高浓度单克隆抗体溶液中的病毒去除方法

专利名称：高浓度单克隆抗体溶液中的病毒去除方法
技术领域：
本发明涉及将存在于高浓度单克隆抗体溶液中的病毒去除的方法以及高浓度单克隆抗体溶液的制造方法。
背景技术：
由于担心在含有通过细胞培养而制造的单克隆抗体的抗体药物中有可能会混入原料来源或工序来源的病毒，因而在制造抗体药物的过程中，需要使病毒失活或者去除病毒。作为使有可能混入抗体药物中的病毒失活的方法，进行了加热处理、利用化学试剂的处理等，但仅靠这些单独的处理，病毒的失活并不充分，另外在这些方法中抗体药物中的抗体其本身也有可能变性。由此背景出发，作为不伴有化学变性的物理的病毒去除方法，实施利用过滤膜的病毒的分离去除。作为病毒去除用的过滤膜，已知有由纤维素这样的天然材料形成的膜，或者由聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PEQ这样的合成高分子材料形成的病毒去除膜(非专利文献 1 4)。利用装填有这些病毒去除膜的病毒去除装置所进行的抗体药物的过滤，理想的是，能够在短时间内过滤更多量的抗体、且可以具有足够高的病毒去除性能而将病毒去除。 但是，实际上例如为纤维素膜时，即便是20mg/ml以上的抗体浓度，也难以引起膜的堵塞、 能够进行过滤，但耐压性低、只能将实际使用压力提高至lOOltfa左右。或者为合成高分子膜时，虽然耐压性高、即便将实际使用压力提高至300kPa左右也没有问题，但当将抗体浓度提高至20mg/ml左右时，则存在引起膜堵塞、无法进行过滤的问题。因而，一般来说进行 10mg/ml以下的低浓度下的过滤。但是，近年来有抗体药物的制剂浓度提高的倾向，与此同时，在用于去除病毒的过滤工序中对希望提高抗体浓度的要求也逐渐提高。当提高单克隆抗体溶液中的抗体浓度时，有单克隆抗体之间容易缔合而形成凝聚体的倾向，当用病毒去除膜那样带有小孔径的膜进行过滤时，由于过滤所带来的物理应力，单克隆抗体之间的缔合变得更为显著，如上所述病毒去除膜发生堵塞。特别是，为了从单克隆抗体溶液中以高去除率将细小病毒这样直径18-24nm左右的小病毒去除，需要以细小病毒去除为对象的孔径小的病毒去除膜，但利用这种膜过滤高浓度的单克隆抗体溶液时，立即发生堵塞，具有抗体的回收率显著降低、过滤所需要的时间变得非常长的问题。虽然不是关于单克隆抗体的现有技术，但有现有技术公开了通过纳米过滤从蛋白溶液中将病毒去除的方法，即着眼于纤维蛋白原，将从选自精氨酸、胍、瓜氨酸、尿素及其衍生物及盐的离液剂(chaotropic)以及选自聚乙氧基山梨糖醇酐酯及其衍生物的化合物中选择的至少一个成分添加于蛋白溶液中，接着用具有15nm以上且小于35nm的孔径的病毒去除膜将蛋白溶液过滤(专利文献1)。专利文献1中记载了推测前述成分会抑制或者阻止蛋白分子的缔合或者分子周边的水化层的形成，但所指的蛋白质是纤维蛋白原、第VIII因子等血液凝固因子。另外，实施例仅是在精氨酸的存在/非存在下对纤维蛋白原溶液的膜透过性进行比较。而且，纤维蛋白原浓度也小于5mg/ml、以低浓度的溶液为对象。纤维蛋白原是在出血时发生聚合物化而起止血作用的蛋白质，是长度接近60nm的纽带状的细长蛋白质。与此相对，单克隆抗体是直径15nm左右的球状蛋白质，是等电点、亲水性等物理化学性质也与纤维蛋白原大大不同的蛋白质。专利文献1是关于纤维蛋白原的发明，并不是关于单克隆抗体的技术、而是关于作为蛋白质完全不同性质的技术，因而在精制单克隆抗体方面并非是可参考的技术。专利文献2记载了一种病毒去除方法，其为使用病毒去除膜从可能混有病毒的含有纤维蛋白原的溶液中将病毒去除的方法，其特征在于，在含纤维蛋白原的溶液中含有碱性氨基酸或其盐类及氯化钠。专利文献2也是以纤维蛋白原溶液为对象的用膜将病毒去除的方法，另外，蛋白质浓度也低达5 16. 5mg/ml，与本申请目的的高浓度单克隆抗体溶液大大不同。另外，病毒去除膜也使用细小病毒等小病毒的去除性能低的膜、即小的病毒能够通过的膜，作为去除对象的病毒也大于本申请的对象，因而是不涉及由于单克隆抗体的凝聚体与膜的关系而在过滤时存在问题的技术。单克隆抗体的精制工艺中，使用病毒去除膜时的溶液的条件(pH、离子强度等)有很多，因而抗体和膜的表面的物理化学特性随溶液条件而不同。实际上，根据溶液条件，抗体过滤时有Flux非常低的情况。作为其原因，与抗体表面与膜表面之间的相互作用有关， 其中在两者之间起作用的静电相互作用发挥影响。抗体与膜表面的电荷性质以表面电位 (ζ电位)来表示，由于溶液的PH与等电点(pi)的相关性，而变化成正或负的电位状态。 已知单克隆抗体的pi范围为6 10，在pH < pi的条件下，单克隆抗体具有高的正电位，在膜过滤中不利地发挥作用。因而认为，若缓和抗体的表面电位、抑制与膜的静电相互作用， 会提高过滤的Flux，但另一方面，在这种溶液条件下，在高浓度的单克隆抗体溶液中，由于抗体本身的电荷所导致的分散稳定性变差，因而易于形成凝聚体，存在在膜过滤中会引起经时的Flux降低的问题。