专利名称：：一种亮氨酸二肽类似物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及二肽化学类似物的合成及应用，尤其涉及一种亮氨酸二肽类似物及其应用。
背景技术：
：小分子肽类具有容易获得、毒性低、副作用小、易于在体内代谢而又具有较好的生物活性等优点，此外，氨基酸及肽类作为生命体不可缺少的组成成分，调控着生命体的许多复杂代谢途径，因此对小分子活性肽及其类似物进行开发和研究具有重要的意义。公开号为CN1789277A的专利，公开一种二肽类似物DIPP-L-VAL-L-Phe-R(二异丙氧基磷酰基-L-缬氨酰-L-苯丙氨酰-3，4，5-三甲氧基苯胺基)，该二肽类似物对人慢性髓性白血病细胞K562和肝癌细胞HepG2的IC50(24h)为15umol/L和10Pmol/L，及DIPP-L-Phe-L-Phe-R(二乙丙氧基磷酰基-L-苯丙氨酰-L-苯丙氨酰-3，4，5-三甲氧基苯胺基)对人慢性髓性白血病细胞K562和肝癌细胞HepG2的IC50(24h)为150umol/L禾Q17Pmol/L。公开号为CN1467220A的专利公开了一系列三肽类似物，含制备方法及药物组合物和用途，该三肽可以由芳香性氨基酸、亲脂性氨基酸和直链或支链取代的Y-氨基丁酸组成，并发现这一些列的三肽都有一定的抗肿瘤活性。另外国家高技术研究发展计划(863计划)项目《酪丝亮肽的抗肿瘤作用及机理研究》对酪丝亮肽及其一系列相关小分子肽做了深入研究，发现其良好的抗肿瘤活性，尤其对肝癌，其水溶性好，用量少而又含亲酯性的氨基酸，易于被生物体利用，毒副作用小，已经进入临床研究，可作为抗肿瘤药。国家的立项对小分子肽的研究，更凸显了获得活性小分子肽的重要性。肿瘤是世界一大困扰着人类的恶性疾病。目前化疗药物的毒副作用大，专一性不强，对肿瘤细胞杀伤的同时也损害人体正常细胞，而且肿瘤细胞的易扩散性，更加重了治疗的难度。目前研究较多的关于肿瘤的治疗，应当主要通过使肿瘤细胞凋亡进行，这样才能进行更有效的治疗。因而获得能使肿瘤细胞发生凋亡、专一性较强而毒性较小的活性化合物，将更有可能成为肿瘤化疗药，用于肿瘤的治疗。钙离子作为细胞内的第二信使，发挥着及其重要的作用，调控着生命体的许多活动与物质的运转，同时也参与细胞凋亡的过程。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤活性的，且可显著上调细胞内钙离子水平的亮氨酸二肽类似物。本发明的上述目的是提供上述亮氨酸二肽类似物的制备方法。本发明的上述目的是提供上述亮氨酸二肽类似物的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的一种亮氨酸二肽类似物，具有式(I)所示通式Boc-A-Al-OBn(I)其中，Boc为叔丁基氧羰基，Bn为苄基，A为D/L构型的N上含或不含甲基的亮氨酸残基，Al为D/L构型的N上含甲基的亮氨酸残基。上述通式(I)中，发明人经过研究发现，在A1上如果不含有甲基，则该通式的亮氨酸二肽类似物就不具有抗肿瘤活性，因此本发明的亮氨酸二肽类似物中的A1，其不论是D构型还是L构型，N上都必定含有甲基。主体异构体是对某个分子的异构体的通称，它们的区别只在于它们原子的空间的方向不同，主要为几何异构体(顺/反异构)。本发明的亮氨酸二肽类似物为叔丁基氧羰基-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-节酯(Boc-D-Leu-N-Me-D-Leu-OBn，简写为DMD)、叔丁基氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-节酯(Boc-L-Leu-N-Me-D-Leu-OBn，简写为LMD)、叔丁基氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-苄酯(Boc-N-Me-D-Leu-N-Me-D-Leu-OBn，简写为MDMD)、叔丁基氧羰基-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰_节酯(Boc-N-Me-L-Leu-N-Me-D-Leu-OBn，简写为MLMD)、叔丁基氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯(Boc-L