专利名称：一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法。
背景技术：
质谱技术具有高分辨率、高灵敏度、高通量等特点，已经成为当前蛋白和多肽定量研究的首选技术。目前，基于质谱技术定量方法，有相对定量和绝对定量两个大的方面。其中，相对定量主要有稳定同位素标记方法、金属元素标记方法及基于色谱-串联质谱的非标记定量方法等；绝对定量技术方法主要有同位素稀释结合多反应监测质谱技术、金属元素标记结合电感耦合等离子体质谱技术等。稳定同位素标记法克服了基于鸟枪法的定量分析中，多肽离子化效率和信号响应强度受多重因素干扰，直接用其质谱峰强度或者面积进行精确定量存在较大问题的缺陷。 将不同样品来源的多肽分别标记“轻”质和“重”质同位素(如13C、15N和180)，由于“轻” 质和“重”质同位素标记多肽性质类似，具有相同色谱保留时间和离子化效率，此时成对出现的质谱峰信号可以准确地反映原样品中多肽及蛋白质的比例，从而可以进行精确定量。 但是，准备同位素化合物需大量时间，并且试剂昂贵以及不同的同位素标记法适用范围的局限性使得同位素标记定量方法的广泛应用受到了限制。对于金属元素标记方法的研究中，Whetstone等首次以化学性质很相近的稀土金属元素作为质量标签，提出了“元素编码亲和标签”的新方法，对标记了钇和铽元素标签的多肽色谱行为和质谱中的裂解行为做了初步的验证。Liu等使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 双酸酐键连到多肽的伯胺基，然后螯合稀土金属离子(Y和Tb)作为质谱检测的质量标签，Y 和Tb标记的多肽在LC中共洗脱，其不同的离子化效率可经统计校准而获得蛋白质的相对定量。Ahrends等系统地考察了金属元素亲和标签(MeCAT)结合nano-LC/ESI-MSn的研究策略在蛋白质相对定量的可行性。四种不同镧系金属螯合物(Tb-、Ho-、Tm-和Lu-DOTA)标记的多肽在色谱中具有相同的保留时间，定量的线性动态范围为2个数量级，最低的检测量可达飞摩尔(10_15mol)，平均标准偏差低于15%，并用LuMeCAT和Ho-MeCAT标记不同温度生长的酵母细胞的裂解液全蛋白样本，结合LC-MS，发现了 56个表达差异的多肽和确定了相应的蛋白质的相对量。虽然上述研究得到了良好的结果，但是目前关于金属元素标签的标记方法研究尚不太多，其应用也相对较少。昂贵的同位素标记试剂、繁琐的标记操作、受样品来源和样品数量的制约等标记方法的不足推动人们发展非标记的定量方法。非标定量法(Label-free)是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化。在目前广泛使用的HPLC/MS/ MSdata-dependent分析技术中，多肽的质谱分析次数与蛋白的丰度具有相关性，包括蛋白的肽段序列覆盖率、肽段匹配数、PMSS模型、emPAI等参数模型。但是，非标记定量技术同样也面临严峻的挑战(1)要求LC-MS/MS分析具有良好的重现性；(2)对大量LC-MS/MS分析数据进行归一化处理和科学的统计。目前多种数据分析软件大大促进了非标记定量技术的应用，但非标记定量技术要达到精确和可靠的定量结果，还需进一步的完善及发展。同位素稀释结合多反应监测质谱技术的定量方法，是目前高通量地对目标蛋白质进行绝对定量的重要方法之一。MRM-MS的基本工作原理是在第一级四极杆0)1)中选择性检测特定母离子，在第二级四极杆中将母离子进行碰撞解离，在第三级四极杆中选择性检测特定子离子。这样，只有符合设定值的母离子-子离子信号被特异性地检测到，有效地去除了大量干扰离子，而且M R M质谱扫描能同时监测多至300对的母-子离子对，因此MRM-MS具有灵敏度高、重现性好、准确度高和通量高等优点。将稳定同位素标记的内标肽加入到蛋白质酶切产生的内源性多肽中，由于内标肽和内源性肽具有相同的序列， 因此它们具有相同的液相色谱保留时间、质谱离子化效率和二级碎裂离子。通过比较两者子离子信号强度，可计算出内源性多肽的量和对应蛋白质的量。但是，由于同位素试剂的昂贵，使得许多研究者不得不另辟蹊径。近几年，一种元素质谱技术-电感耦合等离子体质谱技术应用于蛋白质绝对定量的文献报道不断增加。与生物质谱不同的是，ICP-MS是一种“硬”电离模式，其工作原理简单概括为样品被引入氩气流等离子体中心区，等离子体的高温(6000 10000K)使样品去溶剂化、汽化并离子化成正离子，各元素的正离子在真空系统内按照其质荷比分离，元素的同位素离子给出的信号与该元素在样品中的浓度成线性关系，如果加入含有该元素的某种化合物作为内标，就可对该元素进行准确的绝对定量。与生物质谱相比，ICP-MS具有的优点是(1)线性动态范围宽，可高达8 10个数量级；( 检测不受样品基质的影响，所以特别适合复杂体系中痕量或微量元素的定量。其缺点是在ICP-MS技术在定量的同时无法定性鉴定化合物的结构。ICP-MS技术应用于蛋白质组学规模化定量还存在很多亟待解决的问题，如进一步发展ICP-MS与高效的分离技术(如高效液相色谱、毛细管电泳或二维凝胶电泳)的联用技术，发展高效的金属标记方法，发展生物质谱技术和ICP-MS技术的联用以实现结构的鉴定和定量的结合等。