专利名称：抑制肿瘤生长的融合肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制肿瘤生长的融合肽以及该融合肽在制备抗肿
瘤药物中的用途。具体而言，本发明涉及含有(PUMA) BH3的融合 肽，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要疾病。虽然随着手术、化 疗、放疗水平的提高，恶性肿瘤患者的生存率已经有了较大提高，但 仍然严重地威胁着患者的生命与健康。传统的肿瘤化疗手段针对肿瘤 的靶向性差、副作用大，寻找和发展具有高效肿瘤杀伤活性、肿瘤耙 向性的新治疗药物是征服恶性肿瘤这一顽症面临的迫切要求。肿瘤的 生物治疗是继手术、放疗、化疗方法之后的新兴治疗方法，具有广阔 的发展前景。
细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束细胞生命的过程， 它的失调与肿瘤的发生、治疗及预后息息相关。细胞凋亡机制的紊乱 导致恶性肿瘤细胞跨过细胞周期的检验点而无限制增长。PUMA (p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年发J见的可被内、外源性 p53快速诱导、具有强大促凋亡作用的Bd-2蛋白家族的一员。PUMA 基因定位于19q ，其cDNA长1.9kb，编码一个由193个氨基酸残基 组成的蛋白，该蛋白定位于线粒体膜上。PUMA以p53依赖和p53不 依赖两条通路诱导凋亡，而且PUMA促凋亡的作用是快速、强大的。 表达PUMA的结直肠癌细胞DLD1比表达P53的DLD1细胞早9小时 出现凋亡形态学的改变。在U20S、 H1299及SH-SY5Y细胞中，无论 细胞的p53基因型如何，转染PUMA后细胞生长均可被显著抑制、克 隆形成减少。用基因敲除和RNA干扰方法研究发现，PUMA表达缺失 产生的实验动物表型与p53缺失表型相似。我们目前的研究结果显示 在凋亡通路中位于p53下游的PUMA在诱导凋亡方面所起的作用不亚于p53，但是对于该基因的调控机制、作用机理等方面的问题亟待深入 研究。
PUMA和Bik、 Bad、 Bid、 Bim、 Hrk/DP5及线虫Eg-l等Bcl-2家 族中的促凋亡成员一样，只存在一个BH3(Bcl-2Homology)结构域，称 为BH3仅有蛋白。BH3仅有蛋白是一类结构上各不相同的Bcl-2蛋白 家庭的成员。遗传学实验显示这些蛋白是从线虫到小鼠细胞程序性死 亡的重要的起动因子。BH3仅有蛋白之间或者与其它Bcl-2家族成员之 间的共同点是它们都有一个由9个氨基酸残基组成的BH3结构域。结 构突变分析显示BH3结构域对于结合于Bcl-2样凋亡抑制蛋白并启动 凋亡所必须的。当BH3仅有蛋白通过其BH3结构域与Bcl-2及其相关 凋亡抑制蛋白上的沟槽相互作用时就会启动凋亡过程。PUMA的BH3 结构域(LRRMADDLN)，位于其氨基酸序列的141-149位，是其诱导 凋亡必不可少的，缺少此结构域的PUMA突变体失去诱导凋亡的功能。 除此结构域外，PUMA不存在其他已知的功能结构域。PUMA通过BH3 结构域与其他Bd-2家族蛋白相互作用，诱导细胞色素c释放，激活 caspase-3 、 caspase-9 ，引起凋亡。鉴于PUMA的诱导凋亡的强大作 用并且缺失BH3结构域的PUMA失去其诱导凋亡的作用，我们认为 PUMA-BH3可能具有较强的诱导凋亡的作用。BH3结构域的功能及其 结构特点使我们可以以BH3为基础设计模拟药物来阻断特定的凋亡抑 制靶点，促使肿瘤细胞凋亡。
许多肿瘤具有p53途径及其他PUMA上游调控分子的缺陷，进而 导致了在这些肿瘤细胞中BH3仅有蛋白Puma和Noxa等凋亡通路的功 能缺陷。这种情况下，直接指向Bd-2等促生存蛋白并抑制其功能的 BH3模拟药物可能能够有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡，达到治疗肿瘤 的目的。两种方法产生的BH3可能具有肿瘤治疗应用前景其一是利 用修饰的BH3小肽，Bid-BH3小肽经修饰后能诱导白血病细胞发生凋 亡；其二是模拟BH3的结构设计非肽类的有机化合物与Bcl-2等促生 存蛋白的沟槽结合，抑制其功能，达到促使肿瘤细胞发生凋亡的目的。
