专利名称：一种分离纯化6－姜酚的方法
技术领域：
本发明涉及天然药物领域，具体涉及有效成分6-姜酚的分离方法，即利用多种色谱手段有序联用分离中药姜中有效成分6-gingerol的方法。
背景技术：
生姜及干姜分别为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎及干燥根茎，均为常用中药。姜中的主要成分为挥发油类成分、姜辣素类成分以及二苯基庚烷类成分。其中姜辣素类成分含量大，具有明显的辣味及生物活性，经现代研究证实具有多方面的药理活性，可作为生姜及干姜药理活性及质量控制的研究依据。姜辣素类成分种类很多，其中含量最高的为6-gingerol，其中文名有6-姜酚，6-姜醇等多个，命名存在一定混乱，故此本专利以其英文名为准。因此，6-gingerol的分离纯化对推进姜类中药的药理研究和质量控制有明显的意义。
6-gingerol因其分子中有8-羟基酮结构，理化性质不稳定，而且与多种结构类似的化学成分并存，分离难度较大。国外某些公司有商品化6-gingerol对照品供应，但售价昂贵，每20mg单价在200美元左右。而国内已有分离方法往往要采用某些分离能力较高但产量较小的方法如薄层刮板法和分析型HPLC法。
CN1616391A公开了一种从姜中分离6-姜酚的方法，其先从姜的丙酮提取物中得到姜油树脂，再经硅胶柱色谱分离、HPLC分离。原料为丙酮浸泡所得姜油树脂，得率较低，成份相对复杂，不利于后续的分离。它在第一步硅胶分离时，洗脱剂采用正己烷和乙醚的混合溶液，价格昂贵，而且极具挥发性，比例在色谱过程中易发生变化。在HPLC分离步骤中，采用的是水-甲醇-冰醋酸的混合流动相，这导致后处理步骤繁琐，降低了得率，增加了成本。
也有文献报导(结晶姜酚的制取与鉴定，《食品与工业发酵》2005年第31卷第10期p48-50)，其第一、二步同CN1313391A，其用干法柱层析，如文献所述，700g硅胶仅载样20g，这种方法不利于较大规模的应用。另外，文献采用制备薄层及Sephadex LH 20柱层析方法对第一步硅胶柱层析中所得6-gingerol粗品进行精制。制备薄层法载样量少，分离能力有限，仅适用于实验室少量制备用。Sephadex LH 20柱层析所用填料昂贵，操作时间长，分离效能低，不适合大规模应用。另外，文献对最后进行正己烷重结晶步骤没有特别说明。经实验证实，在仅加热的情况下，6-gingerol在正己烷中溶解情况不好。
很明显，由于成本和产量的制约，以6-gingerol为基础开展姜类中药的药理研究和质量控制目前还难以实现。
我国超临界流体萃取研究始于20世纪80年代初，目前已进入商品应用阶段，市场上已有成熟商品姜超临界流体萃取物供应。超临界流体萃取技术由于温度低，且系统密闭，可大量保存对热不稳定及易氧化的6-gingerol，为6-gingerol的分离纯化创造了良好的先决条件。所以如何以姜超临界流体萃取物为基础，恰当应用多种色谱手段的组合，研究一种快速、易于操作、成品质量好且产量较大的制备6-gingerol的方法，是本技术领域面临的主要问题。
发明内容
本发明为了克服现有技术的固有不足，公开了一种快速、易于操作、成品质量好且产量较大的制备姜中主要活性成分6-gingerol的方法。
本发明从姜超临界流体萃取物中分离纯化6-姜酚的方法，依次包括下列步骤a、硅胶柱色谱分离；b、HPLC纯化；c、重结晶，其中a步骤中梯度洗脱的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混和溶液。
发明人在研究中发现，利用文献报道的乙醚正己烷混合溶剂作为洗脱剂价格昂贵，而且极具挥发性，比例在色谱过程中易发生变化。发明人也曾尝试过很多种洗脱剂，最后发现，用石油醚和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂不仅价格低廉，而且色谱过程中其组成变化较小。本步骤的收率可以达到4～7％，远远高于用乙醚正己烷混合溶剂洗脱的收率。
由于6-gingerol在常温下为油状液体，易溶于各种中高极性的有机溶剂，难溶于水及正己烷。发明人发现，6-gingerol以超声为辅助手段的条件下，可以在沸腾的正己烷中溶解，在冰箱中静置后6-gingerol以白色之黄白色结晶状态析出，产品纯度可进一步提高，而且产品外观良好。因此，本发明重结晶所用溶剂是正己烷，采用沸水和超声并用以助溶。实验证明，每100ml正己烷可以溶解约1g 6-gingerol，适合批量制备。
在本发明中，HPLC纯化时所用的流动相优选甲醇。本发明使用的是单一甲醇流动相，后处理简单，且所回收甲醇可以考虑重复利用，具有一定环保因素。
上述制备方法中，a步骤后还可以进一步包括硅胶柱色谱精制步骤，精制步骤的洗脱剂为石油醚和丙酮的混和溶液。精制步骤可使最终成品的纯度达98％以上，而没有精制过程的成品最后纯度为95％以上。
上述制备方法中，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为5～9∶1。
