专利名称：二硫键稳定的功能性可溶mhc ii类异二聚体的制作方法
技术领域：
本发明涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。
背景技术：
主要组织相容性复合体(MHC)分子为脊椎动物免疫系统的主要组成部分，存在于所有有核细胞表面。MHC有两种主要的形式，S卩MHC I类和MHCII类。重要的是，两种类型都与蛋白质水解加工的肽形成称为T细胞表位的功能性复合体，这发生于表达 特定MHC的完全相同的细胞中。产生的肽/MHC(pMHC)复合体随后作为跨膜复合体存在于细胞表面上一该现象称之为抗原递呈。然后细胞表面-结合的PMHC可以与其同源部分(cognatepartner)——T细胞受体(TCR)相互作用，所述T细胞受体存在于T淋巴细胞的表面。
鉴于其在适应性免疫中的重要作用，基础和应用科学对在细胞和分子水平上理解PMHC-TCR的相互作用很感兴趣，从而获得两种分子的重组类型。也日益认识到，能否获得这种重组分子对能研究和理解系统生物，以及对开发新的治疗和诊断是非常关键的。许多重大的医学疾病需要进行治疗干预(therapeutic interventions),以调节病人免疫系统的活动。在如自身免疫性疾病和过敏症中，需要抑制过于活跃的免疫系统和慢性炎症。相反，免疫刺激是与感染和癌症有关的途径，以将免疫细胞激活并靶向于癌细胞。此外，移植接受者通常需要免疫抑制。同时，这也导致了大量免疫调节剂的产生，目前是一个数十亿美元的产业。理解这些疾病中的免疫成分和筛选新的治疗方法的关键是抗原递呈细胞和T细胞间的相互作用，或者更具体地是MHC I型和II型分子与TCR间的相互作用。II型MHC特异性的与外源衍生肽结合，并将它们递呈给CD4+T辅助细胞(TH细胞)。然后所述TH细胞被活化并成为分泌各种细胞因子的效应细胞。这些细胞因子大量地活化参与处理威胁的其它免疫细胞。该系统的故障会导致诸如自身免疫性疾病或者使癌细胞生存和分裂。因此，自身免疫性疾病的特征是与MHC密切相关和靶器官T细胞浸润(infiltration)。用于免疫调节剂筛选的平台需要稳定的、完全功能性的可溶性MHCII类分子。重要的是，目前可溶MHC II类分子的制备由于严重的问题而受阻，即缺乏分子稳定性。在过去的几年里，制备四聚体的可溶MHC I类分子的能力(四聚体技术)已经使基础和应用免疫学发生了变革(Constantin et al. ,2002, Biological Research forNursing,4 :115-127)。原因是，无论是就抗原而目还是就T细胞反应而目，四聚体技术已大幅提高了以特定方式追踪免疫反应过程的能力，这主要通过流式细胞术来评估。这种能力也带来了对免疫系统更深入的了解且确实可能带来了新的诊断工具。到目前为止，四聚体试剂在很大程度上限于MHC I类分子，因为关于重组MHC I类制备的大多数技术问题似乎已经得到解决。事实上，就MHC II类分子而言，已经证明了这个任务更具显著的挑战性。因此，目前MHC II类四聚体制备的常规方法没有可用的，虽然在文献和商用试剂中都出现了独立的例子(Vollers, S. and Stern, L. , 2008, Immunology123 :305-313)。在MHC II类四聚体可获得的少量实例中，它们被广泛地使用，并已对了解疾病的发展产生了巨大的影响。因此，鉴于成功制备重组MHC I类产物已经显示的影响，可以看出无论在学术上还是商业上都存在强烈而清晰的动力，以在新的MHC II类生产道路中投入更多的努力。然而，鉴于迄今为止遇到的问题，成功是不确定的。由于部分不明的原因，已经证明了MHC II类分子制备成可溶形式的稳定重组分子尤其困难。天然分子是非共价的跨膜异质二聚体，包括α-和0-链，0-链和β_链都具有跨膜区且属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各链的细胞外部分包括由两个结构域组成，每个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α I和β I结构域形成对T细胞表位的肽结合性能所必需的格状的α / β结构(inter-latticed α / β structure)。两个膜近端结构域，α2和β 2结构域，均形成离散的Ig结构域。在α链和β链中，均有约20个氨基酸残基的一段跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。