即，关于如下方法的现有技术并不存在通过控制膜与抗体的表面电位并抑制高浓度的抗体本身的缔合，从而提高利用膜的过滤性，利用膜在短时间内且以高收率从高浓度单克隆抗体溶液中将病毒甚至包括小病毒也去除。现有技术文献专利文献专利文献1 美国特开2003/023^69号公报专利文献2 日本特开2001-335509号公报非专利文献非专禾丨J 文献 1 :Manabe. S> Removal of virus through novel membrane filtration method. > Dev. Biol. Stand.、(1996)88 :81-90.非专利文献 2 :Brandwein H 等、Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol(Basel).、(2000) 102 :157-63.非专禾lJ 文献 3 Aranha-Creado 等、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter. ,Biologicals. (1998)Jun ；26 (2) :167-72.
__专禾Ij文献 4 Moce—Llivina 等、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、 Journal of Virological Methods、(2003)April、Vol. 109，Issue 1，Pages 99-101.

发明内容
发明要解决的问题鉴于上述问题，本发明的课题在于提供利用膜从高浓度的单克隆抗体溶液中将病毒甚至包括小病毒也去除、在短时间内且以高收率将抗体作为滤液进行回收的方法。用于解决问题的方案本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过使用添加有碱性氨基酸的单克隆抗体溶液利用病毒去除膜进行过滤，能够以高去除率将存在于高浓度单克隆抗体溶液中的病毒去除，从而完成了本发明。即，本发明提供以下发明。[1] 一种含单克隆抗体的制剂的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml ；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)病毒去除膜的细小病毒去除率为LRV(Log Reduction Value:对数减少值)彡4。[2] 一种单克隆抗体溶液的病毒去除方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml ；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)病毒去除膜的细小病毒去除率为LRV(Log Reduction Value:对数减少值)彡4。[3] 一种含单克隆抗体的制剂的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml ；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)所述溶液中的单克隆抗体的ζ电位Eil(mV)为如下范围a)相对于所述病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为OmV彡Eil-Em彡20mV ；b)相对于含有所述单克隆抗体的、pH = 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的ζ电位EiO(mV)为IOmV彡EiO-Eil彡40mV。[4] 一种病毒去除方法，该方法用病毒去除膜对含单克隆抗体的单克隆抗体溶液进行过滤，其特征在于，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml ；
(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)所述溶液中的单克隆抗体的ζ电位Eil(mV)为如下范围a)相对于所述病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为OmV彡Eil-Em彡20mV ；b)相对于含有所述单克隆抗体的、pH = 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的ζ电位EiO(mV)为IOmV彡EiO-Eil彡40mV。[5]根据[3]或[4]所述的方法，其中，单克隆抗体溶液中的单克隆抗体的ζ电位 Eil(mV)相对于病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为-4% XEm彡Eil彡-550% XEm。[6]根据[3] [5]中任一项所述的方法，其中，含单克隆抗体的、pH = 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的ζ电位EiO (mV)为+25mV以上。