-Leu-N-Me-L-Leu-OBn，简写为LML)、叔丁基氧羰基-D-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯(Boc-D-Leu-N-Me-L-Leu-OBn，简写为DML)、叔丁基氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-节酯(Boc-N-Me-D-Leu-N-Me-L-Leu-OBn，简写为MDML)或叔丁基氧羰基-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯(Boc-N-Me-L-Leu-N-Me-L-Leu-OBn，简写为MLML)。上述亮氨酸二肽类似物的制备方法，是采用本领域常规的化学合成方法，以叔丁基氧羰基-亮氨酸(或叔丁基氧羰基-N-甲基-亮氨酸)和N-甲基-亮氨酸节酯磺酸盐为原料，通过偶合反应制备得到所需两端加有保护基(叔丁基氧羰基和苄基)的亮氨酸二肽。'上述制备方法中，作为原料的叔丁基氧羰基-亮氨酸可以为D构型也可以为L构型。上述制备方法中，作为原料的N-甲基-亮氨酸苄酯磺酸盐可以为D构型也可以为L构型。上述制备方法中，偶合反应采用本领域的常规操作，反应中所用到的催化剂也为本领域技术人员所常用的，如3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)、二异丙基乙胺(DIEA)、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDOHC1)或l-羟基苯并三氮唑(HOBt)，均可实现本发明。本发明人采用MTT法对本发明的亮氨酸二肽类似物进行抗肿瘤活性试验，结果表明本发明的亮氨酸二肽类似物对HepG2人肝癌细胞、Bel-7402人肝癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞具有较强的增殖抑制作用，活性无特殊的立体异构表现，可用于制备抗肿瘤药物，也可作为抗肿瘤先导化合物。采用流式细胞技术验证其抑制肿瘤细胞HepG2人肝癌细胞的生长是通过诱发细胞凋亡进行的并使细胞周期阻滞于S期，并发现其可能的凋亡分子机制是细胞内钙上调引起的，因此本发明的亮氨酸二肽类似物也可用作钙离子通道激动剂。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明首次人工合成了一系列新的具有活性的亮氨酸二肽类似物，对肿瘤具有较强的增殖抑制作用，可作为抗肿瘤先导化合物，用于制备抗肿瘤药物或者用作钙离子通道激动剂；本发明亮氨酸二肽类似物的合成方法简单，合成所得产物易于保存，产率高，易于工业化生产，且可根据实际需要制成所需剂型。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1Boc-D-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(DMD)的合成将4mmol的H-N-Me-D-Leu-OBzl'TosOH溶于50mL的无水CH2C12中，接着加入40mL的水，然后加入Boc-D-Leu-OH0.924g(4mmol)和HoBt0.54g(4mmol)，然后0°C~5。C下搅拌；半小时后加入EDC0.84g(4.4mmol)，在0°C~5r反应24小时后加入0.5M的盐酸20mL，溶液分层后取出有机相，反复用EtOAc提取水层，合并EtOAc;EtOAc相再依次用饱和NaHC03洗3次，饱和柠檬酸洗2次，饱和NaCl洗至中性，无水Na2S04干燥，过滤，旋干得无色油状物；硅胶柱层析，Ve院V丙銅=3:1的洗脱剂洗脱，吹干，得无色晶体1.54g，该无色晶体即为Boc-D-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(DMD)。本实施例的收率为85.9%，m.p.48.750.0°C，晶体结构经X射线单晶衍射仪测定，纯度用HPLC测定(>99%)。D2o-0.70(c=0.2CH3OH)，m.p.4949.9°C.