专利名称：利用组织培养生产大豆异黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种农业技术领域的生产方法，具体涉及一种利用组织培养生产 大豆异黄酮的方法。
背景技术：
大豆异黄酮(soybean isof lavones)是大豆在生长过程中形成的次级代谢产
物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素，其有效成分主要是染料木素
(genistein)和大豆苷元(daidzeill)。大豆异黄酮是大豆中一类非常重要的非营
养成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨质疏松、类似雌性激素的作
用。目前发现的天然存在的大豆异黄酮为多酚类化合物，主要分布于大豆种子的
子叶和胚轴中。目前国内外主要采用直接从大豆中提取异黄酮；从大豆加工后
的中间产物和废弃物中提取异黄酮，以及用分解与合成的方法生产大豆异黄酮。
目前采用的技术大部分是直接从大豆粉、豆粕中提取大豆异黄酮。
经对现有技术文献的检索发现，中国专利申请号为200710047155.0，发明名
称为生产大豆异黄酮的方法的专利中公开了一种通过农根杆菌侵染大豆无菌苗
的不同部位产生毛状发根，利用发根培养高效生产大豆异黄酮的方法。此方法是
通过发根农杆菌侵染大豆无菌苗不同部位，产生毛状根，通过对毛状根的培养生 产大豆异黄酮。这种方法得到的毛状根在扩大培养前要进行多次除菌，过程比较
繁琐，对操作人员的要求较高，方法不易掌握。另外不同的发根农杆菌对不同的 大豆品种的侵染能力不同，导致产生发根的效率有很大差别，在加上操作者的不 同，使得这种产生发根方法的稳定性受到影响。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用组织培养生产大豆异 黄酮的方法。本发明中的生产方法利用不同的大豆外植体，经过诱导培养得到大量的愈伤组织，从愈伤组织中提取大豆异黄酮，从而生产大豆异黄酮。这种方法
不受季节及生育期的限制，方便，易操作，稳定性强。 本发明是通过以下技术方案实现的 第一步，大豆无菌苗的获得取成熟的大豆种子，用灭菌剂进行灭菌，然
后将大豆种子接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗； 所述灭菌剂是指氯气或者过饱和漂白粉精片溶液。 所述大豆种子在萌发培养基上的培养温度为24。C到26°C。 所述大豆种子在萌发培养基上的培养时间为7到10天。
所述萌发培养基为MS固体培养基，B5固体培养基，或MS固体培养基的无 机成分加上B5固体培养基的有机成分。
第二步，外植体诱导愈伤组织切取在第一步中得到的大豆无菌苗的组织， 包括下胚轴、子叶节、子叶、真叶及根等部位，接种到愈伤组织诱导培养基中，
每30天继代培养1次，连续继代培养3次；
所述愈伤组织诱导培养基，为以下三种培养基中任取一种
1、 MS固体培养基的无机成分，加上B5固体培养基的有机成分，同时在该 混合固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L的 2， 4二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水。
2、 MS固体培养基，同时在该固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨 基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L的2， 4 二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水。
3、 B5固体培养基，同时在该固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基 腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L的2， 4二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水。
第三步，大豆异黄酮的提取用乙醇从第二步中得到的愈伤组织中提取大 豆异黄酮。
所述乙醇是指体积浓度为70%-80%的乙醇溶液。
所述用乙醇从愈伤组织中提取大豆异黄酮的方法是指将愈伤组织打碎，用 70%-80%的乙醇提取，以0. 5g样品中使用5ml乙醇的配比进行提取。