[7]根据[1] W]中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液为通过细胞培养而制作的单克隆抗体溶液。[8]根据[1] [7]中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液的pH为4 7的范围。[9]根据[1] [8]中任一项所述的方法，其中，病毒去除膜的材质为纤维素。[10]根据[1] [9]中任一项所述的方法，其中，病毒去除膜的材质为进行了亲水化的合成高分子。[11]根据[10]所述的方法，其中，合成高分子为聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜或聚乙火布。[12]根据[1] [11]中任一项所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、组氨酸、 赖氨酸或它们的衍生物或它们的盐。[13]根据[1] [12]中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液中，碱性氨基酸的含量相对于抗体为0. 1 20mmol/g。[14]根据[1] [13]中任一项所述的方法，其中，抗体的处理量为^g/m2/3小时 /bar(压力换算)以上。[15]根据[1] [14]中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液含有选自无机盐、缓冲液成分、表面活性剂或糖类中的一种以上。[16]根据[1] [15]中任一项所述的方法，其中，利用病毒去除膜的过滤为死端
过滤ο[17]根据[1] [16]中任一项所述的方法，其在色谱层析、浓缩或缓冲液交换中的任一操作后进行用病毒去除膜对单克隆抗体溶液进行过滤从而去除病毒的工序。[18]根据[1] [17]中任一项所述的方法，其在浓缩或缓冲液交换的任一操作后进行用病毒去除膜对单克隆抗体溶液进行过滤从而去除病毒的工序。发明的效果根据本发明，可以在抑制抗体的凝聚体形成的同时、控制抗体与膜之间的电位关系，能够在短时间内且以高收率对高浓度的单克隆抗体溶液进行处理，且能够以高去除率将病毒甚至包括小病毒也去除。本发明可以期待抗体药物的制造工序的简化、紧凑化、低成本化等副带效果。
具体实施方式
以下更加详细地说明本发明。本发明中使用的抗体为单克隆抗体。另外，单克隆抗体可以通过任何方法制造及精制。优选通过CHO等动物细胞培养而制作的单克隆抗体。单克隆抗体的制造基本上可以利用公知的技术。可以如下而制造按照通常的免疫方法使动物对抗原产生免疫，利用公知的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，制作该细胞与肿瘤细胞的杂交瘤细胞，对其进行大量培养，从而可以制作。而且，单克隆抗体并非限定于杂交瘤细胞所产生的(小鼠)单克隆抗体，还包括为了降低相对于人的异种抗体抗原性等而人为地进行了改变的嵌合抗体。或者本发明还可使用进行了重排的人源化抗体。此为利用人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区域将人抗体的互补性决定区域置换而成，其通常的基因重组手法也是已知的。使用该已知方法，可获得再构成人源化抗体。单克隆抗体溶液中的抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml。优选为20mg/ml 80mg/ ml、更优选为20mg/ml 70mg/ml、进一步优选为20mg/ml 50mg/ml。当抗体浓度增高时， 利用病毒去除膜的过滤速度倾向于降低。单克隆抗体溶液中的抗体的纯度为单体为90%以上、更优选95%以上。作为抗体溶液中所含的单体以外的杂质有缔合体 凝聚体，它们是抗体的2聚体、3聚体、4聚体或多聚体。缔合体 凝聚体的量多时，用病毒去除膜进行过滤时会发生堵塞、无法获得高的处理量。单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸。碱性氨基酸可使用精氨酸、组氨酸、胍、赖氨酸或它们的衍生物或它们的盐。优选为精氨酸、组氨酸、赖氨酸或它们的衍生物或它们的盐。更优选为精氨酸或其衍生物或它们的盐。单克隆抗体溶液中的碱性氨基酸的浓度从过滤性的提高效果出发优选为IOmM 300mM的范围。另外，单克隆抗体溶液中相对于抗体的碱性氨基酸的含量从过滤性的提高效果出发优选为0. 1 20mmol/g。更优选为0. 3 lOmmol/g、进一步优选为0. 6 7mmol/g 的范围。(碱性氨基酸的作用原理)通过将碱性氨基酸添加至单克隆抗体溶液中从而能够改善过滤性的原因虽不清楚，但本发明人等认为如下。已知抗体通常在等电点以下带(+)电荷。认为本发明中的碱性氨基酸具有缓和抗体表面的电位、抑制其与病毒去除膜的(_)电荷的静电相互作用(静电引力)的效果。