月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是一类从我国东海海洋植物冈村
凹顶藻(Warnwra/)中分离得到的月桂烷型倍半萜类化合物 或其衍生物、及其制备方法和用途。该类化合物对胰脂肪酶具有明显 的抑制活性，可作为一类研制新的预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾 病药物的先导化合物，也可在制备治疗临床常见多发的肥胖症及相关 代谢性疾病药物中应用。
背景技术：
在近20年中，全世界尤其是发达国家人群中肥胖的发病率日益增 多。肥胖发生的原因是多方面的，如遗传因素、环境因素、饮食习惯 等，其中高脂饮食是导致肥胖的重要原因。由于经济的发展和生活水 平的提高，运动不足和摄食能量相对过剩逐渐成为现代人生活方式的 主要问题，代步工具的发达等导致现代人的能量消耗减少，而人类背 离传统饮食模式的速度越来越快，新的饮食模式和西方化的食物特点 是具有高饱和脂肪含量和较低纤维含量，以致食品能量密度过大，能 量摄入过多。这导致了众多现代人机体能量的摄入超过了能量消耗。 过剩的能量一部分作为脂肪贮存在脂肪组织中， 一段时间后它的积累 导致肥胖以及肥胖相关疾病，比如糖尿病、癌症、心脏病、高脂血症 和脂肪肝等的发生。
如何合理有效地解决肥胖给人类健康带来的影响是医药界面临的 重要研究课题。治疗肥胖症的药理方法集中于开发增加能量消耗的药 物或减少能量摄取的药物。而减少能量摄取的主要方法就是减小身体消化和吸收的食品，尤其是脂肪。胰脂肪酶是肠道中脂肪消化吸收所 必需的酶。食物中的脂肪在胰脂肪酶作用下被水解为单酰甘油和游离 脂肪酸后，在肠道被吸收，然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积， 最终可导致肥胖以及相伴的高脂血症、糖尿病等代谢性疾病的发生。 应用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用， 达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的。因而开发和应用有效的 脂肪酶抑制剂受到人们的关注。目前用于治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主 要来源于植物提取物和化学合成。从植物中提取抑制脂肪酶活性成分 的报道较多，但效果并不充分，即使某植物的提取物有效果，可是其 中的活性成分以及其量并不确定。目前市场畅销的脂肪酶抑制剂是赛 尼可，赛尼可具有活性强，稳定性好等特点，但是其存在着包括难以 控制的肠道症状、油便和呕吐腹涨等缺点。因此寻找新的胰脂肪酶抑 制剂对肥胖、糖尿病等代谢性疾病具有重要的意义。
冈村凹顶藻aaw^wc/a o&mMra/)属于仙菜目松节藻科凹顶藻属 植物，全球约有100多种，我国海域分布有31种，是红藻中最为常见的 藻类植物之一。冈村凹顶藻含有丰富的次级代谢产物，大体可分为倍 半碎、二碎、三碎、脂类和烯炔类等多种结构类型，其中倍半薛类化 合物的结构类型最为多样，报道最多的是花侧伯烷型和月桂烷型倍半 薛。由于海洋中卣离子含量高，这些代谢产物绝大多数为卣代的化合 物。
在开发利用我国的海洋生物资源，从中寻找具有生物活性及药用 前景的海洋天然产物的过程中，我们发现，中国东海冈村凹顶藻的乙 醚粗提物对胰脂肪酶具有很好的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研 究，导致了月桂烷型倍半辟类化合物劳藻酚(Laurinterol)和海兔素 (Aplysin)的发现。体外胰脂肪酶抑制活性筛选实验表明，劳藻酚及其衍生物、海兔素及其衍生物均对胰脂肪酶具有显著的抑制作用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种从我国东海海洋植物冈村凹顶藻中提 取分离得到的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物。
本发明的另 一 目的是提供上述月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生 物的制备方法。
本发明的还一 目的是提供上述月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生
物在制备胰脂肪酶抑制剂药物中的应用；进一步地在制备预防或治疗 代谢性疾病，包括肥胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝药物中应用或 可作为预防或治疗肥胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝及相关代谢性 疾病药物的先导化合物。
本发明的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物具有如下的化学结 构式
优选地
R3 或
R。 R2、 R3和R4各自独立地为氢或面素。 ,，R,、 R2、 R3和R4各自独立地为氢或溴原子。
具体地
劳藻酚
、8-溴劳藻酚、4,8,15-三溴劳