本发明中利用组织培养生产大豆异黄酮的方法利用不同的大豆外植体，经过 诱导培养得到大量的愈伤组织，从愈伤组织中提取大豆异黄酮，从而生产大豆异黄酮。经紫外分光光度计法检测愈伤组织中大豆异黄酮的主要有效成分染料木素 和大豆甙元的含量，在愈伤组织诱导培养90天后，愈伤组织中大豆异黄酮的总 含量可以达到培养前大豆外植体中总含量的IOO倍以上，从而达到高效生产大豆 异黄酮的目的。本方法工艺简单，操作方便，可用于以大豆为材料的大豆异黄酮 生产，同样也可以用于其它豆科植物材料(如野生及多年生野生大豆等)。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实 施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例1:l.选择优质大豆品种，取健康、成熟的大豆种子，用氯气消毒2到10小时，将大豆种脐向下接种到MS固体培养基中，培养基的pH值为5.5。接种在培养基 上的大豆种子在24'C条件下培养7天，得到健康的大豆无菌苗。2. 切取大豆无菌苗的真叶，接种到愈伤组织诱导培养基中(MS固体培养基 的无机成分，加上B5固体培养基的有机成分，同时在该混合固体培养基中添加 浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. Omg/L的2， 4 二氯苯氧乙酸，余 量为琼脂和灭菌水)，每30d继代培养l次。24"C培养温度下培养90天。3. 取出愈伤组织，打碎，用70%的乙醇提取，以0.5g样品中使用5ml乙 醇的配比进行提取。经紫外分光光度计法检测培养90天的愈伤组织中大豆苷元及染料木素的含 量，愈伤组织中苷元及染料木素的总含量分别比培养前大豆外植体中的总含量增 加了增加100倍以上。实施例2:1. 选用高异黄酮含量的大豆品种，挑选饱满，无病虫害的当年大豆种子，用 漂白粉精片过饱和溶液浸泡大豆种子15分钟，再用无菌水漂洗3次，将种子接 种到B5固体培养基上，在25。C条件下培养10天，得到无菌苗。2. 切取大豆无菌苗的根，接种到愈伤组织诱导培养基中(MS固体培养基，同时在该固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L 的2， 4二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水)，每30d继代培养l次。在24'C -27°C的培养温度下培养90天。3.取出愈伤组织，打碎，用70%的乙醇提取，以0.5g样品，5ml乙醇的配 比进行提取。经紫外分光光度计法检测培养90天的愈伤组织中大豆苷元及染料木素的含 量，愈伤组织中苷元及染料木素的总含量分别比培养前大豆外植体中的总含量增 加了 58倍和34倍。实施例3:1. 选用高异黄酮含量的大豆材料，挑选饱满，无病虫害的当年大豆种子， 用氯气灭菌2小时一24小时，将灭菌的种子接种到MS固体培养基的无机成分加 上B5固体培养基的有机成分所组成的固体培养基上，在26'C条件下培养9天， 得到无菌苗。2. 切取大豆无菌苗的子叶，接种到愈伤组织诱导培养基中(B5固体培养基， 同时在该固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L 的2， 4二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水)，每30d继代培养l次。在24'C -27匸的培养温度下培养90天。3. 取出愈伤组织，打碎，用70%的乙醇提取，以0.5g样品，5ml乙醇的配 比进行提取。经紫外分光光度计法检测培养90天的愈伤组织中大豆苷元及染料木素的含 量，愈伤组织中苷元及染料木素的总含量分别比培养前大豆外植体中的总含量增 加了 15倍和16倍。以上实施例中使用的培养基为现有技术，具体说明如下注基本培养基配方(成分的单位均为mg/L)1、 MS固体培养基配方MS固体培养基的无机成分硝酸钾KN03 1900，硝酸铵NH4N03 1650， 磷酸二氢钾 KH2P04 170，硫酸镁MgS04. 7H20 370，氯化钙CaC12. 2H20 440， 碘化钾 KI 0.83，硼酸 H3B03 6.2，硫酸锰 MnS04.4H20 22.3，硫酸锌ZnS04. 7 H20 8. 6，钼酸钠 Na2Mo04. 2 H20 0. 25，硫酸铜 CuS04. 5 H20 0. 025， 氯化钴 CoC12.62 0.025，乙二胺四乙酸二钠 Na2. EDTA 37.3，硫酸亚铁 FeS024. 7H20 27.8;MS固体培养基的有机成分肌醇100，甘氨酸2，盐酸硫胺素VB1 0.1， 盐酸吡咳醇 VB6 0.5，烟酸 VB5或VPP 0.5，蔗糖 sucrose 30;固体培养基加琼脂粉6000pH值为5.8。