α链和β链的二聚作用被认为是由以下原因产生⑴跨膜片段，(ii)肽结合以及(iii)在膜中发现的推定的附属成分。因此，一旦脱离其天然环境并作为可溶性分子制备，MHC II类分子经常受到内在低稳定性和非常低的生产水平的制约。此外，必须进行广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。·此外，鉴于二聚作用的上述要求，在任何非天然环境下的MHC II类分子制备的通用方法还不明朗，即在除与天然表达MHC II类分子的细胞的细胞膜相关制备以外的任何环境下，如其它生物实体、细胞或微粒(particles)表面上显示的非水溶性分子制备，如通过融合成病毒衣壳蛋白的方式在曬菌体表面表达的非水溶性分子。因此，目前还不存在可制备稳定MHC II类异二聚体的通用方法。然而，已进行了大量的研究，所有的研究都代表了特定案例成功的例子，这相当反映了任务的复杂性。这些例子是(i)真核细胞表面上的膜结合MHC II类异二聚体通过利用脂质系链(lipid tether)(GPI 锚定)的异位表达，参见 Wettstein et al.，1991，J. of Exp. Medicine, 174 :219-228 ；
(ii)昆虫细胞中MHC II类胞外结构域(ectodomains)的表达，参见Wallny et al.,1995, Eur. J. Immunology, 25 :1262-1266 ； (iii)异源二聚作用基序的引入,如亮氨酸拉链、MHC II类分子C端的引入,结合昆虫细胞生产,参见Quarsten et al.,2001, J. Immunol.,167 :4861-4868 和 Crawford et al. ,2006, Immunological Reviews, 210 156-170 ； (iv)抗体/MHC II类嵌合体结合昆虫细胞生产的制备，参见Casares et al. , 1997, ProteinEngineering, 10 :1295-1301 ； (v)利用细菌表达系统使得功能性pMHC三聚体通过包涵体重折叠的方法而形成，参见 Arimilli et al.，1995，J. Biol. Chem.，270 =971-977 ;或者(vi)使用截断型细菌(truncated bacteral)产生的仅由al和β I结构域构成的单链MHCII类形式，使得功能性MHC分子通过包涵体重折叠的方法而形成,参见Burrows et al.,1999, Protein Engineering, 12 :771_778。此外，Landais et al. , 2009, J. Immunol. , 183 7949-7957描述了利用内部人工二硫桥与外源性亮氨酸拉链结合以制备稳定的小鼠I-AdOVA MHC II类四聚体的昆虫细胞表达系统。重要的是，尽管由于修饰，表达水平增加，显然这些稳定增加的分子没有表现出特异性T细胞染色。
发明内容
本文所描述的方法与现有技术体系相比具有显著的优势，因为它们不仅提供可以应用于所有MHC II类分子的通用方法，还可以用于原核表达系统且不需要使用异源性/外源性二聚作用基序，如亮氨酸拉链。此外，本文描述的方法转化为特异性T细胞染色功能的增强，且直接归因于引入的修饰。然而令人惊讶的是，本发明的发明人已经确定了通用的方法，该方法可以克服或在很大程度上缓解与重组MHC II类分子相关的不稳定性问题。该方法包括重组MHC II类分子的制备，所述重组MHC II类分子中具有α和β链的细胞外部分且α和β链异二聚体通过改造的/人工的二硫桥被稳定，所述二硫桥利用α 2-β 2结构域交叉区域(interface)连接该两条链。二硫键将分子锁定在稳定的完整的功能性构象中。重要的和有利的是，该用于稳定MHC II类异二聚体的方法是通用的且不限于单一的重组形式，这样，避免了需要进行以上讨论的广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。此外，与许多现有的方法不同的是，考虑到原核宿主缺乏真核细胞的复杂机制，通常需要正确的二硫桥形成并因此形成功能性分子的事实，该方法可以应用于原核表达系统/宿主，这本身是令人惊讶的。本发明不仅解决了当前阻碍探索和开发免疫调节剂领域的争议，而且也将是开发和修饰T细胞并用于治疗的一个重要工具。