另外，通常认为，在接近于抗体的等电点的PH区域内，抗体之间的静电排斥力减少，从而抗体本身由于疏水性相互作用而有易于缔合的倾向、或者由于抗体与膜的疏水性相互作用而有过滤性降低的倾向，但碱性氨基酸进一步对于抑制抗体之间的疏水性相互作用以及抗体-膜间的疏水性相互作用也有效果。抗体、膜表面的电位以ζ电位来表示。抗体、膜表面的ζ电位的测定方法例如可以使用kta potential analyzer ELS-Z(大冢电子株式会社制)通过电泳光散射法测定， 但测定方法并非局限于此。若将规定溶液条件下的单克隆抗体的ζ电位设为Eil (mV)、将规定溶液条件下的病毒去除膜的ζ电位设为Em(mV)，则优选具有以下关系。这里，“规定溶液条件下的病毒去除膜的ζ电位”是指“在用与单克隆抗体溶液具有相同组成、但不含单克隆抗体的溶液充满病毒去除膜的条件下的该病毒去除膜的ζ电位”。
抗体的ζ电位Eil与膜的ζ电位Em之间的关系优选为OmV ( Eil-Em ( 20mV。 当Eil-Em处于该范围时，认为在抗体与膜之间发挥的相互作用减小、具有进一步提高膜的过滤速度的效果。当Eil-Em超过20mV时，在抗体与膜之间发挥的相互作用增大，对过滤不利。另外，本发明的病毒去除膜的电位在本申请的pH范围内带负电荷，进而，抗体带正电荷。利用其他的表示方式进行表示时，抗体的ζ电位Eil与膜的ζ电位Em之间的关系优选为-4% XEm彡Eil彡-550% X Em。本发明的单克隆抗体中，在抗体的等电点以下的pH、即pH = 4下且离子强度 0. ImM下的抗体的ζ电位(基本电位)EiO (mV)期望为+25mV以上。优选为+27mV以上、更优选为+^mV以上。为了通过碱性氨基酸的添加来抑制抗体与膜的静电相互作用、表现高的过滤性 (Flux)，优选将抗体的表面电位(ζ电位)Eil缓和至+20mV以下。而且，抗体的ζ电位EiO与Eil之间的关系优选为IOmV彡EiO-Eil彡40mV。 EiO-Eil小于IOmV时，则相对于抗体的基本电位的缓和作用较弱，无法获得所期待的过滤
速度提高效果。单克隆抗体溶液的pH优选为4. 0 7. 0的范围。当小于pH4. 0和超过pH7. 0时， 会引起抗体本身的变性、分解。在PH4. 0 7. 0的范围内，抗体本身稳定化、表面带正电荷， 因而抑制凝聚体形成。另外，碱性氨基酸在PH4. 0 7. 0的范围内发挥提高高浓度抗体的病毒去除膜过滤时的过滤性的作用。单克隆抗体溶液还可进一步含有选自无机盐、缓冲液成分、表面活性剂或糖类中的一种以上。作为无机盐，可含有NaCl、缓冲盐。作为缓冲液可使用醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、 磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。作为无机盐、缓冲液成分的浓度，以离子强度计优选10 500mM的范围。这里，离子强度可用下式计算。离子强度=1/2X Σ (Ci X Zi2)Ci 摩尔浓度、Zi 离子价数表面活性剂可使用作为非离子性表面活性剂的Tween20、Tween80等，浓度可含有 0. 01 0. 05w%。作为糖类(有单糖、二糖、三糖、寡糖、糖醇等)的添加剂，可含有1 10w%、优选含有1 5wt%的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、麦芽糖、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇、甘露醇、葡聚糖等。病毒去除膜的材质可使用纤维素或经亲水化的合成高分子。纤维素可使用再生纤维素、天然纤维素、醋酸纤维素等。经亲水化的合成高分子可使用亲水化聚偏氟乙烯 (PVDF)、亲水化聚醚砜(PES)、亲水化聚乙烯(PE)、亲水化聚砜(PQ等。作为亲水化方法， 可举出通过涂覆、接枝反应、交联反应等方法在膜表面导入亲水性官能团、或者固定亲水性聚合物的方法。膜的形状可以是平膜和中空纤维膜的任一种，由于即便是膜面积较大但可以使将膜装填于容器中而制作的过滤器小型化，因此优选中空纤维膜。可以制作被过滤液入口侧的一次侧空间和过滤液滤出侧的二次侧空间通过膜而被隔开的过滤器。将病毒去除膜用于过滤时，可作为过滤器的形态使用。病毒去除膜的细小病毒的去除性能需要为LRV4以上。更期望为LRV5以上。作为以细小病毒去除为对象的市售病毒去除过滤器，可列举出病毒去除膜由纤维素构成的 Planova 15N(旭化成医疗(Asahi Kasei Medical)株式会社制)、Planova 20N(旭化成医疗(Asahi Kasei Medical)株式会社制)，由亲水化PES构成的 Virosart CPV(Sartorius 公司制)、Viresolve Pro (Millipore 公司制)等。细小病毒有由于小鼠细小病毒混入CHO细胞(小鼠来源)而污染制造工艺中的单克隆抗体的实例，FDA出版了与使用动物细胞制作的生物药品的病毒安全性评价有关的指南(ICHQ5A)。