肽药物是一类前景光明的抗肿瘤药物的发展方向，具有低毒性、 低组织蓄积性、高生物活性、特异结合相应分子结构等优点。然而， 肽药物在体内的低生物利用度会限制其发挥应有的生物学功能，因此
4也削弱了其对疾病的治疗效果。提高肽类药物在体内的生物利用度， 是肽类抗肿瘤药物研究急需解决的问题。在不影响肽药物生物功能的 情况下尽量减少肽药物的长度是目前该类药物的发展方向(小肽药 物)。小肽药物不但能提高生物利用度，而且还减小了机体对药物产生 免疫反应的可能性。选择特异性小肽作用于肿瘤发生时所需的调控因 子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关 基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为 寻找抗癌药物的新热点。目前已经发现一些能够抑制肿瘤生长的小肽，
如抑制E2F/DNA结合的20-肽、抑制uPA/uPAR相互作用的13-肽、抑 制肿瘤转移的具有RGD序列的小肽等。但单独应用肽药物时其耙向性较差。
多种肿瘤细胞高表达一系列的细胞表面受体，而正常组织中的该 受体低表达。例如多种肿瘤类型中特异性高表达CXC (C-X-C motif) 趋化因子受体，乳腺癌中高表达HER2受体，卵巢癌中高表达促性腺 激素释放激素(GnRH)受体。这些受体可以作为药物特异性识别的耙 点。通过这些受体与其相应受体的特异性识别，可大大提高转导药物 的效率。其中CXC趋化因子受体(CXCR4)在正常组织中表达较低， 而至少在23种肿瘤细胞中高表达，如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、 卵巢癌、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、慢性 淋巴细胞性白血病、黑色素瘤、宫颈癌、结肠癌、肾癌或非霍奇金氏 淋巴瘤等，CXCR4的配体DV3含有11个氨基酸残基 (LGASWHRPDKG)，具有体积小、方便合成等优点，是药物耙向性的 较理想选择。但单纯的受体/配体介导的药物的摄取率非常低，并且 常将摄取的药物传递入细胞内吞作用途径，导致蛋白药物被降解。
蛋白转导是一种将生物活性蛋白转入细胞内部的新策略。最近发 现一些带正电荷的肽转导结构域(peptide transduction domains, PTD) 能以剂量依赖、受体非依赖的巨胞饮作用穿透细胞膜进入细胞浆，如 HIV-l反式激活因子(HIV-l TAT)、单纯疱疹病毒结构蛋白VP22和聚 精氨酸poly-Arg等。PTD已经能成功用于转导生物活性蛋白、肽和核 酸等。HIV-1TAT是其中最令人瞩目的一个PTD成员，其最短有效结 构域为YGRKKRRQRRR，它不但能够以接近100%的高效率在极短的时间内(被转导的蛋白可在io分钟内在细胞内出现)转导携带的蛋白
/肽、核酸、甚至纳米金属颗粒进入处于分裂期和非分裂期的各种哺乳 动物细胞，而且未发现任何毒性作用，TAT使转导的蛋白/肽通过巨胞 饮作用进入细胞。巨胞饮作用是非受体依赖的,以此种方式摄入的蛋白/ 肽比内吞作用更容易释放到胞浆中发挥作用。但这种巨胞饮作用是非
选择性的内吞作用，缺乏细胞的特异性，因此TAT通常用作体外细胞
的蛋白(核酸等)转导或体内非特异性的小分子药物转导。近两年已
经有研究者利用TAT转导肿瘤抑制蛋白/肽杀伤肿瘤细胞的细胞培养实 验和动物实验，如p53、 TRAIL等，局部注射的TAT-蛋白/肽对于实验 动物的移植瘤产生了良好的转导及治疗作用。
综上所述，在现有技术中虽然有关于抗肿瘤的小肽用于抗肿瘤治 疗的报道，但其均是单独应用或与蛋白转导序列融合使用或与针对肿 瘤细胞高表达的细胞受体的配体融合使用，尚未见到有将抗肿瘤的小 肽与蛋白转导序列和针对肿瘤细胞高表达的细胞受体的配体共同融合 以同时提高抗肿瘤小肽的生物利用度和耙向性的报道。
发明内容
因此，为了克服现有技术的不足之处，特别是现有抗肿瘤肽药物 研发中的不足，本发明的目的在于提供一种融合肽及其抑制肿瘤生长 的用途。
因此，本发明提供一种抑制肿瘤生长的融合肽，其特征在于包含
a) 蛋白转导序列；
b) 肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配体序列；和
c) 序号为SEQ. ID. NO. 3的小肽序列。
