专利名称：拟肽大环化合物的制作方法
拟肽大环化合物交叉参考本申请要求2008年9月22日提交的题目为“Organic Compounds”的美国临时申请61/099，063(代理人案号35224-742. 102)的优先权，本文通过引用引入该申请。
背景技术：
重组或合成产生的肽作为药品具有重要的应用。但是，肽类经常存在代谢稳定性差、细胞渗透性差和由于构象的灵活性而导致混杂的结合的问题。稳定这些肽的一种方法是使用分子内交联连接体(crosslinker)以维持肽处于所需的构象，例如使用二硫键、酰胺键或碳碳键来连接氨基酸侧链。参见，例如，Jackson等人(1991)，J. Am. Chem. Soc. 113 :9391-9392 ；Phelan 等人(1997)，J.Am. Chem. Soc. 119 :455-460 ；Taylor(2002), Biopolymers 66 :49-75 ；Brunei 等人 0005)，Chem. Commun. (20) :2552-2554；Hiroshige 等人(1995)，J. Am. Chem. Soc. 117 :11590-11591 ；Blackwell 等人(1998)，Angew. Chem. Int. Ed. 37 :3281-3284 ；Schafmeister 等人 O000)，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 ； Walensky 等人(2004)，Science 305 1466-1470 ；Bernal 等人(2007)，J. Am. Chem Soc. 129 2456-2457 ；美国专利7，192，713B1 (Verdine等人)(描述交联的稳定螺旋肽，其包含天然和非天然氨基酸，其中，该肽包含至少两个能够发生C-C键形成反应的反应性基团)和美国专利5，811，515 (Grubbs等人)(描述从含有两个或多个不饱和C-C键的前体合成构象限制性的/环状稳定的肽和拟肽)，该专利和出版物的内容通过引用引入本文。这类通过分子内交联剂而构象稳定的多肽有时被称为“装订的(stapled)，，多肽。这些交联的多肽的主要优势在于，相对于对应的非装订的多肽，它们具有增强的穿透细胞膜的能力。这种细胞摄取被认为是通过利用内吞作用的主动转运机制介导的。有助于肽进入细胞的一些物理特性还倾向于增加交联的多肽对于血清蛋白质 (如白蛋白)的亲和力。因此，许多极有希望的先导物表现出显著的“血清偏移(serum shift) ”，相比于使用无血清培养基的分析中的活性，其在体内或在具有基于血清的培养基的分析中活性大大降低，使得该肽在治疗或诊断的应用中远不够理想。但是，具有低水平血清结合的交联多肽往往细胞渗透能力差以及药代动力学差，例如，快速肾脏清除或首过清除。本发明解决了这一问题和其他问题。发明概述本发明公开了鉴定和优化交联的多肽的方法，所述交联的多肽对于血清蛋白具有降低的亲和力从而允许在血清存在下具有良好的活性，同时仍保持对于细胞膜的足够的亲和力以容易地转运进入细胞，保持对于血清蛋白的足够的亲和力以具有可接受的药代动力学特性和保持与细胞内的靶受体结合的高亲和力。本发明人已经发现，为了实现这些目标， 交联的多肽存在着血清蛋白结合的最佳范围。本发明还提供了具有优良的细胞渗透能力和在血清存在下的生物活性，以及具有允许优化具有提高的治疗效力或诊断活性的交联多肽的构效关系的最佳化合物。在一个实施方式中，本发明提供了鉴定在人类全血中具有提高的效力的交联多肽的方法，包括以下步骤合成母体交联多肽的类似物，并在无人类血清蛋白质和存在一个或多个浓度的人血清的情况下进行细胞分析，从而确定每种交联多肽对于人血清蛋白的表观亲和力。在另一实施方式中，本发明提供了制备在人全血中具有优化的细胞效力的多肽的
方法，该方法包括a)提供包含连接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交联连接体的
母体多肽，和其中，母体多肽通过能量依赖性的过程渗透细胞膜并结合细胞内的靶标；b)
在所述母体多肽中识别由邻近大的疏水侧链的酸性侧链组成的一个或多个二肽基序，其
中，酸性侧链不是结合靶标所必需的；C)用中性侧链替代所述基序中的酸性侧链，以制备
修饰的母体多肽；d)在人血清存在和不存在的情况下，在活性通过结合分子内靶标来介导
的全细胞分析中测量修饰的母体多肽的体外效力；e)计算修饰的多肽对于人血清蛋白的
表观亲和力OC)及其EC5tlJPf)如果所述修饰的母体多肽具有与母体多肽相比较高的K/
和相等或较低的EC5tl，则选择该修饰的母体多肽作为优化的多肽。在一些实施方式中，K/由
公式
权利要求
1.制备在人全血中具有优化的细胞效力的多肽的方法，所述方法包括a)提供包含连接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交联连接体的母体多肽，其中，该母体多肽通过能量依赖性的过程渗透细胞膜，并结合细胞内的靶标；b)在所述母体多肽中识别由邻近大的疏水侧链的酸性侧链组成的一个或多个二肽基序，其中，该酸性侧链不是结合靶标所必需的；c)用中性侧链取代所述基序中的所述酸性侧链，以制备修饰的母体多肽；d)在人血清存在和不存在的情况下，在其中活性通过结合分子内靶标介导的全细胞分析中测量所述修饰的母体多肽的体外效力；e)计算所述修饰的多肽对于人血清蛋白的表观亲和力OC)及其EC5tl；和f)如果所述修饰的多肽具有与母体多肽相比较高的K/和相等或较低的EC5tl，则选择该修饰的母体多肽作为优化的多肽。
2.筛选包含连接多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交联连接体的多肽的方法，其中， 所述多肽通过能量依赖性的过程渗透细胞膜，并结合细胞内的靶标，所述方法包括a)在人血清存在和不存在的情况下，在其中活性通过结合分子内靶标介导的全细胞分析中测量所述多肽的体外效力；b)计算所述多肽对于人血清蛋白的表观亲和力(K/)及其EC5tl；和c)选择具有1至700微摩尔的K/的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有小于70微摩尔的K/。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有约1-10微摩尔的K/。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有大约0.1-50%的人血中的估计游离分数，其中，所述估计游离分数由