细小病毒由于没有包膜，因而物理化学上稳定，对于在生物学制剂的制造工艺中的失活工序中通常进行的加热、低PH、化学药剂处理具有耐受性，作为具有与失活法不同的作用机理的病毒去除方法，利用病毒去除膜去除细小病毒的需求变高。细小病毒属于细小病毒科，是目前公知的最小病毒(直径18 Mnm)。可举出小鼠细小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、狗细小病毒(CPV)等。在本申请的病毒去除膜评价中作为模型病毒使用PPV。病毒去除膜的病毒的去除性能用LRV(Log Reduction Value)表示。LRV是由下述式计算在病毒去除膜的过滤前后的抗体溶液中的病毒浓度变化。LRV = Iog10 (C0/CF)这里，C0 =用病毒去除膜进行过滤之前的抗体溶液中的病毒浓度Cf =用病毒去除膜进行了过滤后的抗体溶液中的病毒浓度病毒浓度可以用感染性滴度、病毒核酸的复制数等来表现。作为感染性滴度的测定法可举出TCID50法、空斑技术等。病毒的核酸复制数可用PCR法等进行测定。在利用病毒去除膜进行过滤之前，需要调整为单克隆抗体浓度为20 100mg/ml 的范围、且至少含有碱性氨基酸的抗体溶液组成。如上所述，优选单克隆抗体溶液的PH为 4 7的范围。碱性氨基酸浓度优选每单位抗体为0. 1 20mmol/g的范围。可在色谱层析处理后的抗体洗脱液中添加规定浓度的碱性氨基酸、调整至规定 pH，还可以使用公知的方法，由洗脱液的缓冲液组成与调整为规定的碱性氨基酸、pH的溶液进行缓冲交换。另外，还可同时进行抗体浓缩和缓冲交换、调整至所需的溶液组成。PH调整可以利用NaOH、HC1、无机酸、有机酸、缓冲液进行。作为缓冲液可使用醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液等。利用病毒去除膜的抗体溶液的过滤方法优选为死端过滤。还可是使过滤压力为一定值的定压过滤、使过滤速度为一定值的定速过滤的任一种。过滤压力因病毒去除膜的材质而不同，在膜的耐受压力以下的范围内进行。例如，当为由纤维素构成的病毒去除膜时， 49kPa(0. 5bar) 98kPa(lbar)的范围最佳。为亲水化PVDF、亲水化PES、亲水化PS时， 98kPa(Ibar) 490kPa(5bar)的范围最佳。用病毒去除膜进行过滤的温度只要是不影响抗体溶液的状态(不会使其改性)的温度范围即可，优选为4°C 40°C的范围。更优选为4°C 35°C的范围。由于温度影响抗体溶液的粘度、影响病毒去除膜过滤时的Flux，因此，虽然也取决于抗体本身相对于温度的稳定性，但进一步优选20°C 35°C的范围。
在将溶液调整至规定组成后、用病毒去除膜进行过滤前，还可用由孔径大于病毒去除膜孔径尺寸的膜所制成的过滤器进行预备过滤。这里，大孔径的过滤器可使用 Planova 35N, Planova 75N (以上旭化成医疗株式会社制)、0. 1 μ m过滤器、0. 2 μ m过滤器等。也可不进行预备过滤，直接用病毒去除膜进行过滤。关于抗体的处理量(Throughput)，在以上的抗体浓度、过滤压力、温度范围内，作为病毒去除膜的单位膜面积、单位时间、单位过滤压力的处理量，通常可获得^g/m2/3小时 /bar (或98kPa)。抗体的处理量(Throughput)由上述每单位的过滤液量(V)和滤液中回收的抗体浓度(C)计算(抗体的处理量=VXC)，利用Throughput可评价过滤性和收率两
者ο(下游(Downstream)中的病毒过滤的位置)利用病毒去除膜进行过滤的工序可以在色谱层析、浓缩、浓缩/缓冲交换中的任一操作后进行。作为色谱，可举出在色谱柱中填充有离子交换树脂、凝胶过滤树脂的柱色谱，在多孔膜表面附着有离子交换基的膜色谱。作为色谱的分离模式，有凝胶过滤色谱、离子交换色谱(阳离子交换CEX，阴离子交换AEX)、疏水色谱(HIC)、亲和色谱、金属螯合亲和色谱、羟基磷灰石色谱等。还有作为色谱的配体而将离子交换和疏水相互作用复合的色
■i並曰O浓缩工序可根据公知的方法利用使用了超滤(UF)膜的方法进行。可利用离心浓缩进行。缓冲交换工序可根据公知的方法使用超滤膜与浓缩同时进行。还可利用凝胶过滤法进行。还可通过使用了透析膜的透析法进行。在利用病毒去除膜进行过滤之后，可接着进行利用色谱处理的精制处理。另外，还可通过UF处理进一步进行高浓度化。还可以以病毒去除膜过滤时的溶液组成进行最终制剂化。另外，还可在病毒去除膜过滤后添加糖类、表面活性剂等，进行最终制剂化。还可与其他组成的溶剂进行缓冲交换。另外，还可进一步进行冷冻干燥处理。实施例在以下示出的实施例中，病毒去除膜使用由纤维素中空纤维膜构成的 PlanOVa 20N(旭化成医疗株式会社制)(以下表述为过滤器A)及由亲水化聚偏氟乙烯中空纤维膜制成的过滤器(以下表述为过滤器B)。另外，作为单克隆抗体制剂中间制品的模型，使用根据国际公开第04/087761号小册子记载的方法、按照下述“单克隆抗体的制备”制备单克隆抗体溶液并使用。