藻酚、海兔素
或8-溴海兔素。
上述卣素是指氟、氯
溴、碘等原子；优选溴原子。其包括以下步骤
l)提取将我国东海海洋植物冈村凹顶藻用丙酮溶剂提取，所得 提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏悬浮于水中，用乙醚萃取，所得 萃取液浓缩后得到乙醚浸膏；
2)分离对步骤1)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油 醚/丙酮梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比98:2洗脱部分，经200-300 目硅胶柱层析，以石油醚/乙醚梯度洗脱；其中，石油醚/乙醚体积比8:l 洗脱部分，经400-600目硅胶柱层析，以正己烷洗脱并纯化得到海兔素； 石油醚/丙酮体积比90:10洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析， 以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱并纯化得到劳藻酚。
上述制备方法中，所述步骤l)中，所述的丙酮溶剂提取采用超声 提取。
上述制备方法中，所述步骤2)中，所述的石油醚/丙酮梯度洗脱 是以石油醚/丙酮体积比100:0 — 98:2 — 95:5 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50进行梯度洗脱；所述的石油醚/乙醚梯度洗脱是以石油醚/乙醚体 积比100:0 — 98:2 — 95:5 — 9:1 — 8:1 — 7:1进行梯度洗脱。
进一步地，上述的劳藻酚和海兔素通过卣素取代反应，得到其相 应的衍生物。
本发明还提供了月桂烷型倍半薛类化合物或其衍生物在制备胰脂 肪酶抑制剂药物中的应用；进一 步地在制备预防或治疗代谢失调性疾 病药物中的应用，所述代谢失调性疾病包括肥胖症、糖尿病、高脂血 症和脂肪肝。类化合物或其衍生物进行了胰脂肪酶抑 制活性测试，表明这些化合物具有明显的胰脂肪酶抑制作用。可用于 制备预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病的药物。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进 一 步阐述，但本发明不限此。
'H-NMR用Varian Inova 600型仪测定；MS (ESIMS及HRESIMS) 用Q-TOF Micro LC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶，为青岛海 洋化工厂生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析 纯。
如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积比。 实施例1:
月桂烷型倍半碎类化合物劳藻酚和海兔素的制备
(1) 提取我国东海冈村凹顶藻干重500g，用丙酮1000ml反复 超声提取3次，提取液合并后减压浓缩，所得粗浸膏混悬于500 ml水 溶液中，以乙醚500 ml反复萃取该混悬液3次，所得萃取液合并后减 压浓缩得到乙醚浸膏36.1 g。
(2) 分离乙醚浸膏36.1 g经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/ 丙酮100:0 —98:2 —95:5 —90:10 —80:20 —70:30 —50:50梯度洗脱,每个 梯度用量1000 ml;其中，石油醚/丙酮98:2洗脱液浓缩物得4.65 g,经 200-300目硅胶柱层析，以石油醚/乙醚100:0 —98:2 —95:5 —9:1 —8:1 — 7:1梯度洗脱；其中，石油醚/乙醚体积比8:1洗脱部分3.40 g，经400-600 目硅胶柱层析，以正己烷洗脱并纯化得到海兔素1.50 g;石油醚/丙酮 90:10洗脱液浓缩物得4.01 g,该部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析， 以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱并纯化得到劳藻酚2.8 g。劳藻酚 海兔素 Laurinterol Aplysin
劳藻酚的理化性质和波语数据如下白色针晶，分子式为 C15H19OBr; 'H NMR (300 MHz, CDC13) & 7.60 (s, H-ll)， 6.61 (s， H-8)， 5.24 (brs, -OH), 2.29 (s， H3-12)， 2.18 (dd， 《/= 12.6， 5.1 Hz, H一5)， 1.65 (dd, ■/= 12,6， 7.2 Hz， H-5)， 1.94， 1.26 (均为m， H2-4), 1.40 (s， H3-13)， 1.34 (s, H3-14), 1.15 (m， H-3), 0.56 (m, Hr 15); E歸附/z 294， 296 [M]+。