&NMR(DMSO):7.35(m,5H)，6.94(d，J=8.5Hz,1H)，5.10(s,2H)，5.22(dd，J=4.5,11Hz,IH)，4.43(m,IH)，2.97(s,3H)，L82(m,1H)，1.59(m，2H)，1.45(m,2H)，1.35(m,9H)，1.23(m，1H)，0.86(m,12H);13CNMR(CDC13,125Hz):173.96(1C)，171.31(1C)，155.57(IC)，135.65(1C)，128.71(1C)，128.59(1C)，128.26(1C)，128.08(2C)，79.42(1C)，66.81(1C)，55.29(IC)，49.14(1C)，42.85(1C)，37.40(1C)，31.66(1C)，28.35(3C)，25.05(1C)，24.65(1C)，23.39(1C)，23.26(1C)，21.90(1C)，21.30(1C).MS(ESI)w/r449.3[M+H]+，466.5[M+NH4]+，471.6[M+Na]+.实施例2Boc-L-Leu-N-Me-L-Leu-OBn(LML)的合成取Boc-L-Leu-OHl.lg(4.8mmol)溶于8ml四氢呋喃(THF)的50ml圆底烧瓶中，置于冰水浴中搅拌，氮气保护下，连续加入DEPBT8g(6.0mmol)，D正A(6.0mmo1，1.05ml)，反应5分钟后，加入1.6g(4腿o1)的H-N-Me-L-Leu-OBzlTosOH，自然升温至常温，TLC跟踪反应；8小时后反应完成，减压蒸除溶剂；直接进行硅胶柱层析(淋洗剂Ve改VOT=20:1)，得无色晶体1.60g，该无色晶体即为Boc-L-Leu-N-Me-L-Leu-OBn(LML)。本实施例产物的收率为89%，纯度用HPLC测定(>95%)。m.p.66-68。C。[a]D20-8.2(c=0.2CH3OH)，&NMR(500MHz，DMSO)S(ppm):7.35(m,5H)，6.97(d,J=8.0Hz1H)，5.23(dd,J=l1.3,3.0Hz1H)，5.09(m,2H)，4.33(m,1H)，2.89(s,3H)，1.76(m,1H)，1.58(m,2H)，1.45(m,1H)，1.34(s,9H)，1.20(m，2H)，0.93(m,12H);13CNMR(CDC13,125Hz)S(ppm):173.9，171.5，155.7，135.4，128.5(2C)，128.3，128.0(2C)，79.4，66.9，54.4，48.9，41.9，36.8，30.7，28.2(3C)，24.7，24.5，23.3，23.2，21.7，21.3;MS(ESI)附/z:449.3[M+H]+，466.5[M+NH4]+，471.6[M+Na]+.实施例3Boc-N-Me-Leu-N-Me-Leu-OBn(MLML)的合成取Boc-L-Me-Leu-OH(3.3mmol，0.81g)溶于5mlTHF中，置于冰水浴中搅拌，氮气保护下，连续加入DEPBT(4.5mmol，1.35g)，D正A(4.5mmol，0.8ml)，反应5分钟后，力n入(3mmol，1.2g)的H-N-Me-L-Leu-OBnTosOH,自然升至室温，TLC跟踪反应；18小时后反应完成，减压蒸除溶剂；直接进行硅胶柱层析(淋洗剂VzE战Vra=20:1)，得淡黄色油状物1.12g，该淡黄色油状物即为Boc-N-Me-Leu-N-Me-Leu-OBn(MLML)o本实施例产物的收率为81%，纯度用HPLC测定(>90°/。)。[a]D24-109.6(c=0.7,CH3OH)，!HNMR(CDC13):7.33(m,5H),5.31(m,IH)，5.09(m,2H),4.85(m,1H),2.83(s,3H),2.70(s,3H),1.70(m，4H),l'43(s,9H)，L37(m,2H),0.91(m,12H);MS(ESI)w/z:463.3[M+H]+,480.5[M+NH4]+,485.6[M+Na]+.实施例4Boc-Leu-Leu-OBn(LL)的合成取Boc-L-Leu-OH(6.6mmol，1.5g)溶于10mlTHF中，置于冰水浴中搅拌，氮气保护下，连续加入DEPBT(9.0mmol，2.69g)，DIEA(9.0mmol，1.8ml)，反应5分钟后，加入(6mmol，2.4g)的H-N-L-Leu醒OBn.TosOH，自然升至室温，TLC跟踪反应；6小时后反应完成，减压蒸除溶剂；直接进行硅胶柱层析(淋洗剂ViE己院V翻-20:1)，得无色晶体2.47g，该无色晶体即为Boc-Leu-Leu-OBn(LL)。