因此，一方面，本发明提供了一种重组MHC II类分子，包括·(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；其中，⑴和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中⑴和(ii)通过位于所述α链α 2结构域和所述β链的β 2结构域当中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中。如上所述，蛋白质如MHC II类分子，由一个以上的多肽组成并具有跨膜结构域(transmembrane domain),该蛋白质很难在其天然膜的外部环境下制备,特别是以可溶的形式，因为在许多情况下，除其它原因外，蛋白质通过它的跨膜区域和可能的膜附属成分被稳定。这是MHC II类分子的实例且在文献中已被揭示，文献中MHC II类分子被报导是不稳定的，不能以良好的产量制备或不能识别和结合肽。因此，目前发明的分子代表了优于现有技术的重要进步，因为它们是稳定的并可以识别并结合肽，也接受T细胞的染色。如上所述，天然MHC II类分子包括α链和β链，它们都具有跨膜区域并属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各个链的细胞外部分包括两个结构域，每一个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α I和β I结构域形成T细胞表位的肽结合性能所必需的格状α/β结构。两个膜近端结构域，α2和β 2结构域，均形成离散的Ig结构域。α和β链中，均有约20个氨基酸残基伸出跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。本发明的分子包括MHC II类α链细胞外部分的全部或部分以及MHC II类β链细胞外部分的全部或部分。MHC II类α链细胞外部分包括信号序列、膜远端α I结构域和膜近端α 2结构域(形成离散的Ig结构域)。在跨膜结构域和α 2结构域之间还有间隔区域。同样，MHC II类β链细胞外部分包括信号序列、膜远端β I结构域、膜近端β 2结构域(形成离散的Ig结构域)和间隔区域。本文所用的术语“MHC II类α链细胞外部分”不包括α链的跨膜结构域或胞浆结构域(cytoplasmic domain)。事实上,在本发明的优选实施方式中，重组MHC II类分子不包括所述跨膜结构域的任何氨基酸残基(即由专用的跨膜外显子编码的氨基酸)或所述胞浆结构域的任何氨基酸残基。同样，本文所用的术语“MHC II类β链细胞外部分”不包括β链的跨膜结构域或胞浆结构域。事实上，在本发明的优选实施方式中，重组MHC II类分子不包括所述跨膜结构域的任何氨基酸残基(即由专用的跨膜外显子编码的氨基酸)或所述胞浆结构域的任何
氣基酸残基。本发明的重组分子中可以存在α和/或β链的全部所述细胞外部分(即信号肽、α I/β I结构域、α 2/β 2结构域和间隔区域)。然而,另外,仅α链和β链的部分细胞外部分需要存在于本发明的分子中，只要就其连接到适当肽的能力而言重组分子仍然是有功能的(如T细胞感受器肽)，并只要所述分子包含人工的(非天然的)半胱氨酸残基且该残基以能被用于形成二硫键来发挥稳定重组MHC II型分子的形式或构象存在。
可以从本发明重组MHC分子的α和/或β链中移除信号肽，特别是如果MHC II类分子在原核细胞中表达。本领域技术人员可以很容易地设计并制备适量N-端氨基酸残基被移除的这种构建体(constructs)。还可以很容易地测试这种移除是否会对功能,如结合肽或使T细胞活化或染色的能力产生影响，或对分子的稳定性产生影响。间隔区域也可以被完全移除或截去，例如，如实验实施例中所示，不包括α链间隔区和β链间隔区的9个氨基酸。再者，本领域技术人员可以很容易地设计和制备适量间隔区氨基酸残基被移除的这种构建体。还可以测试这种移除是否会对功能，如结合肽或使T细胞活化或染色的能力产生影响，或对分子的稳定性产生影响。本发明优选的分子包括α I结构域的至少一部分和β I结构域的至少一部分，只要这种结构域结合肽的功能或者本文描述的其它功能(例如为了递呈这种肽到T细胞受体(TCRs))不受影响。此外，作为整体的重组MHC II类分子无论是在连接肽的能力还是在本文叙述的其它功能上仍必须是有功能的。例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs))。