根据本发明的融合肽，蛋白转导序列选自HIV-1TAT、单纯疱疹病 毒结构蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽转导结构域。
根据本发明的融合肽，优选的是，蛋白转导序列是序号为SEQ.ID. NO. 1的HIV-1 TAT。
根据本发明的融合肽，肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配 体序列选自CXC趋化因子受体、HER2受体或促性腺激素释放受体的 配体。优选的肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配体序列是序号为
SEQ. ID. NO. 2的CXC趋化因子受体的配体DV3。
在本发明的一个实施方案中，所述融合肽是序号为SEQ. ID. NO. 5
序列的融合肽。
本发明的另一个目的在于提供所述的融合肽在制备抗肿瘤药物中 的用途。所述肿瘤选自结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经 胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白 血病、黑色素瘤、宫颈癌、结肠癌、肾癌或非霍奇金氏淋巴瘤。
换言之，在本发明技术方案中，本发明提供一种抑制肿瘤生长的 融合肽，其包含通过巨胞饮作用将抗肿瘤小肽高效率转导入目标肿瘤 细胞的蛋白转导序列、提高所述蛋白转导序列靶向性使特异地转导入 高表达某种肿瘤细胞高表达的细胞表面受体的肿瘤细胞的配体序列以 及序号为SEQ. ID. NO. 3的能抑制肿瘤生长的小肽序列(PUMA)BH3。 通过融合所述三段序列，蛋白转导序列的高效转导能力、对肿瘤细胞 的特异性和抗肿瘤小肽的抗肿瘤能力有机地联合起来，达到了单独应 用抗肿瘤小肽或抗肿瘤小肽与其它两种片段任一种单独融合所达不到 的效果。
优选地，蛋白转导序列选自HIV-1反式激活因子TAT、单纯疱疹 病毒结构蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽转导结构域的蛋白转导序 列，最优选地，蛋白转导序列是序号为SEQ.ID.NO. 1的HIV-1 TAT。
优选地，肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配体序列是选自 CXC趋化因子受体、HER2受体或促性腺激素释放受体序列的配体序 列，最优选地，所述配体序列是序号为SEQ. ID. NO. 2的CXC趋化因 子受体的配体DV3。最优选地，本发明融合肽是为SEQ. ID. NO. 5的 融合肽序列。本发明使用的序列见表l。
本发明的第二个目的是提供本发明融合肽在制备抗肿瘤药物中的 用途，优选地，所述肿瘤为实体瘤，包括例如结肠癌、肺癌、胃癌、 乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血 病、慢性淋巴细胞性白血病、黑色素瘤、宫颈癌、结肠癌、肾癌或非 霍奇金氏淋巴瘤。
图l:用60pMTAT-DV3-BH3与细胞共培养72hr后，每孔加10pL CCK-8，继续培养lhr， 450nm与630nm双波长下测定各孔吸光度，计 算各组细胞的抑制率。结果表明设计的融合肽能抑制多种肿瘤细胞的 生长，而对永生化的正常细胞的生长没有显著影响。
图2: 浓度为60|iM的(PUMA)BH3、 TAT-DV3禾卩TAT-DV3-BH3 分别与HCT116P53+/+、 HCT116P53;和HEK283细胞共培养72hr后，每 孔加10|aLCCK-8，继续培养2hr， 450nm与630nm双波长下测定各孔 吸光度，计算各组细胞的存活率；用单因素方差分析比较3条多肽对 各组细胞存活率，结果表明，(PUMA)BH3和TAT-BH3对各组细胞存 活率影响差异无显著性(P>0.05),只有TAT-DV3-BH3能明显抑制 HCT116P53+/4^Q HCT116P"一细胞生长，这两组细胞的存活率分别为 33.29%和31.53%，而对照组细胞HEK293的存活率为119.75%，差异 有极显著性(PO.Ol)。此图表明只有融合肽TAT-DV3-BH3对肿瘤细 胞的生长有作用，而单独BH3和TAT-DV3序列对肿瘤细胞的生长没有 显著影响。而且，融合肽TAT-DV3-BH3对永生化的人胚肾细胞HEK293 的生长没有显著影响，表明了对TAT-DV3-BH3对肿瘤细胞作用的特异 性。
