专利名称：一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法
一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法
技术领域：
本发明涉及生物化工领域，具体地说，是一种广泛使用的脱氧核苷三磷
酸(dNTP)酶法合成产品的分离提纯方法。背景技术：
通常对脱氧核苷单磷酸(dNMP)合成脱氧核苷三磷酸(dNTP)的生物合成反应液，采用沉降操作使生成的dNTP以钡盐的形式被分离出来，如用溴化钡水溶液使dNTP从反应液中分离出来的沉降分离、再使用离子交换树脂洗脱dNTP，使其成为dNTP水溶液的反复沉降洗脱的分离提纯方式，或者将dNTP的生物合成反应液直接用离子交换树脂填充柱洗脱，再用高压液相色谱分离提纯的方法手段。
现有对dNTP的生物合成反应液分离提纯的方法，获得高纯度的dNTP产品(含量在98%以上)必需使用液相色谱进行分离，分离速度慢，流动相溶剂耗用量大，无法满足大批量工业化生产的需要，而且由于使用毒性重金属离子水溶液以及离子交换树脂，相应需要非常大量的水溶液对它们的使用进行处理，这些处理势必带来严重的水资源污染和水处理工艺机器运转的高能耗等，以上技术方法是造成dNTP产品非常高昂价格的重要原因。
脱氧核苷三磷酸(dNTP)包括四种组分脱氧核苷三磷酸(dNTP)产品包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。 dNTP是DNA生物合成过程中必不可缺的中间体，它具有商业性，但是价格非常昂贵，如美国SIGMA公司dATP的价格高达250.5美元/100mg (含量97%以上，2006~2007价格目录)。目前市场上存在的dNTP生产方法主要有化学合成法以及酶合成法；与化学法相比，酶合成法可降低可观的成本，有着更好的经济性以及环保性。dNTP的合成需要两个酶的磷酸化反应，即从脱氧核苷单磷酸盐dNMP转化为脱氧核苷二磷酸dNDP，进而再转化为dNTP的过程。20世纪80年代，美国著名的科学家Whitesides成功开发了四种dNTP中的一种dATP的酶合成法，将l-mmol以下规模的dATP生产扩展到了 200-mmol的大批量生产；他们将dATP从生物合成反应混合液中以其钡盐形式离析出来，初步提纯可达到60%的纯度；进一步用离子交换树脂进行洗脱提纯可使dATP达到95。/。的纯度。高纯度的dATP (含量在98%以上)对cDNA合成、测序和标记等反应的成功非常重要，但是高纯度产品的获得通常需要用高压液相色谱进行操作，耗时费力，液料使用排放量大，污染严重。dATP产品的分离提纯长期以来是一个瓶颈问题，如何使合成制造的途径更方便更经济，使其用于DNA合成以及其它生物材料合成，成为长期以来人们研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，可避免使用毒性金属离子水溶液和离子交换树脂，以及由此带来的大量的水处理工艺缺陷，从而降低生产成本，减少环境污染。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其包含对脱氧核苷三磷酸产品中的脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸的分离提纯方法，其步骤为，
(1) 首先，在温度为4'C以下时，将脱氧核苷三磷酸生物合成反应液直接用有机溶剂沉降，脱氧核苷三磷酸生物合成反应液与有机溶剂的体积比为1:1-1:25，优选为1:4 1:15，得到脱氧核苷三磷酸的固形混合物；
(2) 其次，在温度为4'C以下时，将步骤(1)得到的固形混合物用超纯水溶解，用盐酸酸性水溶液调整pH值为0.1 2，优选为0.5 1.5，再用有机溶剂沉降，得到纯度95%以上的脱氧核苷三磷酸固形物；然后再将该固形物用少量超纯水溶解，再用氢氧化钠碱性水溶液调整pH值为5 11 ，优选为7.0 9.0，液氮冷冻并进行冷冻干燥，得到脱氧核苷三磷酸钠盐产品；
所述的有机溶剂为无水乙醇或者异丙醇中的一种，优选为无水乙醇。本发明一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法的积极效果是
(1) 本发明避免使用了毒性的钡盐水溶液沉降dNTP生物合成反应液，并且避免使用离子交换树脂分离提纯，从而避免由这些操作所带来的水处理工艺高能耗的缺陷；
(2) 本发明的脱氧核苷三磷酸dNTP的分离提纯方法，较现行方法能快速、高效的将大批量的dNTP产品从生物合成反应液中分离出来，达到较好的提纯效果(含量在95%以上)；
(3) 本发明大大降低生产成本，减少水资源的环境污染以及工艺能耗；
(4) 本发明脱氧核苷三磷酸dNTP的分离提纯方法使得该产品具有工业化生产的意义，因此具有积极的社会和经济效果。
具体实施方式
以下提供本发明一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法的具体实施方式
。实施例1
三磷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷dATP的分离提纯
将pH值在7.0~8.0约含dATP100-mM的酶合成反应溶液50ml冷却到4度(合成反应过程中定时进行HPLC测定dAMP， dATP， dADP与丙酮酸盐)，移至1L的三口烧瓶中，在冰浴中缓慢加入两倍体积的无水乙醇(约200mL)，产生的白色沉淀离心收集。上清液组成用HPLC分析，无dATP峰形显示。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成30mL水溶液，用盐酸调整pH值在2.0以下，在冰浴中缓慢倒入装有无水乙醇(100mL)的500mL烧杯中，产生的白色沉淀经缓慢搅拌后离心收集。小心称取少量白色固体(~10mg)溶于水中(~10mL)，用HPLC分析，dATP峰形显示含量在98。/。以上。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成lOmL水溶液，并且用NaOH水溶液调整pH值至9.5 10.5。然后用液氮冷冻后，进行冷冻干燥。冷冻干燥后(25度,O.ltorr, 4h)得到2.08g (收率77.9%，纯度98%)的白色固体产品dATP钠盐。