优选具有完整或全部长度的αI和/或β I结构域，或者具有基本上完整或基本上全部长度的αI和/或βI结构域，其中，所述基本上完整或基本上全部长度的结构域包括天然序列的各种突变，例如氨基酸插入、缺失或置换，这种突变不影响这种结构域结合肽或本文叙述的其它功能，例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs)。本领域技术人员能够确定哪个氨基酸残基可以被突变、修饰或缺失而不影响这种功能。MHC II类分子其它保留的更好的功能是能够使T细胞活化且能更好地使T细胞染色。因此，本发明这些优选的分子包括α I和β I结构域足够的残基，使得能够结合肽，例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs)，以使T细胞活化或让T细胞染色。本发明其它优选的分子包括α 2结构域的至少一部分和β 2结构域的至少一部分，只要存在用于形成二硫键的非天然半胱氨酸残基。这种半胱氨酸残基相互之间需要以适当的方向和距离存在，以使半胱氨酸残基之间能够形成二硫桥并能够起作用以稳定重组MHC II型分子。此外，作为整体的重组MHC II型分子无论是就连接肽的能力而言还是就本文所述的其它功能(例如为了将这种肽递呈至T细胞受体(TCRs))而言，仍必须是有功能的。优选具有完整或全部长度的02和/或β 2结构域，或者具有基本上完整或基本上全部长度的α2和/或β2结构域，其中，所述基本上完整或基本上全部长度的结构域包括天然序列的变异，例如氨基酸插入、缺失或置换，这种变异不会影响α2和β 2结构域间二硫键的形成和后续重组MHC II类分子的稳定以及不会有害地影响α 2或β 2结构域的折叠。本领域技术人员能够确定可以突变、修饰或缺失哪个氨基酸残基而不影响这种功能。α和0MHC II类链的各种结构和功能的结构域和区域的氨基酸位置是众所周知的并在本领域叙述，例如Burrows et al, 1999, supra。各种结构域的位置也如图3所示，这些信息可以很容易地被用于设计本文叙述的本发明的重组分子(参见如图7)。分析本发明重组分子结合肽、使T细胞活化或使T细胞染色的能力的适当功能性测试也是本领域技术人员所公知的，且将包括例如表面等离子体共振(SPR)技术(如Biacore)和流式细胞术技术(如FACS)。特别优选使用流式细胞术，因为流式细胞术可以结合活细胞使用。本文所用的术语“二硫键”是指任何二硫桥，如改造的或人工的二硫桥，形成于定位在MHC II类异二聚体的α链α 2结构域和β链β 2结构域的半胱氨酸残基之间(即 是与链内(intra-chain)截然相反的链间(inter-chain) 二硫键)。所述二硫键在α链和β链之间形成共价键且发挥着稳定MHC II类异二聚体的作用。因此，本发明的重组分子是稳定的，并保留了完整的功能，例如，它们保留了它们对同源T细胞受体的配体的天然特异性，并优选保留了使T细胞活化或使T细胞染色的能力。可以通过众所周知的方法分析本发明MHC II类分子稳定的或变得稳定的性能，如增强的对热变性的抗性(例如通过ELISA、SPR或圆二色谱法测定)。更优选的测试为评估SDS PAGE凝胶上保留的异二聚体。在非还原条件下，SDS-PAGE凝胶上可以很容易看到完整和稳定二硫键合的异二聚体，可以观察到适当分子量处对应完整异二聚体的带。合理的试验在实施例中显示，参见图5和10。这种二硫键形成于半胱氨酸残基之间，通常不存在于天然MHC II类α 2和β 2结构域中。因此，所述半胱氨酸残基被改造或人工地引入，例如通过天然分子中适当的非半胱氨酸残基定点突变为半胱氨酸残基，从而使得在α2和β 2结构域中新引入的半胱氨酸残基间形成二硫键。该键也可以被描述为内部二硫键。用于突变为半胱氨酸的适当残基优选分别具有β -碳原子，所述β -碳原子相距约6Α (O. 6nm)、7A (O. 7nm)或以下,例如在4A (O. 4nm)或5A (O. 5nm)至6.5A (O. 65nm)或Ik (O. 7nm)范围内，优选在5A (O. 5nm)至6.5A (O. 65nm)范围内，最优选在天然MHC II类异二聚体中的距离在4A (O. 4nm)或5A (O. 5nm)至5.6A (O. 56nm)或6A (O. 6nm)范围内。优选用于突变的位点在物种间和特定物种的亚型(isoforms)和亚类(isotypes)间是保守的。