(过滤器B的制作)使用亨舍尔混合机(三井矿山(株)制、形式20B)在70°C下搅拌混合含有熔体流动指数(MFI)为2.5(g/10ml)的聚偏氟乙烯树脂(吴羽化学(株)制、T#1300)49wt%、邻苯二甲酸二环己酯(大阪有机化学工业(株)制工业品)51wt%的组合物，然后进行冷却， 制成粉末状，将该粉末状物从料斗投入到双轴同方向螺杆式挤出机、”…、(株)制 KZW25TW-50MG-NH(-600))中，在210°C下熔融混合，均勻地熔解。接着，一边向中空内部流入温度130°C的邻苯二甲酸二丁酯(大八化学工业(株)制工业品)，一边从内直径0. 8mm、 外直径1. 05mm的环状孔所形成的纺口分别将均勻熔解物挤出成中空纤维状，在调温至10、 20、30、40°C的冷却水浴中使其冷却固化，以50m/分钟的速度缠绕在金属缠线框上。之后，利用58wt%异丙醇水溶液(大八化学工业(株)制工业品)将邻苯二甲酸二环己酯及邻苯二甲酸二丁酯抽提去除，用水将附着的58wt%异丙醇水溶液置换，然后以浸渍于水中的状态使用高压蒸汽灭菌装置(平山制作所(株)制HV-85)在125°C下实施4小时的热处理。 之后，用异丙醇(大八化学工业(株)制工业品)将所附着的水置换，然后使用真空干燥机 (株)制)在60°C的温度下进行干燥，从而获得中空纤维状的微多孔膜。予以说明，在从缠绕至干燥的全部工序中，中空纤维以定长状态固定而进行处理。接着，对上述微多孔膜进行利用接枝法的亲水化处理。反应液使用如下而得到的反应液按照使丙烯酸羟丙酯(大阪有机化学(株)制工业品)达到8体积％的方式将其溶解于3- 丁醇(纯正化学(株)制工业品)的25体积％水溶液中，在保持于45°C的状态下进行30分钟氮气鼓泡。首先，在氮气气氛下，一边用干冰将该微多孔膜冷却至-60°C — 边以Co60为射线源，照射25kGy的、射线。照射后的微多孔膜在13. 4Pa以下的减压下静置15分钟后，在60°C下使上述反应液与该微多孔膜接触，静置1小时。之后，用58wt%异丙醇水溶液洗涤该微多孔膜，在60°C下真空干燥4小时，获得具有亲水性的微多孔膜。确认到该微多孔膜在与水接触时，水自发地渗透至细孔内。利用聚氨酯将12根该微多孔膜的束的两端密封，接合到聚苯乙烯制的中空纤维膜划分成入口侧空间和出口侧空间的滤筒中， 制成过滤器(有效膜面积0. OOlm2)。以下将使用上述方法获得的由亲水化PVDF中空纤维膜制成的过滤器表述为过滤器B。(单克隆抗体的制备)将含有用厚度过滤器和0.2(μπι)膜过滤器澄清化的人单克隆抗体(人IgGl)的 CHO细胞无血清培养上清(表达量700mg/L) 1500(ml)添加到用10(mmol/l)磷酸钠缓冲液(ρΗ6·0)进行了平衡化的 Protein A 柱(GE Healthcare Bioscience 公司制 Mabselect 20mm ID X 20cm)中(线速度500cm/h)。接着，通过5个柱容量的20 (mmol/1)柠檬酸钠缓冲液(pH3. 4)将人单克隆抗体洗脱(线速度500cm/h)。用10 (mmol/1)磷酸钠缓冲液(pH8. 2) 中和该洗脱液，进而用1.5(mmol/l)TriS-HCl调整至pH8.0，然后添加于用10 (mmol/1) Tris-HCl进行了平衡化的阴离子交换柱(GE Healthcare Bioscience公司制Q Sepharose XL IOmm IDX 15cm)中(线速度300cm/h)。添加完成后，将3个柱容量的平衡化缓冲液通入到柱(线速度300cm/h)中，用1.0(mol/l)醋酸将柱非吸附成分调整至pH5. 0，然后添加到用20(mmol/l)醋酸钠缓冲液(pH5. 0)进行了平衡化的阳离子交换柱(GE Healthcare Bioscience 公司制、SP Sepharose FF26mm IDX 15cm)中(线速度 300cm/ti)。添加完成后，用5个柱容量的平衡化缓冲液进行洗涤(线速度300cm/h)，进而通入5个柱容量的 20 (mmol/1)醋酸钠/0. 30(mol/l)氯化钠缓冲液(pH5. 0)，作为人单克隆抗体溶液进行洗脱 (线速度300cm/h)。利用超滤膜(MiIlipore公司制Biomax 30 50cm2)按照达到下述表1 和表2所示溶液条件的方式对该洗脱液进行浓缩和交换成缓冲组成。(病毒去除性能的测定)用加入有牛血清(Upstate公司制、在56°C的水浴中加热30分钟、灭活后使用)3 体积％和青霉素 / 链霉素(+lOOOOUnits/mlPenicillin, +10000 μ g/ml Streptomycin, λ > if卜口夕工 >制)1体积％的D-MEM( 4 > 卜口夕工 >制、high-glucose)(该混合液以后记载为3% FBS/D-MEM)稀释培养的PK-13细胞(由ATCC获得、ATCC No. CRL-6489)，制备细胞浓度2. OX IO5(cells/ml)的稀释混悬液。准备10块96孔圆底细胞培养板O^lcon公司制)，将该细胞混悬液分注于所有的孔中，每孔100 (μ 1)。