图3: TAT-DV3-BH3在细胞中的分布。红色为线粒体染上了线粒 体特异染料Mito Tracker Red CMXRos ，绿色为带FITC标记的肽；作 用0.5hr， TAT-DV3-BH3主要分布在细胞膜上，当作用时间延长至lhr 和24hr时，TAT-DV3-BH3主要分布在胞浆和胞膜上，胞核末见分布， 标尺代表10(im。此图表明融合肽TAT-DV3-BH3可在较短时间内进入 细胞，并且分布于线粒体分布区。(转换为黑白图片时可能会表现为不 同亮度的灰度)
图4:不同多肽与HCT116P53+z+、HCT116P53-八和HEK293共培养72hr 后，收获细胞，用70%乙醇固定细胞后经流式细胞仪分析细胞凋亡率。 上图为流式细胞仪分析细胞凋亡率直方图，A-F为HCT116P^+各组， G—L为HCT116P53—A各组，M—R为HEK293各组；下图为各组细胞凋 亡率条图，60pM TAT-DV3-BH3处理结肠癌细胞凋亡率与其他所有组比较差异有极显著性(PO.Ol)，其他各组间比较，差异无显著性。此图
表明TAT-DV3-BH3诱导细胞发生了凋亡。
图5:荧光显微镜下观察经TAT-DV3-BH3处理的细胞凋亡形态的 变化。染色剂为DAPI。此图显示肿瘤细胞经TAT-DV3-BH3处理后发 生凋亡后的形态学变化。
图6: Western Blot分析不同浓度TAT-DV3-BH3处理结肠癌细胞 72h，分析Caspase9、 Caspase8酶原及其活性形式、Caspase3酶原水平， 证实了该融合肽激活了细胞凋亡通路。
图7:裸鼠体重随实验时间变化。第0天为第1次注射前测量的体 积，注射时间为第1天至第7天，每次注射药物前测量裸鼠体重，每 次测量各组体重差异没有统计学意义，(P>0.05)，表明该融合肽的处理 未对实验动物产生明显的副作用。
图8:肿瘤体积随时间变化图。第0天为第1次注射前测量的体积， 注射时间为第1天至第7天，测量体积时间为每次注射前，从第12天 开始，TAT-DV3-BH3组的瘤体积与其它3组体积差异有统计学意义， P<0.05。此图表明TAT-DV3-BH3处理后的肿瘤生长受到明显抑制。
图9:各组裸鼠处死后瘤重比较。TAT-DV3-BH3组的瘤重与其它 3组瘤差异有统计学意义，P<0.05。
图10:各组裸鼠处死后荷瘤及瘤块排列。上图为各组荷瘤裸鼠， 下图为各组瘤块排列。
图ll:尾静脉注射多肽后3hr，各组裸鼠经三溴乙醇麻醉后置于活 体生物发光与荧光分析系统中排列。
图12:尾静脉注射后3hr，处死裸鼠取出肿瘤块及各主要脏器自然 光下排列。
图13:尾静脉注射各多肽及PBS后3hr，处死裸鼠取出肿瘤块及 各主要脏器置于活体生物发光与荧光分析系统中排列。此图表明该融 合肽经尾静脉注入裸鼠体内后能靶向性地分布于体内的肿瘤。
具体实施例方式
通过参考下述的一些具体实施例可进一步理解本发明，这些实施 例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，
9可以对本发明做出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这 些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1多肽(PUMA)BH3、 TAT-DV3和TAT-DV3-BH3的合成 实验结果显示(PUMA)BH3结构域的耙向融合肽可以抑制一些肿 瘤细胞的生长，表现出一定的抗肿瘤活性。因此，从上海吉尔生物科 技有限公司合成了含(PUMA)BH3结构域的靶向融合肽及2段对照多 肽。所有合成多肽均通过反相高效液相色谱纯化，纯度均>95%，氨基 酸序列通过MALDI-TOF质谱分析验证，并在各肽的N端添加FITC。 各肽名称为(PUMA)BH3、 TAT-DV3禾B TAT-DV3-BH3，序列如表1所 示。
表l:
序列名称
SEQ. ID. NO. 1 HIV誦1 TAT
SEQ. ID. NO. 2 DV3
SEQ. ID. NO. 3 (PUMA)BH3
SEQ. ID. NO. 4 TAT-DV3
SEQ. ID. NO. 5 TAT-BH3-DV3