2、 B5固体培养基配方(mg/L)B5固体培养基的无机成分NaH2P04'H20(磷酸二氢钠)150,認03(硝酸钾) 2 500， (NH4)2S04(硫酸铵)134， MgS04'7H20(硫酸镁)250， CaC12.2H20(氯化 铐)150， Na-Fe-EDTA(乙二胺四乙酸铁钠)28， MnS04'H20(硫酸锰)10， H3B03(硼 酸)3.0， ZnS04'7H20(硫酸锌)2.0， NaMo04'2H20(钼酸钠)0.25， CuS04'5H20(硫 酸铜)0.025， CoC12'6H20(氯化钴)0.025， KI (碘化钾)0.75;B5固体培养基的有机成分盐酸硫胺素10，盐酸吡哆素1，烟酸1，肌_ 肌醇100,蔗糖20000;固体培养基加琼脂粉6000;pH值为5.5。MS液体培养基，B5液体培养基配方同上述MS固体培养基，B5固体培养基， 但不加琼脂。由于发培养基是发根培养生产大豆异黄酮必须的消耗材料，而且使用过的发 根培养基中大豆异黄酮的总量高于该培养基中生长的所有发根中大豆异黄酮的 总量。本实施例可以在不增加成本，不改变程序和工艺的条件下，使大豆异黄酮 生产及提取的效率较原来单纯利用发根提取大豆异黄酮的方法至少提高一倍，甚 至更多。
权利要求
1、一种利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，大豆无菌苗的获得取成熟的大豆种子，用灭菌剂进行灭菌，然后将大豆种子接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗，其中萌发培养基为MS固体培养基，B5固体培养基，或MS固体培养基的无机成分加上B5固体培养基的有机成分；第二步，外植体诱导愈伤组织切取在第一步中得到的大豆无菌苗的组织，包括下胚轴、子叶节、子叶、真叶及根等部位，接种到愈伤组织诱导培养基中，每30天继代培养1次，连续继代培养3次；第三步，大豆异黄酮的提取用乙醇从第二步中得到的愈伤组织中提取大豆异黄酮。
2、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是，第一步中所述的灭菌剂是指氯气或者过饱和漂白粉精片溶液。
3、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第一步中所述的大豆种子在萌发培养基上的培养温度为24'C到26°C。
4、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第二步中所述的愈伤组织诱导培养基为MS固体培养基的无机成分，加上B5 固体培养基的有机成分，同时在该混合固体培养基中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1.0mg/L的2， 4二氯苯氧乙酸，余量为琼脂和灭菌水。
5、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第二步中所述的愈伤组织诱导培养基为MS固体培养基，同时在该固体培养基 中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L的2， 4 二氯苯氧乙 酸，余量为琼脂和灭菌水。
6、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第二步中所述的愈伤组织诱导培养基为B5固体培养基，同时在该固体培养基 中添加浓度为0. lmg/L的6-苄氨基腺嘌呤与浓度为1. 0mg/L的2， 4 二氯苯氧乙 酸，余量为琼脂和灭菌水。
7、 根据权利要求1所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第三步中所述的用乙醇从愈伤组织中提取大豆异黄酮的方法是指将愈伤组织打 碎，用乙醇提取，以0.5g样品中使用5ml乙醇的配比进行提取。
8、 根据权利要求7所述的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，其特征是， 第三步中所述的乙醇，是指体积浓度为70%-80%的乙醇溶液。
全文摘要
本发明涉及一种农业技术领域的利用组织培养生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤第一步，大豆无菌苗的获得取成熟的大豆种子，用灭菌剂进行灭菌，然后将大豆种子接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗；第二步，外植体诱导愈伤组织切取在第一步中得到的大豆无菌苗的组织，包括下胚轴、子叶节、子叶、真叶及根等部位，接种到愈伤组织诱导培养基中，每30天继代培养1次，连续继代培养3次；第三步，大豆异黄酮的提取用乙醇从第二步中得到的愈伤组织中提取大豆异黄酮。本发明的方法工艺简单，不受季节及生育期的限制，方便易操作，且稳定性强。
文档编号C07D311/36GK101318947SQ20081004045
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月10日 优先权日2008年7月10日
发明者周斐红, 曹越平, 筠 朱, 冰 陈 申请人:上海交通大学