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有大约0.5-10%的人血中的估计游离分数。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述能量依赖性的细胞渗透机制是内吞作用。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和第二氨基酸的至少一个是 α，α-二取代的氨基酸。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和第二氨基酸都是α， α-二取代的氨基酸。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽包括螺旋。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽包括α-螺旋。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和所述第二氨基酸由3个氨基酸分隔。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体包含6至14个连续的键。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体包含8至12个连续的键。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽包括含大约18至沈个原子的环。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和所述第二氨基酸由6个氨基酸分隔。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体包含8至16个连续的键。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体包含10至13个连续的键。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽包括含大约四至37个原子的环。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体跨越所述α-螺旋的1至 5圈。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体跨越所述α-螺旋的1个圈。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体跨越所述α-螺旋的2个圈。
23.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述交联连接体的长度是所述α-螺旋每一圈大约5 A至大约9 Α。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽在ρΗ7. 4时携带净正电荷。
25.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽包含卤素、烷基、荧光部分、 亲和性标记、靶向部分或放射性同位素中的一种或多种。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽提供治疗效力。
27.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有大约1微摩尔或更弱的对于人血清蛋白的表观亲和力。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有大约3微摩尔或更弱的对于人血清蛋白的表观亲和力。
29.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽具有大约10微摩尔或更弱的对于人血清蛋白的表观亲和力。
30.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的多肽相对于相应的未交联的多肽具有改善的通过能量依赖性的过程渗透细胞膜的能力。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二肽基序中的酸性侧链和大的疏水侧链不是结合靶标所必需的，并且分别被中性和较低疏水性的侧链替代。
32.根据权利要求1或2的方法选择的包含连接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交联连接体的多肽，其中，所述多肽通过能量依赖性的过程渗透细胞膜并结合细胞内的靶标。
33.治疗和控制与BCL-2家族成员的异常表达或活性有关的病症的方法，包括向需要的受试者施用有效量的前述任一项权利要求所述的多肽。
34.治疗或控制通过在过度增殖的细胞中MAML和Notch或CSL蛋白之间的相互作用或结合介导的过度增殖的疾病或病症的方法，包括向需要的受试者施用有效量的前述任一项权利要求所述的多肽。
35.前述任一项权利要求所述的多肽在制备用于治疗或控制与BCL-2家族成员的异常表达或活性有关的病症或用于治疗或控制通过在过度增殖的细胞中的MAML和Notch或CSL 蛋白之间的相互作用或结合介导的过度增殖疾病或病症的药物中的用途。
36.根据权利要求1或2的方法，其中，所述K/由公式
全文摘要
本发明提供了相对于相应的前体多肽具有改进的性质的生物活性的交联多肽，具有良好的细胞渗透性质和与人蛋白的结合降低。本发明另外提供了鉴定和制备这种改进的多肽的方法。
文档编号C07K14/47GK102482336SQ200980142223
公开日2012年5月30日 申请日期2009年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者D·A·安尼斯, H·M·纳什, R·卡佩勒-利伯曼, T·K·索耶, 河畑纪之 申请人:爱勒让治疗公司