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法。为了实现本发明目的，本发明的一种血清多肽，其质核比为m/z4466-4469。本发明还提供以上述血清多肽作为定量参比物的质谱半定量方法，包括以下步骤1)血清经过免疫学方法处理；向血清样品中加入适量PBS缓冲液，然后与含有多肽抗体的固相载体混合，固相载体经乙酸洗脱后，离心取上清液；其中，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒；所述多肽抗体为抗多肽5抗体或抗多肽6抗体，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分别为NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ。抗多肽5抗体(或抗多肽6抗体)制备方法采用偶联载体蛋白匙孔血蓝蛋白 (KLH)的多肽5(或多肽6)作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出杂交瘤细胞株，制备纯化腹水单克隆抗体；或者采用偶联载体蛋白KLH的多肽5 (或多肽6)作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；3-4周后耳缘静脉采血检测滴度，达到取血标准后颈动脉取血，分离并纯化多克隆抗体。
2)采用高通量的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对步骤1)处理后的上清液进行检测。3)根据质谱检测结果计算得出标志物峰相对于参比物峰的相对强度，并将其作为反映血清中标志物含量的指标。具体地，血清经过免疫学方法处理为取15-25 μ L固相载体置于Eppendorf管中， 加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗体，4°C混合5分钟-4小时，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM PH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀2-5次，每次PBS缓冲液用量为100-200 μ L ；将 10-40 μ L血清样品和10-50 μ L上述PBS缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS缓冲液清洗沉淀2-5次，每次PBS缓冲液用量为100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脱液，吸排混合l-5min ；离心，取上清液。优选地，血清经过免疫学方法处理为取20 μ L固相载体置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗体，4°C，转速5rpm混合15分钟，放置l-5min，移出上清液，用 0. OlM pH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀3次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；将 10 μ L血清样品和30 μ L上述PBS缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合他； 放置l-5min，移出上清液，用100 μ L上述PBS缓冲液清洗沉淀3次；加入10yL5%乙酸洗脱液，吸排混合anin ；离心，取上清液。进一步地，本发明的以上述血清多肽作为定量参比物的质谱半定量方法，包括以下步骤1)采用前述的免疫学方法处理血清，得上清液；幻采用高通量的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对步骤1)处理后的血清进行检测，检测次数为η ；其中，η为》1的整数；3)根据η次质谱检测结果得到的参比物峰高&的算术平均数除以待定量标志物峰高Xm 的算术平均数，即得计算标志物的相对含量。本发明中所述的参比物并不仅仅局限于本发明中所涉及的多肽，只要是在血清中稳定存在的蛋白或多肽均可作为参比物。本发明应用血清中本身含有的物质作为参比物来对待定量的标志物进行相对定量，为世界范围内首次提出，保证了参比物与待定量标志物来源的同一性，避免了外来参比物可能产生的干扰，操作方法简单，较之采用常规的同位素标记法，节省了大量时间及实验成本。本发明涉及的基于采用高通量、高灵敏度、高精确度的MALDI-T0F-MS质谱检测方法， 不仅适用于血清中蛋白或多肽的相对定量，对于其它体液或组织中的蛋白或多肽同样适用。
