄斑水肿或黄斑变性、治疗干眼症、增加视网膜和视神经乳头血液速度、增加视网膜和视神经氧张力或提供神经保护的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者药学有效量的权利要求1的化合物。
9.权利要求4的方法，其中所述式I化合物作为局部用制剂施用，且向该制剂中加入活性成分，所述活性成分属于β-肾上腺素能阻断剂、拟副交感神经药、拟交感神经药、碳酸酐酶抑制剂、COSOPT、Maxi-K通道阻断剂和前列腺素、降血压性脂质、神经保护剂和5-HT2受体激动剂。
10.权利要求6的方法，其中所述局部用制剂任选含有黄原胶或吉兰糖胶。
11.权利要求1、2或3定义的式I化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物在制备用于治疗高眼压症或青光眼的药物中的用途。
12.用于药物治疗的权利要求1、2或3定义的式I化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物。
13.权利要求1、2或3定义的式I化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、前药或混合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗黄斑水肿或黄斑变性、干眼症，增加视网膜和视神经乳头血液速度，增加视网膜和视神经氧张力或提供神经保护。
全文摘要
本发明涉及前列腺素E2受体EP
文档编号C07D279/06GK1764659SQ200480008186
公开日2006年4月26日 申请日期2004年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者X·比洛特, J·科卢西, Y·韩, M·-C·威尔逊, R·N·杨 申请人:麦克弗罗斯特加拿大有限公司