海兔素的理化性质和波镨数据如下白色针晶，分子式为 C15H19OBr; 画R (400 MHz, CDC13)《7.15 (s， H-ll), 6.59 (s, H-8), 2.30 (s， H3-12), 1.85 (m， H-3), 1.76, 1.57 (均为m, H2-5), 1.64， 1.15 (均为 m, Hr4), 1.31 (s, H3-13)， 1.28 (s， H3-14), 1.09 (d， J = 6.5 Hz, H3-15); EIMSm/z294， 296 [M]+。
实施例2:
8-溴劳藻酚(R,为溴、R2和R3同时为氢)
称取劳藻酚样品12.1 mg溶于2.0ml乙酸乙酯溶液中，加入1.5倍 当量的NaBr03水溶液，充分混合后，在搅拌下逐滴加入1.5倍当量的 NaHS03水溶液，室温反应18hr后，用乙酸乙酯萃取来终止反应，乙 酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到8-溴劳藻酚11.7 mg。
8-溴劳藻酚的理化性质和波谱数据如下C15H18OBr2; 'HNMR(300 MHz， CDC13) 5: 7.70 (s， H-ll), 5.78 (s， -OH)， 2.53 (s, H3-12), 2.23 (dd, J= 12,6, 5.1 Hz, H-5)， 1.64 (dd， 《/= 12.6， 7.2 Hz， H-5)， 1.94， 1.25 (均为m, H2-4)， 1.40 (s, H3-13)， 1.30 (s， H3-14), 1.10 (m， H-3)， 0.53 (m， Hr15); EIMS m/z 374, 359， 306 [M]+。4,8,15-三溴劳藻酚(R，、 R2和R3同时为溴)
称取劳藻酚样品67.5 mg溶于5.0 ml氯仿溶液中，加入1.5倍当量 的NaBr03水溶液，充分混合后，在搅拌下逐滴加入1.5倍当量的 NaHS03水溶液，室温反应18hr后，用乙酸乙酯萃耳又来终止反应，乙 酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到4,8,15-三溴劳藻酚26.7mg。
4，8，15-三溴劳藻酚的理化性质和波谱数据如下C15H16OBr4; ^ 画R (300 MHz, CDC13) c5i 7.15 (s, H-ll)， 5.58 (s， -OH), 3.58 (m, H-4), 3.43 (m， H-15), 3.01 (m， H-5), 2.69 (m， H-5)， 2.56 (s， H3-12), 1.26 (s, Hr13)， 1.04 (s， H3-14), 2.54 (m, H-3); EIMS m/z 532, 517, 357岡+。
实施例4:
8-溴海兔素(R4为溴)
称取海兔素样品11.0mg溶于2.0ml乙酸乙酯溶液中，加入1.5倍 当量的NaBr03水溶液，充分混合后，在搅拌下逐滴加入1.5倍当量的 NaHS03水溶液，室温反应18hr后，用乙酸乙酯萃取来终止反应，乙 酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到8-溴海兔素9.7 mg。
8-溴海兔素的理化性质和波镨数据如下C15H18OBr2; 'HNMR(300 MHz， CDC13) 5: 7.12 (s, H-ll), 2.49 (s, H3-12), 1.25 (m， H國3), 1.87， 1.65 (均为m， H2-5)， 1.78, 1.57 (均为m， Hr4), 1.31 (s， H3-13), 1.33 (s, Hr14)， 1.14 (d, /= 6.5 Hz， H3-15); EIMS附/z 374, 356 [M]+。
实验实施例
胰脂肪酶抑制活性的测定
胰脂肪酶抑制活性的测定以赛尼可作为阳性对照，方法如下 首先底物对硝基苯乙酸(p-Nitrophenyl acetate ) ( sigma公司)用磷 酸緩沖液(25mM, pH 6.8 )配成1.35 mM;猪胰脂肪酶(sigma公司)用磷酸緩冲液配成10mg/ml;受试样品用磷酸緩沖液配制成不同浓度 的溶液。然后在96孔板中依次加入50 |il酶溶液、50 jal底物溶液以及 10nl不同浓度的受试样品，混匀。37。C下反应10分钟，在492nm下 检测每孔的吸光度。
根据在492 nm下的吸光度计算化合物对胰脂肪酶的抑制率(％ ), 并将酶活性抑制率(％)达到50。/。时抑制剂的浓度测定为IC5。值。抑制 率(％)可以根据下式进行。
抑制率(°/。) = [ (A-B) - (C-D) ]/ (A画B) xi00 上式中，A表示反应后空白孔在492nm下的吸光度； B表示反应前空白孔在492 nm下的吸光度； C表示反应后样品孔在492 nm下的吸光度； D表示反应前样品孔在492 nm下的吸光度。 结果见表l。
表l 胰脂肪酶抑制作用 样品 IC5Q ( nM )
劳藻酚 4.75 ±0.212
8-溴劳藻酚 2.35 ±0.092
8-溴海兔素 2.27 ±0.122
赛尼可 0.72 ±0.031
从表l可以看出，劳藻酚、8-溴劳藻酚、8-溴海兔素对胰脂肪酶具 有强的抑制作用，与阳性药赛尼可相比，它们的作用强度属于同一数 量级。