图1为本发明经过免疫学方法处理的某肝癌病人血清的质谱图。图2为本发明经过免疫学方法处理的某肝硬化病人血清质谱图。图3为本发明经过免疫学方法处理的某正常人血清质谱图。图4为本发明肝癌血清组ROC曲线分析结果。图5为本发明正常血清组ROC曲线分析结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，以下实施例中使用的 MALDI-T0F-MS质谱仪购自美国应用生物系统公司，型号为ABI 4700。实施例1 4中使用的血清样品于2010年10月采集自解放军302医院志愿者确诊病例。实施例1肝癌血清中标志物的定量1)血清经过免疫学方法处理，包括1)取20μ L固相载体，即包被蛋白G的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗体，40C，5rpm旋转混合30分钟，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀4次，每次PBS缓冲液用量为150 μ L ；取10 μ L血清样品和30 μ L上述 PBS缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合12h ；放置5min，移出上清液，用上述PBS缓冲液清洗沉淀4次，每次PBS缓冲液用量为150 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合 5min ；离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原；抗多肽5抗体的制备方法采用偶联载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的多肽5(氨基酸序列NLGHGHKHERDQGHGHQ)作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为AP0105，已于2011年9月27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 5269.制备纯化腹水单克隆抗体；2)质谱采集过程中，同一份血清共计采集15次，得到15张质谱图，代表图如图1 所示；3)应用“Data Explore”软件查看所得质谱图，在相同的读图参数下，找出15张图中各自所显示的标志物的峰高Xm与参比物的峰高X,，分别为(20. 71，100)、(25. 13， 100)、(28. 08,100), (16. 55，100)、(29.82,99.15)、(19. 53，100)、(17. 22，100)、(23.35， 100)、(11. 79,98. 89)、(27. 26，100)、(25. 31,94. 55)、(21. 46,97. 32)、(17. 9，100)、(25. 32， 79. 51)、(30. 27,90. 89)；4)根据上述数据和公式N = Xm/X，计算得出标志物的相对含量为=N1 = 0. 207, N2 =0. 251，N3 = 0. 281，N4 = 0. 166，N5 = 0. 301，N6 = 0. 195，N7 = 0. 172，N8 = 0. 234，N9 = 0. 119，N10 = 0. 273，N11 = 0. 268，N12 = 0. 221，N13 = 0. 179，N14 = 0. 318，N15 = 0. 333 ；5)对上述15个值取算术平均值，得到标志物的相对含量为N = 0. 235。实施例2肝硬化血清中标志物的定量1)血清经过免疫学方法处理，包括1)取20 μ L固相载体，即包被蛋白G的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗体， 40C，5rpm旋转混合30分钟，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀3次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；取10 μ L血清样品和30 μ L上述PBS 缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 缓冲液清洗沉淀3次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原；其中，抗多肽5 抗体同实施例1 ；2)质谱采集过程中，同一份血清共计采集15次，得到15张质谱图，代表图如图2 所示；