本实施例产物的收率为92%，纯度用HPLC测定(>95%)，m.p.86~87°C。D24-31(c=0.25,CH3OH);'HNMR(500MHz,CDC13):7.35(m，5H)，6.40(d，J-7.9Hz，IH)，5.16(m，2H)，4.86(d，《/=7.5Hz，1H)，4.67(m，1H)，4.09(s，1H)，1.68(m，4H)，1.56(m，2H)，1.44(s,9H)，0.91(m,12H);MS(ESI)m/z:435.3[M+H]+,452.5]+,457.6[M+Na]+.采用上述实施例1~3的方法，可制备得到以下化合物Boc-L-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(LMD)，收率87%,纯度>95%;Boc-D-Leu-N-Me-L-Leu-OBn(DML)，收率87%，纯度>950/0;采用实施例4的方法，可制备得到以下化合物Boc-N-Me-L-Leu-L-Leu-OBn(MLL)，收率90%，纯度>95%。上述制备所得化合物DMD、MLML、LML、LMD和DML，其Al均为N上含甲基的亮氨酸残基；上述制备所得化合物LL和MLL，其A1均为N上不含甲基的亮氨酸残基。实施例5抗肿瘤活性分析1.样品储备液制备将上述制备所得亮氨酸多肽类似物DMD、MLML、LML、LMD、DML、LL和MLL分别溶于二甲基亚砜，再以<0.1%的DMSO/RPMI1640培养基(体积分数)溶于培养基中，过滤除菌得到各化合物的样品储备液保存于4"C冰箱中。2.本实施例用来检测亮氨酸多肽类似物抗肿瘤活性的人乳腺癌细胞株(MCF-7)和人肝癌细胞株(Bel-7402)购自广州中山医科大学；人肝癌细胞株(HepG2)由广州暨南大学医学院病理教研室提供。3.本发明采用本领域的常规操作MTT法检测前述七种亮氨酸多肽类似物的样品储备液的细胞毒活性。取对数生长期细胞，消化，1000rpm离心5min，计数以4xl(^个/ml密度接种于96孔培养板中，100^1/孔，培养24后，取前述各样品储备液分别稀释成适当浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100"g/mL)，每孔加样品溶液100(xl，每个浓度平行四个孔，同时设溶剂二甲基亚砜DMSO为阴性对照组，用5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照。共同培养72h后，每孔加20^11MTT(5mg/ml溶解于PBS中)，再培养4h，弃上清，每孔加入200^1DMSO，振荡5分钟，用酶标仪测吸光值(A570nm处吸光值)，测量波长为570nm，参考波长630nm。所获数据利用SPSS13.0统计软件处理，计算细胞抑制率，并得到IC50值(见表l)。表1各合成二肽类似物的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中"-"表示无抗肿瘤活性或者IC5O50^ig/ml;从表1可以看出，亮氨酸多肽类似物DMD、MLML、LML、LMD和DML其lC50都〈50吗/ml，且具有较好的抗肿瘤活性，而亮氨酸多肽类似物LL和MLL的IC50都〉50昭/ml，无抗肿瘤活性，由此说明，本发明的亮氨酸多肽类似物的Al必须为N上含有甲基的亮氨酸残基，才会具有较好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。实施例6亮氨酸多肽类似物对肿瘤的抑制作用机制及钙离子水平的调节本实施例选择实施例1制备所得亮氨酸多肽类似物DMD，研究其对人肝癌细胞株(HepG2)的抑制作用机制及钙离子水平调节作用，均采用本领域的常规分析技术流式细胞仪分析。本实施例采用碘化丙啶PI单染分析对DMD作用HepG2细胞后的周期进行研究。本实施例采用AnexinV-FITC/PI的双染分析对DMD作用HepG2细胞后的早期凋亡进行研究，AnexinV正染而PI负染表示早期凋亡细胞，两种染料正染则表示正常细胞。本实施例采用钙离子荧光探针Fluo-3AM单染对细胞内钙离子浓度进行分析，荧光强度越大则说明细胞内游离钙离子越多。为进一步证实该化合物可使肿瘤细胞发生凋亡而抑制其生长的作用机制，且这种凋亡可能与细胞内钙离子水平有关；故取上述实施例1制备所得DMD，作用HepG2后，用流式细胞仪分析细胞周期，双染分析细胞有无发生凋亡，细胞内钙离子浓度的相对变化情况。