上述制备方法中，石油醚和丙酮的体积比优选为4～8∶1本发明更优选的制备方法依次包括如下步骤a、硅胶柱色谱分离以姜超临界流体萃取物为原料，拌样，以层析用硅胶作为固定相，梯度洗脱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯混和溶液，收集含有6-姜酚部分，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚粗品；b、硅胶柱色谱精制将a步所制得的6-姜酚粗品拌样，以层析用硅胶作为固定相，洗脱剂为石油醚和丙酮混和溶液，收集其中主要色带，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚精制品；c、HPLC纯化将b步所得6-姜酚精制品用甲醇溶解，以制备HPLC纯化，流动相为纯甲醇，收集主要色谱峰，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚纯品；d、重结晶将c步所得6-姜酚纯品用正己烷重结晶，用正己烷溶解6-姜酚时采用沸水和超声两种手段并用以助溶。
本发明的制备方法易于操作、成品质量好且产量高。尤其是通过精制步骤的产品所制备的6-gingerol纯度达98％以上。本发明的产品收率远远高于现有技术中的收率。各步骤中的收率如下步骤硅胶粗分硅胶精制制备HPLC重结晶收率4-7％ 约30％ 30-50％ 50-60％具体实施方式
实施例1(1)硅胶柱色谱初步分离以商品姜超临界流体萃取物300g为原料，以100～200目柱层析硅胶200g拌样，以100～200目柱层析用硅胶2kg作为固定相，梯度洗脱，洗脱剂极性依次为石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC检验合并，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol粗品16.5g，收率5.5％。其纯度在65％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(2)硅胶柱色谱精制将上步所制得的6-gingerol粗品拌样，以200～300目层析用硅胶作为固定相，硅胶用量为所用6-gingerol粗品的20倍，洗脱剂为石油醚∶丙酮＝4∶1，收集其中主要色带，TLC检验合并，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol精制品6.5g，收率39％。其纯度在80％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(3)制备HPLC纯化将上步所得6-gingerol精制品用适量甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，以Angilent1100系列制备HPLC纯化，流动相为纯甲醇，固定相为C18，流速10mL/min，紫外检测器，检测波长为254nm，收集主要色谱峰，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol纯品2g，收率30％。其纯度在96％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(4)重结晶将上步所得6-gingerol纯品用正己烷重结晶。
重结晶步骤为将沸水加入超声清洗器，将6-gingerol纯品中加入100mL正己烷，超声条件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷冻室中(约-10℃)，静置过夜，则可见微黄白色至白色6-gingerol结晶析出。约1.2g，收率60％。其纯度在98％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
实施例2(1)硅胶柱色谱初步分离以商品姜超临界流体萃取物250g为原料，以100～200目柱层析硅胶200g拌样，以100～200目柱层析用硅胶1.5kg作为固定相，梯度洗脱，洗脱剂极性依次为石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC检验合并，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol粗品约12g，收率4.8％。其纯度在65％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(2)硅胶柱色谱精制将上步所制得的6-gingerol粗品拌样，以200～300目层析用硅胶作为固定相，硅胶用量为所用6-gingerol粗品的15倍，洗脱剂为石油醚∶丙酮＝5∶1，收集其中主要色带，TLC检验合并，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol精制品约4g，收率33％。其纯度在80％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(3)制备HPLC纯化将上步所得6-gingerol精制品用适量甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，以Angilent1100系列制备HPLC纯化，流动相为纯甲醇，固定相为C18，流速10mL/min，紫外检测器，检测波长为254nm，收集主要色谱峰，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol纯品约2g，收率50％。其纯度在95％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(4)重结晶将上步所得6-gingerol纯品用正己烷重结晶。