3)应用“Data Explore”软件查看所得质谱图，在相同的读图参数下，找出15张图中各自所显示的标志物的峰高Xffl与参比物的峰高Xr,分别为(71. 98，94. 28)、(24. 68， 100)、(69. 09，100)、(46. 74，94. 1)、(46. 52，85. 68)、(42. 23，100)、(42. 78，100)、(31. 53， 96.11)、(59. 42，100)、(54.39,100)、(55. 43，100)、(39.43,92.77)、(37.31,94.61)、 (57. 78，100)、(31. 75，100)；4)根据上述数据和公式N = Xm/X，计算得出标志物的相对含量为=N1 = 0. 763, N2 =0. 247，N3 = 0. 691，N4 = 0. 497，N5 = 0. 543，N6 = 0. 422，N7 = 0. 428，N8 = 0. 328，N9 = 0. 594，N10 = 0. 544，N11 = 0. 554，N12 = 0. 425，N13 = 0. 394，N14 = 0. 578，N15 = 0. 318 ；5)对上述15个值取算术平均值，得到标志物的相对含量为N = 0. 488。实施例3正常血清中标志物的定量1)血清经过免疫学方法处理；方法同实施例2 ；2)质谱采集过程中，同一份血清共计采集15次，得到15张质谱图，代表图如图3 所示；3)应用“Data Explore”软件查看所得质谱图，在相同的读图参数下，找出15张图中各自所显示的标志物的峰高Xm与参比物的峰高\，分别为(75. 21，71. 86)、(79. 52， 97.57)、(59.78,83.67)、(67.45,100)、(20. 99，22. 76)、(20. 55，23. 57)、(19.39,18.57)、 (21. 05,25. 99)、(74. 31,97. 42)、(96. 34，93. 16)、(85. 88，96)、(84. 4，100)、(100,97. 18)、 (54. 6,96. 19)、(18. 01,27. 36)；4)根据上述数据和公式N = Xm/X，计算得出标志物的相对含量为=N1 = 1.047, N2 =0. 815，N3 = 0. 714，N4 = 0. 675，N5 = 0. 922，N6 = 0. 872，N7 = 1. 044，N8 = 0. 810，N9 = 0. 763，N10 = 1. 034，N11 = 0. 895，N12 = 0. 844，N13 = 1. 029，N14 = 0. 568，N15 = 0. 658 ；5)对上述15个值取算术平均值，得到标志物的相对含量为N = 0. 846。实施例4肝癌血清中标志物的定量1)血清经过免疫学方法处理，包括1)取20μ L固相载体，即包被蛋白A的琼脂糖颗粒(ProteinAAgarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 6 抗体， 40C，5rpm旋转混合30分钟，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀3次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；取10 μ L血清样品和30 μ L上述PBS 缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 缓冲液清洗沉淀3次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原；抗多肽6抗体的制备方法采用偶联载体蛋白KLH的多肽6 (NLGHGHKHDRDHGHGHQ) 作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；3-4周后耳缘静脉采血检测滴度，达到取血标准后颈动脉取血，分离并纯化多克隆抗体。2)质谱采集过程中，同一份血清共计采集15次，得到15张质谱图。3)应用“Data Explore”软件查看所得质谱图，在相同的读图参数下，找出15张图中各自所显示的标志物的峰高Xm与参比物的峰高X,，分别为(23. 21，100)、(27. 49, 95.65)、(27. 34，100)、(26. 77，100)、(29. 55，100)、(19. 52，99. 15)、(20. 54，100)、(15. 88， 100)、(28. 23，100)、(13. 98,87. 79)、(28. 36，100)、(19. 46,95.52)、(14. 19，100)、(26. 22， 87. 39)、(29. 58,85. 79)。
4)根据上述数据和公式N = Xm/X，计算得出标志物的相对含量为=N1 = 0. 232, N2 =0. 287，N3 = 0. 273，N4 = 0. 268，N5 = 0. 296，N6 = 0. 197，N7 = 0. 205，N8 = 0. 159，N9 = 0. 282，N10 = 0. 159，N11 = 0. 284，N12 = 0. 204，N13 = 0. 142，N14 = 0. 300，N15 = 0. 345。5)对上述15个值取算术平均值，得到标志物的相对含量为N = 0. 2420采用实施例1 3的方法分别定量检测70例肝癌、70例肝硬化、70例正常血清中各标志物相对含量，并进行ROC曲线分析，结果如图4和图5所示，肝癌血清与正常血清两组诊断阳性标准为N <= 0. 378，分析结果为敏感度100%，特异度100% ；肝硬化血清与正常血清两组诊断阳性标准为N < = 0. 578，分析结果为敏感度86. 7%，特异度100%。实施例1 4中使用的参比物为质核比m/z4466-4469的血清多肽，其在正常人及肝病患者血清中均存在，因此，可将其作为参比物来定量正常人与肝病患者血清中某些差异性多肽标志物的含量。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种血清多肽，其质核比为m/z4466-4469。