取对数生长期的细胞，计数以105/孔接种于6孔板中，12h细胞贴壁后，加入实施例5中制备的DMD样品储备液(使终浓度为6.25、12.5、25ug/mL)，设置空白组(为同样体积的RPMI1640培养基)；待作用24h后收集细胞使成单细胞，洗涤染色后上流式细胞仪分析。结果表明DMD能使HepG2细胞阻滞于S期，且出现Sub-Gl峰(如表2所示)；能诱导细胞发生凋亡(如表3所示)；另外，细胞内的钙与空白组相比显著升高(如表4所示)。由此说明本发明的亮氨酸二肽类似物能够抑制肿瘤细胞的生长，是通过诱发细胞凋亡进行的，可将细胞周期阻滞于S期，结合表3和表4的结果，可得出本发明的亮氨酸二肽类似物是通过将肿瘤细胞内的钙离子浓度上调从而引起肿瘤细胞的凋亡的。表2DMD作用HepG224h后的周期变化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3DMD作用HepG224h后细胞的凋亡情况<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表4DMD作用HepG224h后细胞内游离钙离子浓度的变化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种亮氨酸二肽类似物，具有式(I)所示通式Boc-A-Al-OBn(I)其中，Boc为叔丁基氧羰基，Bn为苄基，A为D/L构型的N上含有或不含有甲基的亮氨酸残基，A1为D/L构型的N上含甲基的亮氨酸残基。2、根据权利要求1所述亮氨酸二肽类似物，其特征在于所述亮氨酸二肽类^^物为叔丁基氧羰基-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-苄酯、叔丁基氧羰基-L-亮氮酰-N-甲基-D-亮氨酰-苄酯、叔丁基氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-节酯、叔丁基氧羰基-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-苄酯、叔丁基氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯、叔丁基氧羰基-D-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯、叔丁基氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯或叔丁基氧羰基一N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-苄酯。3、一种权利要求1所述亮氨酸二肽类似物的制备方法，其特征在于该方法是以叔丁基氧羰基-亮氨酸和N-甲基-亮氨酸苄酯磺酸盐为原料，通过偶合反应制备得到亮氨酸二肽类似物，或是以叔丁基氧羰基-N-甲基-亮氨酸和N-甲基-亮氨酸苄酯磺酸盐为原料，通过偶合反应制备得到亮氨酸二肽类似物。4、根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述叔丁基氧羰基-亮氨酸为D构型或L构型，所述N-甲基-亮氨酸苄酯磺酸盐为D构型或L构型。5、权利要求1所述亮氨酸二肽类似物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开一种亮氨酸二肽类似物及其制备方法和应用，该亮氨酸二肽类似物的通式为Boc-A-Al-OBn，其中，Boc为叔丁基氧羰基，Bn为苄基，A为D/L构型的N上含有或不含有甲基的亮氨酸残基，Al为D/L构型的N上含甲基的亮氨酸残基。本发明采用化学合成方法得到了一系列新的具有活性的亮氨酸二肽类似物，对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用，可作为抗肿瘤先导化合物，用于制备抗肿瘤药物或者用作钙离子通道激动剂剂。本发明亮氨酸二肽类似物的合成方法简单，合成所得产物易于保存，产率高，易于工业化生产，且可根据实际需要制成所需剂型。文档编号C07K5/00GK101633688SQ20091004195公开日2010年1月27日申请日期2009年8月18日优先权日2009年8月18日发明者徐石海,杨小霞,盛熊申请人:暨南大学