接着，对于进行了下述3小时过滤的滤液的总量混合液，利用3% FBS/D-MEM制备它们的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍稀释液。进而，对于在过滤前刚采集的各原液，利用3% FBS/D-MEM制备它们的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍稀释液。在分注有上述细胞混悬液的96孔细胞培养板中，将各滤液和滤液的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5 倍稀释液以及原液的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7稀释液分注于8个孔中，每孔 100(μ 1)，在37°C、5%二氧化碳气氛下、在孵化器中培养10天。接着，对于培养了 10天的上述细胞培养板，利用红血球吸附法(病毒实验学总论国立预防卫生研究所学友会编、P. 173)进行TCID50(50%感染性滴度)的测定。用PBS(-) (日水制药株式会社制、用附带于商品的方法进行调制)将鸡保存血(日本〃 4才f ^卜制)稀释至5倍后，在2500(rpm)、4°C下离心分离5分钟，使红血球沉淀后，将上清吸引去除，再次用PBS (-)将含有所得的红血球的沉淀物稀释至200倍。接着，将所制备的红血球沉淀物的PBS(-)稀释液分注到上述细胞培养板的所有孔中，每孔100(μ 1)，静置2小时后，目视确认红血球是否吸附在培养的细胞组织的表面上，将可确认吸附者作为引起病毒感染的孔、将未确认吸附者作为未感染的孔进行计数。对于所得的各培养液的病毒感染的有无，对各滤液及其稀释液、或原液的稀释液分别确认比例，利用Reed-Muench法(病毒实验学总论国立预防卫生研究所学友会编、p. 479-480)计算log(TCID5Q/ml)作为感染性滴度，求出病毒去除率LRV，为LRV4以上。(单克隆抗体纯度的测定)利用HPLC(岛津制作所制!Prominence、柱东曹GPC用柱TSK gel G3000SWXL、流动相磷酸缓冲液(pH6.9)/0.3(mol/l)氯化钠水溶液)，通过峰面积比来测定按照达到以下实施例、比较例的溶液条件的方式进行了调整的单克隆抗体溶液纯度，为以下的表3所示。(抗体和膜的ζ电位(表面电位)测定)使用potential analyzer ELS-Z(大冢电子株式会社制)根据制造业者的指示书利用电泳光散射法进行测定(引用文献0tsuka Densi Web information,www/photal co.jp.)。由迁移度计算规定溶液条件下的抗体的ζ电位(Eil)。？！！二‘离子强度化丄!!]! NaCl溶液中的抗体的ζ电位(EiO)为+37mV。膜的ζ电位(Em)，与上述同样使用 potential analyzer ELS-Z(大冢电子株式会社制)根据制造业者的指示书进行测定。具体地说，膜的ζ电位(Em)如下测定使用平板试样用小室单元(大冢电子株式会社制)， 在其中设置膜，利用与抗体溶液具有相同组成、但不含抗体的溶液将膜充满，在该条件下， 使用用羟丙基纤维素包覆的电位大致为0的聚苯乙烯胶乳所构成的监测颗粒(大冢电子株式会社制)进行测定(引用文献 Otsuka Densi Web information, www/photal co.jp·)。 为由纤维素构成的膜时，代替中空纤维膜而制作平膜(引用文献日本特开昭59-45333号公报)、测定表面的ζ电位。抗体和膜的ζ电位示于下表4。实施例1 7及比较例1 5如上所述，将单克隆抗体溶液按照达到表1的条件的方式进行浓缩和交换成缓冲组成，然后利用上述方法进行该阶段的单克隆抗体纯度的测定。之后，添加0. 5Vol%的 PPV，充分搅拌后，使用膜面积0. OOlm2的过滤器A以98kPa(lbar)的压力对实施例1 7、 比较例1 5的溶液实施3小时的Dead-end式过滤。计算可过滤的单克隆抗体量(kg/m2/3hr/bar)，将结果示于表1。PPV的去除性能评价通过上述方法进行。进而，将抗体纯度的结果示于表3。[表1]
权利要求
1.一种含单克隆抗体的制剂的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)病毒去除膜的细小病毒去除率为LRV(LogReduction Value 对数减少值)彡4。
2.一种单克隆抗体溶液的病毒去除方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)病毒去除膜的细小病毒去除率为LRV(LogReduction Value 对数减少值)彡4。
3.一种含单克隆抗体的制剂的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)所述溶液中的单克隆抗体的ζ电位Eil(mV)为如下范围a)相对于所述病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为OmV彡Eil-Em彡20mV；b)相对于含有所述单克隆抗体的、pH= 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的 ζ 电位 EiO (mV)为 IOmV 彡 EiO-Eil 彡 40mV。