2.以权利要求1所述的血清多肽作为定量参比物的质谱半定量方法，其特征在于，包括以下步骤1)血清经过免疫学方法处理；向血清样品中加入适量PBS缓冲液，然后与含有多肽抗体的固相载体混合，固相载体经乙酸洗脱后，离心取上清液；其中，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒；所述多肽抗体为抗多肽 5抗体或抗多肽6抗体，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分别为NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ ；2)采用高通量的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对步骤1)处理后的上清液进行检测；3)根据质谱检测结果计算得出标志物峰相对于参比物峰的相对强度，并将其作为反映血清中标志物含量的指标；其中，作为参比物的是权利要求1所述的血清多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，血清经过免疫学方法处理为取15-25μ L 固相载体置于Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗体，4°C混合5分钟-4小时，放置 l-5min，移出上清液，用0. 01MpH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀2_5次，每次PBS 缓冲液用量为100-200 μ L ；将10-40 μ L血清样品和10-50 μ L上述PBS缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS缓冲液清洗沉淀2-5次，每次PBS缓冲液用量为100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脱液，吸排混合 l-5min ；离心，取上清液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，血清经过免疫学方法处理为取20yL固相载体置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗体，4°C，转速5rpm混合15 分钟，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS缓冲液清洗所得固相载体沉淀3次， 每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；将10 μ L血清样品和30 μ L上述PBS缓冲液与清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合他；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS缓冲液清洗沉淀3 次，每次PBS缓冲液用量为100 μ L ；加入10 μ L 5%乙酸洗脱液，吸排混合^iin ；离心，取上清液。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤1)采用权利要求2-4任一项所述的免疫学方法处理血清，得上清液；2)采用高通量的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对步骤1)处理后的上清液进行检测，检测次数为η;其中，η为彡1的整数；3)根据η次质谱检测结果得到的参比物峰高\的算术平均数除以待定量标志物峰高 Xffl的算术平均数，即得计算标志物的相对含量。
全文摘要
本发明提供了一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法，该血清多肽的质核比为m/z4466-4469。本发明提供的质谱半定量技术方法包括如下步骤血清经过免疫学方法处理后，运用高通量的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测，在所得质谱图中，计算得出标志物峰相对于参比物峰的相对强度，并将其作为反映血清中标志物含量的指标，由此建立完整的质谱半定量技术方法。
文档编号C07K2/00GK102492017SQ20111035814
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者付海媛, 侯利平, 原剑, 周晓明, 孙云波, 张拓, 杨保安, 王东茂, 甄蓓, 肖汉族, 郑俊杰, 魏开华, 黄亚娟 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司