特别地，优选的用于突变的位点在小鼠和人类MHC II类序列间是保守的，或者在人类MHC II类亚类如DP、DQ和DR间或鼠亚类如I-E和I-A间是保守的。此外，或另夕卜，优选的用于突变的位点通过基于晶体结构的3D叠加(3Dsuperimposition of crystal structures)的结构分析被鉴定。在这种方式中，α2和β 2结构域间形成交叉区域的残基能够被检测并可以选择具有相距7Α或者以下(或任何以上所述的其它距离或范围)的β_碳原子的侧链以进一步的分析或突变成半胱氨酸残基。进行这种结构分析的方法是为本领域技术人员所公知的。例如，MHC II类分子的晶体结构随时能够用于进行这样的分析，例如来源于RCSB PDB蛋白数据库。进行这样的晶体结构的3D叠加分析的适当软件或其它方法也在本领域可以得到，例如使用免费的软件如PyMOL、M0LM0L> DeepView 或专门的网站如 iSuperpose。
特别优选半胱氨酸被引入以形成二硫键的位点对为以下中的一对或多对，即一对或多对 Pro 96a2-Ser 11902 (第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12102 (第 2 排)、Arg 94a2_Asn15102(第 3 排)、Phe 148a2-Gly 15202 (第 4 排)、Pro 96a2-Thr 10102 (第 5 排)、Pro96a2-Ser 12102 (第 6 排)、lie 106a2_Asn 15102 (第 7 排)和 Ser 95a2_Asp 12202(第 8排)。根据β碳原子的临近将各位点对排列，且虽然可以使用任意一对，但优选的是1-4或1-3排的位点对。氨基酸位置和位于a 2和β 2结构域中以及如上所述的残基对位置上的天然氨基酸的性质适于鼠I-E亚类的MHC II类分子。氨基酸编号与成熟肽的氨基酸(即排除了信号肽的编号)相关。能够被用来鉴定修饰的半胱氨酸残基位置的典型参考序列为MGT数据库中给出的I-E序列，如图3所示(α链记为H-2EA*02 (SEQ ID NO 1)且β链记为H-2EB*01(SEQ ID NO :2))。事实上，在图3中，第I排、第2排和第3排位置的残基用黑色阴影标记，且可以很容易地从图3中确定其它排残基的位置。因此，除非另有说明，本文所述的MHC II类氨基酸残基的编号和性质遵循Lefranc, M-P.，et al. , 2009 (Nuc. Acids Res. ,37 :D1006_D1012, database issue (数据库·问题))中描述的IMGT系统以及从以下参考网站获得的IMGT数据库http://imRt. cines.fr http://www. imRt. org。实施例中还提供了相关的GenBank(基因库)收录号。例如，H-2E (小鼠I-E)相关的收录号为Κ00971(α-链)和AF050157 ( β -链)。在本发明优选的实施例中，二硫键位于半胱氨酸残基之间，该半胱氨酸残基定位于小鼠I-E亚类的成熟多肽的Pro 96a2-Ser 11902 (第I排)、Ser 95a2Ser 12102(第2排)或Arg 94a2-Asn 151@2(第3排)对应的残基上或另外的MHC II类亚类中的相应位置。本文提供了测定这种半胱氨酸残基位置的参考序列。上述讨论的优选位点对也显示于表2中，表2使用IFNG编号和MGT编号，即Pro96a2-Ser 11802(第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12002(第 2 排)、Arg 94a2_Asn 15002(第 3 排)、Phe 148a2-Gly 15102 (第 4 排)、Pro 96a2-Thr 10002 (第 5 排)、Pro 96a2-Ser 12002(第6排)、Ile 106a2-Asn 15002 (第 7 排)和 Ser 95a2_Asp 12102 (第 8 排)中的一对或多对。对于IFNG编号，表2的氨基酸编号对应于生物大分子的三维结构信息的蛋白质数据库(PDB)数据库中的编号,检录号(entry number)PDB ID : 1FNG,且可以看出，这个数据库记录的β链中适当残基的位置比頂GT数据库序列中的相应残基少一个氨基酸。因此，该命名是略有不同的。那些如表2和图3所示的相应残基可以很容易地在其它小鼠亚类(如I-A亚类)或人亚类中鉴定到，例如通过使用适当的软件如Clustal软件进行比对。