实施例2融合肽TAT-DV3-BH3对细胞生长抑制实验 从已知的CXCR4过表达的肿瘤细胞中选择5株细胞人结肠癌细胞 HCT116P53+/，nHCT116P53^、人肺腺癌细胞系GLC-82、人乳腺癌细胞系 MDA-MA-231、人胃癌细胞系SGC-7901 ， 2株非肿瘤细胞人胚肺成纤 维细胞2BS和人胚肾成纤维细胞HEK293。其中2种结肠癌细胞一个是 P53野生型HCT116P53+ 另一个是P53缺失型HCT116P53—、如果我们合 成的多肽如同我们的设想，按PUMA (BH3)通路诱导细胞发生凋亡的 话，那么多肽对这2株细胞的作用应该是没有明显差异的，也就是说凋 亡的发生与P53的存在与否无关。用多肽TAT-DV3-BH3对以上7种人肿 瘤细胞进行细胞生长抑制实验。具体操作参照Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan, Cat No: CK04-13)试剂盒说明书。简单地说，细胞按5000/wdl接种于96孔板，培养24hr后吸去原培养液，分别加上终浓度为
60(aM的TAT-DV3-BH3;然后继续培养72hr，吸去含有多肽培养液，每
孔再加100jiL (含CCK-8 lO)iL)培养液，继续培养lhr，用Bio-Rad 680
酶标仪，测定波长450nm、参比波长630nm，测定每孔的吸光度，存活
率(％)=100 X (A微纟『A别)/(A劇组-A加)，抑制率(％)=100-存活率(％)。结
果显示，用60(iMTAT-DV3-BH3与各细胞共培养72hr后，HCT 116 P53V-
和HCT 116 P53+z+的抑制率分别为67.81。/。和65.72。/。， GLC-82为36.36。/。、
SGC-7901为35.25。/。、 MDA-MA-231为30.21。/。；而HEK293和2BS的抑制
率均为0%;结果见表2和图1。
表2 60jiM TAT-DV3-BH3处理各组细胞存活率及抑制率 细 胞 抑制率(％;)~
HCT1161^- 67.81
HCT116P53+/+ 65.72
GLC-82 36.36
SGC-7901 35.25
MDA-MA-231 30.21 HEK293 0 2BS 0
从以上结果可知，多肽TAT-DV3-BH3对5株肿瘤细胞有明显抑制 作用，抑制率介于30% 70%之间，对非肿瘤细胞HEK293和2BS没 有表现出抑制作用，抑制率为0%，这说明我们合成的多肽对这些 CXCR4过表达肿瘤细胞有明显抑制作用，对CXCR4低表达的非肿瘤 细胞HEK293及2BS没有抑制作用，表明多肽TAT-DV3-BH3有抑制 肿瘤细胞生长活性，且表现出一定特异性。此外，因为多肽对 HCT116P53一和HCT116P53+z+抑制率相近，说明TAT-DV3-BH3对细胞的 作用与P53存在与否无关。
实施例3 (PUMA)BH3、 TAT-DV3和TAT-DV3-BH3对细胞生长的
影响
按5000个细胞/孔将HCT116P53+/+、 HCT116P53一和HEK283细胞接种于96孔板，培养24hr后吸去原培养液，分别加上终浓度为60pM的 (PUMA)BH3、 TAT-DV3禾P TAT-DV3-BH3;然后继续培养72hr，吸去 含有多肽培养液，每孔再加100pL (含CCK-8 10|iL)培养液，继续培 养lhr，用Bio-Rad 680酶标仪，测定波长450腿、参比波长630nm， 测定每孔的吸光度，存活率(。/。)^100X(A实验组-A空白)/(A对照组-A 空白)，结果如表3，图2。
表3浓度为60pM的各段肽对细胞存活率的影响
Cell(PUMA)BH3TAT-DV3TAT-DV3-BH3
HCT116P53+/+101.67±2.8889.01 ±0.3433.29±4.13
HCT116P53-/-m.94土3.86101.49±2.373〗.53 ±0.08
HEK29397.43 ±2.9498.06±3.69119.75±8.28
上述结果表明，无论是(PUMA)BH3单独作用，还是用TAT-BH3 处理细胞都不能有效地抑制细胞的生长，而当这两段肽合而为一成为 融合肽TAT-DV3-(PUMA)BH3时就能明显抑帝lj HCT116P53+/+和 HCT116^^细胞生长，对非肿瘤细胞HEK293却没有抑制作用；说明 (PUMA)BH3与TAT-DV3的组合具有明显的抑制肿瘤作用，而且具有 肿瘤特异性。
实施例4TAT-DV3-BH3进入细胞与在细胞内分布