实施例2
三磷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷dGTP的分离提纯
将pH值在7.0~8.0约含dGTP 20-mM的50mL酶合成反应溶液冷却到4度(合成反应过程中定时进行HPLC测定dGMP， dGTP， dGDP与丙酮酸盐)，移至1L的三口烧瓶中，在冰浴中缓慢加入异丙醇(200mL)，产生的白色沉淀离心收集。上清液组成用HPLC分析，无dGTP峰形显示。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成30mL水溶液，用盐酸调整pH值为1.5左右，在冰浴中缓慢倒入装有无水乙醇(100mL)的500mL烧杯中，产生的白色沉淀经缓慢搅拌后离心收集。小心称取少量白色固体( 10mg)溶于水中( 10mL)，用HPLC分析，dGTP峰形显示含量在98Q/。以上。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成10mL水溶液，并且用NaOH水溶液调整pH值至8.0 9.0。然后用液氮冷冻后，进行冷冻干燥。冷冻干燥后(25度，0.1torr,4h)得到0.49 g (收率82.0%，纯度98%)的白色固体产品dGTP钠盐。
实施例3
三磷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷dCTP的分离提纯
将pH值在7.0~8.0约含dCTP 10-mM的lOOmL酶合成反应溶液冷却到4度(合成反应过程中定时进行HPLC测定dAMP， dATP， dADP与丙酮酸盐)，移至1L的三口烧瓶中，在冰浴中缓慢加入无水乙醇(200mL)，产生的白色沉淀离心收集。上清液组成用HPLC分析，无dCTP峰形显示。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成30mL水溶液，用盐酸调整pH值为0.5左右，在冰浴中缓慢倒入装有无水乙醇G00mL)的500mL烧杯中，产生的白色沉淀经缓慢搅拌后离心收集。小心称取少量白色固体( 10mg)溶于水中( 10mL)，用HPLC分析，dCTP峰形显示含量在98。/。以上。在冰浴中将沉淀用超纯水溶解成10mL水溶液，并且用NaOH水溶液调整pH值至5.5~6.5。然后用液氮冷冻后，进行冷冻干燥。冷冻干燥后(25度，O.ltorr, 4h)得到0.39 g(收率74.7%，纯度96%)的白色固体产品dCTP钠盐。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其特征在于，包含对脱氧核苷三磷酸产品中的脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸的分离提纯方法，包含步骤为，(1)首先，在温度为4℃以下时，将脱氧核苷三磷酸生物合成反应液直接用有机溶剂沉降，脱氧核苷三磷酸生物合成反应液与有机溶剂的体积比为1∶1～1∶25，得到脱氧核苷三磷酸的固形混合物；(2)其次，在温度为4℃以下时，将步骤(1)得到的固形混合物用超纯水溶解，用盐酸酸性水溶液调整pH值为0.1～2，再用有机溶剂沉降，得到纯度95％以上的脱氧核苷三磷酸固形物；然后再将该固形物用超纯水溶解，再用氢氧化钠碱性水溶液调整pH值为5～11，液氮冷冻并进行冷冻干燥，得到脱氧核苷三磷酸钠盐产品；所述的有机溶剂为无水乙醇或者异丙醇中的一种。
2. 根据权利要求1所述的一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其特征 在于，在其步骤(1)中，脱氧核苷三磷酸生物合成反应液与有机溶剂的体积 比优选为1:4 1:15。
3. 根据权利要求1所述的一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其特征 在于，在其步骤(1)中，所述的有机溶剂优选为无水乙醇。
4. 根据权利要求1所述的一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其特征 在于，在其步骤(2)中，在温度为4度以下时，将将步骤(1)得到的固形 混合物用超纯水溶解，用盐酸酸性水溶液调整pH值优选为0.5~1.5。
5. 根据权利要求1所述的一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其特征 在于，在其步骤(2)中，然后再将该固形物用超纯水溶解，再用氢氧化钠碱 性水溶液调整pH值优选为7.0~9.0。
全文摘要
本发明公开了一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，在温度为4℃以下时，将脱氧核苷三磷酸生物合成反应液直接用有机溶剂沉降，脱氧核苷三磷酸生物合成反应液与有机溶剂的体积比1∶1～1∶25，得到脱氧核苷三磷酸的固形混合物；在温度为4℃以下时，将该固形混合物用超纯水溶解，用酸性水溶液调整pH值为0.1～2，再用有机溶剂再沉降，可得到脱氧核苷三磷酸固形物；然后再将该固形物用超纯水溶解，再用氢氧化钠碱性水溶液调整pH值为5～11，液氮冷冻并进行冷冻干燥，即得到脱氧核苷三磷酸钠盐产品。本发明的优点快速的分离，较好提纯效果，降低生产成本，减少水资源污染以及工艺能耗，可用于工业化生产。
文档编号C07H19/20GK101633681SQ20081004098
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者冀亚飞, 慧 李, 段梅莉, 英智威, 辛秀娟, 杰 鲍 申请人:华东理工大学