总结胰脂肪酶是肠道中脂肪消化吸收所必需的酶，食物中的脂 肪在胰脂肪酶作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸后，又经肠道吸 收在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖以及相伴的高脂血症、糖尿病等代谢性疾病的发生。劳藻酚、8-溴劳藻酚、8-溴海 兔素等化合物经体外生物活性测试研究发现，具有显著的胰脂肪酶抑 制活性，该类化合物可望在制备预防或治疗肥胖症、糖尿病、高脂血 症和脂肪肝等代谢失调性疾病药物中应用。
权利要求
1、结构式如下的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物其中，R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或卤素。
2、 根据权利要求1所述的月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生物， 其特征在于，R,、 R2、 R3和R4各自独立地为氢或溴原子。
3、 根据权利要求1或2所述的月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生 物，其特征在于，所述化合物为劳藻酚、8-溴劳藻酚、4,8,15-三溴劳藻 酚、海兔素或8-溴海兔素。
4、 一种权利要求l-3任意一项所述的月桂烷型倍半辟类化合物或 其衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1) 提取将我国东海海洋植物冈村凹顶藻用丙酮溶剂提取，所得 提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏悬浮于水中，用乙醚萃取，所得 萃取液浓缩后得到乙醚浸膏；2) 分离对步骤1)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油 醚/丙酮梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比98:2洗脱部分，经200-300 目硅胶柱层析，以石油醚/乙醚梯度洗脱；其中，石油醚/乙醚体积比8:l 洗脱部分，经400-600目硅胶柱层析，以正己烷洗脱并纯化得到海兔素； 石油醚/丙酮体积比90:10洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析， 以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱并纯化得到劳藻酚。
5、 根据权利要求4所述的月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生物的 制备方法，其特征在于，所述步骤l)中，所述的丙酮溶剂提取采用超 声提取。
6.制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所迷的石油醚/丙酮梯度洗脱是以石油醚/丙酮体积比100:0 — 98:2 — 95:5 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50进行梯度洗脱；所述的石油醚/乙醚梯度洗脱是以石油醚/乙醚体 积比100:0 — 98:2 — 95:5 — 9:1 — 8:1—7:1进行梯度洗脱。
7、 权利要求1所述的月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生物在制备 胰脂肪酶抑制剂药物中的应用。
8、 权利要求1所述的月桂烷型倍半碎类化合物或其衍生物在制备 预防或治疗代谢失调性疾病药物中的应用。
9、 根据权利要求8所述的月桂烷型倍半薛类化合物或其衍生物的 应用，其特征在于，所述代谢失调性疾病包括肥胖症、糖尿病、高脂 血症和脂肪肝。
全文摘要
本发明涉及一类从我国东海海洋植物冈村凹顶藻中提取、分离获得的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物、及其制备方法和用途。本发明的月桂烷型倍半萜类化合物或其衍生物结构式如上所示，当R₁、R₂和R₃同时为氢时，即为劳藻酚；当R₄为氢时，即为海兔素。该类化合物及其衍生物经体外检测表明具有明显的胰脂肪酶抑制活性，可望在制备预防或治疗肥胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝等代谢失调性疾病药物中应用。本发明还可为研制新的预防或治疗代谢失调性疾病药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋生物资源具有重要意义。
文档编号C07C39/17GK101628855SQ200810040588
公开日2010年1月20日 申请日期2008年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者张小东, 毛水春, 王贺瑶, 郭跃伟 申请人:中国科学院上海药物研究所