根据前面的实验结果，TAT-DV3-BH3对HCT116P53^和 HCT116P"+z+细胞有明显抑制作用，因此阐明其在细胞内的分布对分析 其对肿瘤细胞可能的作用机理有一定帮助。
因为合成的多肽带有FITC标记，用40ixM TAT-DV3-BH3与 HCT116P53一和HCT116P5W+及HEK293细胞共培养0.5hr、 lhr和24hr 后，分别再染线粒体特异性荧光染料Mito Tracker Red CMXRos (Invitrogen, USA， Cat.M7512)，然后于激光共聚集显微镜下观察带绿色 荧光的多肽在细胞中分布，从图3可见，共培养0.5hr，多肽主要分布 在胞膜上，胞浆少见分布，胞核没有分布；共培养延长至lhr时，除胞 膜有分布外，胞浆内也有大量的分布，胞核未见有分布；当共培养时 间延长至24hr，多肽只分布在胞膜和胞浆，胞核仍未见有分布。
上述结果显示TAT-DV3-BH3能很快从培养基中进入细胞内，lhr
12已有大量多肽进入细胞浆，表明该多肽能快速渗入细胞，主要分布中 细胞浆中线粒体分布区，细胞核未见分布。
实施例5 TAT-DV3-BH3诱导HCT116P5"和HCT116P53悟细胞凋亡 (A)流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡
为评价TAT-DV3-BH3对HCT116P53一和HCT116P53悟细胞生长的抑 制是否是由于细胞凋亡引起的，是否是由(PUMA)BH3所引发的效应， 我们用TAT-DV3和(PUMA)BH3作为对照肽。细胞及剂量分组见表4。
表4流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡率(％)比较
CellCon(O |_iM)TAT-DV3-BH3 (uM) 15 30TAT-DV3(阔 ( 60 60:PUMA)BH3(阔 60
HCTn6，汁 HCT116P53-'-HEK2937.12±1.21 6.19±1.28 7.99±1.343.58±1.32 7.01±1.87 3.12±1.32 17J±3.56 8.18±1.52 6.66士1.4330.80±2.08 30.30±2.69 9.61±1.873.52±0.75 5.80±1.26 6.60±2.002.86±0.45 5.40±1.01 10.60士2.60
结果表明无论是(PUMA)BH3，还是TAT-DV3对各细胞的凋亡作 用都不如TAT-DV3-BH3明显，而且TAT-DV3-BH3对HCT116 P53+/1tl HCT116 Ps^的凋亡作用呈现出剂量信赖性。
流式细胞术分析了 TAT-DV3-BH3对3种细胞引起凋亡数量的变 化，另外，我们用DAPI染色方法在荧光显微镜下观察了发生凋亡的细 胞形态的变化；用60pM TAT-DV3-BH3与HCT116P53—A和HCT116P53+/+ 细胞共培养48hr、 72hr后，分别用lpg/mLDAPI染色，然后荧光显微 镜下观察细胞凋亡形态的变化，参见图4、图5。从图5中可以明显发 现，对照组细胞核膜完整，染色质均匀；48hr细胞核膜已有部分鮍縮， 染色质出现固縮，同时出现边缘化，表明48hr细胞已出现凋亡形态学 特点；72hr细胞核膜完全碎裂，染色质高度固縮并出现片段化，说明 72小时后细胞出现明显凋亡形态特点；因此从形态学上可以认为多肽 TAT-DV3-BH3是可以诱导结肠癌发生凋亡的。
实施例6细胞凋亡通路验证
通过前面实验说明，TAT-DV3-BH3确实对结肠癌细胞有抑制作用， 而且还能诱导细胞发生凋亡，为验证其是否是通过线粒体凋亡通路进 行，我们采用Western Blotting对凋亡通路上关键蛋白Caspase9、Caspase8和Caspase3进行分析，结果见图6。结果表明对2株结肠癌细胞，随 着多肽TAT-DV3-BH3浓度增大，Caspase3酶原水平是逐渐下降的，说 明Caspase3活性形式是逐渐升高的，这与流式细胞术分析细胞凋亡率 结果是一致的；Caspase9酶原水平随着多肽浓度升高而降低，活性形 式却随着多肽浓度升高而升高，表现出明显的剂量依赖性；Caspase8 酶原在各组细胞中无明显变化趋势，而其活性形式水平在各组中表达 很低，表明Caspase8在多肽作用下，被活化量很低，这些表明多肽 TAT-DV3-BH3诱导结肠癌细胞发生凋亡是通过Caspase9通路，而不是 通过Caspase8途径进行的，即认为TAT-DV3-BH3是通过线粒体通路 诱导细胞发生凋亡的，与PUMA的作用通路一致。