4.一种病毒去除方法，该方法用病毒去除膜对含单克隆抗体的单克隆抗体溶液进行过滤，其特征在于，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90%以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml 100mg/ml；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)所述溶液中的单克隆抗体的ζ电位Eil(mV)为如下范围a)相对于所述病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为OmV彡Eil-Em彡20mV；b)相对于含有所述单克隆抗体的、pH= 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的 ζ 电位 EiO (mV)为 IOmV 彡 EiO-Eil 彡 40mV。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，单克隆抗体溶液中的单克隆抗体的ζ电位 Eil(mV)相对于病毒去除膜的ζ电位Em(mV)为-4% XEm彡Eil ^ -550% XEm。
6.根据权利要求3 5中任一项所述的方法，其中，含单克隆抗体的、pH= 4、离子强度为0. ImM的溶液中的单克隆抗体的ζ电位EiO (mV)为+25mV以上。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液为通过细胞培养而制作的单克隆抗体溶液。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液的pH为4 7的范围。
9.根据权利要求1 8中任一项所述的方法，其中，病毒去除膜的材质为纤维素。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，病毒去除膜的材质为进行了亲水化的合成高分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，合成高分子为聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜或聚乙火布O
12.根据权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、组氨酸、赖氨酸或它们的衍生物或它们的盐。
13.根据权利要求1 12中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液中，碱性氨基酸的含量相对于抗体为0. 1 20mmol/g。
14.根据权利要求1 13中任一项所述的方法，其中，抗体的处理量为^g/m2/3小时 /bar(压力换算)以上。
15.根据权利要求1 14中任一项所述的方法，其中，单克隆抗体溶液含有选自无机盐、缓冲液成分、表面活性剂或糖类中的一种以上。
16.根据权利要求1 15中任一项所述的方法，其中，利用病毒去除膜的过滤为死端过滤ο
17.根据权利要求1 16中任一项所述的方法，其在色谱层析、浓缩或缓冲液交换中的任一操作后进行用病毒去除膜对单克隆抗体溶液进行过滤从而去除病毒的工序。
18.根据权利要求1 17中任一项所述的方法，其在浓缩或缓冲液交换的任一操作后进行用病毒去除膜对单克隆抗体溶液进行过滤从而去除病毒的工序。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种利用膜从高浓度的单克隆抗体溶液中去除病毒甚至包括小病毒、并在短时间内以高收率将抗体作为滤液进行回收的方法。本发明提供上述方法，其为含单克隆抗体的制剂的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜过滤单克隆抗体溶液中的病毒从而将其去除的病毒去除工序，(1)单克隆抗体中的单体含有率为90％以上；(2)单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为20mg/ml～100mg/ml；(3)单克隆抗体溶液至少含有碱性氨基酸；且(4)病毒去除膜的细小病毒去除率为LRV(Log Reduction Value对数减少值)≥4。
文档编号C07K1/34GK102365368SQ201080013920
公开日2012年2月29日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月27日
发明者小室雅廉, 本乡智子 申请人:旭化成医疗株式会社