重结晶步骤为将沸水加入超声清洗器，将6-gingerol纯品中加入100mL正己烷，超声条件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷冻室中(约-10℃)，静置过夜，则可见微黄白色至白色6-gingerol结晶析出。约1.3g，收率65％。其纯度在98％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
实施例3(1)硅胶柱色谱初步分离以商品姜超临界流体萃取物100g为原料，以100～200目柱层析硅胶60g拌样，以100～200目柱层析用硅胶1.0kg作为固定相，梯度洗脱，洗脱剂极性依次为石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC检验合并，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol粗品。约为6.5g，得率6.5％，其纯度在65％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(2)制备HPLC纯化将上步所得6-gingerol粗品用适量甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，以Angilent1100系列制备HPLC纯化，流动相为纯甲醇，固定相为C18，流速10mL/min，紫外检测器，检测波长为254nm，收集主要色谱峰，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-gingerol纯品。约为2g，得率31％，其纯度在85％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
(4)重结晶将上步所得6-gingerol纯品用正己烷重结晶。
重结晶步骤为将沸水加入超声清洗器，将6-gingerol纯品中加入100mL正己烷，超声条件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷冻室中(约-10℃)，静置过夜，则可见微黄白色至白色6-gingerol结晶析出。最后得到成品1.2g，得率60％，其纯度在95％以上(HPLC检验，面积归一化法)。
权利要求
1.一种从姜超临界流体萃取物中分离纯化6-姜酚的方法，依次包括下列步骤a、硅胶柱色谱分离；b、HPLC纯化；c、重结晶；其特征是a步骤中梯度洗脱的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混和溶剂。
2.权利要求1的方法，其中重结晶所用溶剂是正己烷，并采用沸水和超声并用以助溶。
3.权利要求1的方法，在a步骤后还包括硅胶柱色谱精制步骤，精制步骤的洗脱剂为石油醚和丙酮的混和溶剂。
4.权利要求1的方法，其中HPLC纯化时所用的流动相为甲醇。
5.权利要求1的方法，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比为5～9∶1。
6.权利要求3的方法，其中石油醚和丙酮的体积比为4～8∶1。
7.权利要求1至6的任一项的方法，依次包括下列步骤a、硅胶柱色谱分离以姜超临界流体萃取物为原料，拌样，以层析用硅胶作为固定相，梯度洗脱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯混和溶剂，收集含有6-姜酚部分，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚粗品；b、硅胶柱色谱精制将a步所制得的6-姜酚粗品拌样，以层析用硅胶作为固定相，洗脱剂为石油醚和丙酮混和溶剂，收集其中主要色带，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚精制品；c、HPLC纯化将b步所得6-姜酚精制品用甲醇溶解，以制备HPLC纯化，流动相为纯甲醇，收集主要色谱峰，置旋转蒸发仪上蒸干，即得6-姜酚纯品；d、重结晶将c步所得6-姜酚纯品用正己烷重结晶，用正己烷溶解6-姜酚时采用沸水和超声两种手段并用以助溶。
全文摘要
本发明涉及天然药物领域，具体涉及有效成分6－姜酚的分离方法，本发明利用多种色谱手段有序联用分离中药姜中有效成分6－gingerol，本发明的分离方法快速、易于操作、成品质量好且产量较大。
文档编号C07C45/00GK1994997SQ200610161540
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者李萍, 王伟, 李沁, 楚楚 申请人:中国药科大学