实施例7融合肽TAT-DV3-BH3对荷瘤裸鼠体内抑瘤实验
(A) 体内成瘤实验
取5只雌性Nu/Nu (Charles River Laboratories:NU-Foxnlnu)裸鼠， 合格证号SCXK(京)2007-0001)， 4 6周龄，体重为13 15g，每只 裸鼠右侧腋窝皮下注射体积为200jiL人结肠癌HCT116P53—A细胞悬液 (含1x107个细胞)，注射后每天观察一次裸鼠成瘤情况；到第5天有 2只明显成瘤，第7天有3只成瘤，到第9天有4只成瘤，之后仍只有 4只成瘤；当至20天时，处死裸鼠，取出它们的瘤块，选择相对较好 的瘤块，将瘤块修剪成1.5mm-2.0mm见方小块分别移植到6只雌性 Nu/Nu裸鼠的右侧腋窝皮下；当接种后29天，处死裸鼠，同样将瘤块 修剪成1.5-2.0mm见方小块分别移植到36只雌性Nu/Nu裸鼠的右侧腋 窝皮下，待瘤块长到3-5mm后可进行肽药物治疗。
(B) 体内抑瘤实验
当瘤块移植入裸鼠体内后ll天，根据瘤块大小和形状选出28只荷 瘤裸鼠，按配伍设计分成4组PBS组、(PUMA)BH3组、TAT-DV3组和 TAT-DV3-BH3组。各肽均用PBS稀释成1.2mM，每只裸鼠每天瘤内注射 O.lmL肽或PBS，连续注射7天，注射前均测量裸鼠体重及瘤块体积(体 积=长乂宽2/2)，单位为mm、注射期间及注射完后均是隔一天测量一 次裸鼠体重及瘤块体积，当有裸鼠肿瘤长至20mm长或者有肿瘤出出溃 烂时就停止测量，然后处死裸鼠，取出肿瘤块，称量瘤重量。结果见图7、图8、图9和图10。
体内抑瘤实验结果显示，整个实验过程中，各组裸鼠体重间没有
差异，P>0.05，可认为三组多肽组对裸鼠生长没有明显影响，未对治疗 裸鼠产生明显的毒副作用，也说明这三个多肽在该情况下应用没有明 显毒副作用；TAT-DV3-BH3能明显延缓荷瘤裸鼠的肿瘤生长，与对照 组和(PUMA)BH3及TAT-DV3组比较，裸鼠平均瘤体积从第12天(即 注射后第3次测量时)差异均有显著性，PO.05;而(PUMA)BH3及 TAT-DV3组与对照组比较差异没有显著性，P>0.05;第20天处死裸鼠 测瘤重也得到与瘤体积同样的结果；这表明无论(PUMA)BH3单独用， 还是TAT-DV3单独用，都不能抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长，而当TAT-DV3 与(PUMA)BH3连成一条多肽时，就能发挥抑瘤效应，这与前面的体外 实验结果相一致。
实施例8融合肽TAT-DV3-BH3在荷瘤裸鼠体内分布实验 取4只荷瘤裸鼠，从尾静脉分别注射浓度为1.2mM的 TAT-DV3-BH3、 TAT-DV3、 (PUMA)BH3和PBS各O.lmL， 3hr后观察 活体裸鼠体内各多肽带有的FITC绿色荧光。结果见图ll、图12和图 13。
由于活体成像系统的敏感性和体内药物的浓度较低，在直接活体 的情况下未能清楚地显示裸鼠体内的绿色荧光；接着处死各裸鼠，取 出瘤块和主要脏器，再置于活体成像系统中观察，能清楚地显示FITC 标记的多肽在裸鼠体内各主要脏器的分布。尾静脉注射3hr后，在活体 荧光分析系统中均不能见到明显的绿色荧光，只是稍稍见到裸鼠表皮 皱褶处零星的本底绿色荧光；当将裸鼠处死后取出肿瘤块和各主要脏 器置于成像系统中则可到明显的绿色荧光，对照组注射PBS各脏器和 肿瘤块均未见绿色荧光；TAT-DV3-BH3组、TAT-DV3组和BH3组只 在肿瘤块和代谢器官肝脏、肾脏中可见到绿色荧光，其余脏器未见到 绿色荧光。结果表明该多肽能特异性地分布于体内肿瘤中，并且可能 经肝脏和肾脏代谢排出。序列表
a io>中国医学科学院肿瘤研究所
〈120>抑制肿瘤生长的融合肽及其在制备抗肿瘤药物中的川途
<130> 880104CG
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
〈211〉 11
<212> PRT
<213> 人
<400〉 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5 10
〈210〉 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Gly Gly Gly Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly 1 5 10
〈210〉 3
<211> 12
〈212〉 PRT
<213> 人
<400> 3
Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr 1 5 10
<210> 4
<211〉 25
〈212〉 PRT <213〉人T.序列<220〉
〈221>融合肽 <222> (1). (25)
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Tyr Gly Arg' Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Gly Gly Leu Gly 1 5 10 15
Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly 20 25
<210〉 5
<211> 40
<212〉 PRT
<213〉 人工序列
<220〉
<221>融合肽 <222> (1)..(40)
〈400〉 5
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Gly Gly Leu Gly 15 10 15
Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly Gly Gly Gly Leu Arg Arg Met 20 25 30
Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr 35 40
权利要求
1、一种抑制肿瘤生长的融合肽，其特征在于包含a)蛋白转导序列；b)肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配体序列；和c)序号为SEQ.ID.NO.3的小肽序列。
2、 如权利要求1所述的融合肽，其特征在于a)选自HIV-1 TAT、单 纯疱疹病毒结构蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽转导结构域。
3、 如权利要求2所述的融合肽，其特征在于a)是序号为SEQ. ID. NO. 1的HIV-1 TAT。
4、 如权利要求1所述的融合肽，其特征在于b)选自CXC趋化因子受 体、HER2受体或促性腺激素释放受体序列的配体序列。
5、 如权利要求4所述的融合肽，其特征在于b)是序号为SEQ. ID. NO. 2的CXC趋化因子受体序列的配体序列DV3。
6、 如权利要求l所述的融合肽，其特征在于所述融合肽序列是序号为 SEQ. ID. NO. 5的序列。
7、 如权利要求1所述的融合肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
8、 如权利要求7所述的用途，其特征在于所述肿瘤选自结肠癌、胃癌、 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓 性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、黑色素瘤、宫颈癌、结肠癌、肾 癌或非霍奇金氏淋巴瘤。
全文摘要
本发明公开一种抑制肿瘤生长的融合肽，以及该融合肽在制备抗肿瘤药物中的用途。所述融合肽包含蛋白转导序列、肿瘤细胞高表达的细胞表面受体序列的配体序列和序号为SEQ.ID.NO.3的小肽序列。通过融合，在保持蛋白转导序列对蛋白的高效转导能力的同时增强了转导的靶向性，从而使抗肿瘤小肽高效特异地进入靶细胞，提高了抗肿瘤肽药物的生物利用度、靶向性，减小了机体对药物产生免疫反应的可能性。
文档编号C07K19/00GK101580548SQ20081009754
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月12日 优先权日2008年5月12日
发明者刘勇军, 晨 林, 钱海利 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所