事实上，与小鼠I-A亚类的比对如图3所示。此外，与人类MHC II类同种异型HLA-DP、-DQ和-DR的代表性比对如图7所示。表2和图3中所示的那些第1、2和3排的对应残基的位置用黑色阴影在图7A中标记为α -链和在图7Β中标记为β -链，且从图7可以很容易地确定其它排残基的位置。可以看出，表2和图3所示的α 2和β 2位置在整个人类HLA族群(r印ertoire)中是完全保守的。因此，可以很容易地使用图7所示的序列比对和上述信息定位在任何人类MHC II类等位基因的α2和β 2结构域中的适当残基突变为半胱氨酸，以形成所需的二硫键排列。类似的比对方法可以用来鉴定任意其它物种或亚类中的对应残基。
本文所讨论的二硫键稳定的连接与稳定MHC II类分子的其它方法和手段如现有技术中的方法和手段是兼容的。例如，二硫键可与各种二聚作用基序如亮氨酸拉链基序(如 Quarsten et al. , 2001 and Crawford et al. , 2006, supra 中所述)结合使用，或者与Ig融合(与免疫球蛋白Fe片段融合,如Casares et al. , 1997, supra中所述)结合使用，且可以适当地设计本发明的分子以及编码它们的载体。本文其它地方所述的在原核生物如细菌中表达或制备本发明的分子，宿主是优选的，且在这样的实施方式中，特别是在从包涵体中分离分子的实施方式中，优选不使用亮氨酸拉链基序或其它二聚作用基序。因此，本发明优选的方面提供了一种能够在细菌宿主中表达的重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分； 其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α 2结构域和所述β链的β 2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中。另一优选方面提供了一种重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α 2结构域和所述β链的β 2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中，且进一步地，所述重组分子不包括亮氨酸拉链基序。在其它实施方式中，不包括二聚作用基序。在这些实施方式中，优选重组MHC II类分子能够在原核生物如细菌宿主中表达。虽然本发明的二硫键连接可以与稳定MHC 11类分子的其它方法和手段结合使用，所述二硫键可以提供稳定MHC II类分子的独有手段。事实上，这是优选的实施方式。本文使用的术语“稳定MHC II类分子的独有手段”是指为稳定分子提供独有或唯一手段的二硫键不是特定MHC II类分子中任何天然存在或固有的稳定性，如本发明的二硫键提供了稳定MHC II类分子的独有的或唯一的人工的或改造的或非天然的手段。因此，这种实施方式排除了本领域所述的其它稳定手段的使用，如亮氨酸拉链或其它二聚作用基序。令人惊奇的发现，这种二硫键足以稳定MHC II类分子而不需要任何额外的非天然手段的稳定如二聚作用基序，这已在本文提供的数据中得到了很好的证明，其中该分子以稳定和有功能的形式存在于丝状噬菌体表面。该发现特别令人惊奇的是这样的事实，以Ig折叠拓扑结构(Ig fold topology)构建的改造分子在天然生物宿主中表达。在自然界只出现在生命的真核生物域的Ig折叠需要在天然半胱氨酸间形成保守的域内S-S桥(Halaby，D.M.，et al.，1999，Protein Eng. ,12(7) :563)，以完成其功能的拓扑结构。因此，被普遍接受的是，当该分子在原核生物宿主中表达时，难免缺乏正确形成S-S桥所需的复杂真核细胞伴侣机制，明显异常S-S桥的形成，会导致功能性表达的缺失。包括增加半胱氨酸数量的改造方法，不是说在这些系统中确定的形成人工S-S桥，因此，一般被认为是无法生存的。在此，我们明确地提供了这不是事实的证据，因为功能性分子通过表现出特异性结合到同源配体(图6和图9)的共价二聚体的形成显示于所示噬菌体上(图5和
图10)。在一个实施方式中，本发明MHC II类分子的α和β链还包括链内二硫键，如天然存在的存在于天然存在的半胱氨酸残基之间的链内二硫键。例如，这种天然存在的链内二硫键可能存在于α2和β 2结构域中，以形成这些结构域的Ig折叠拓扑结构。此外，大多数MHC II类分子在连接β_折叠层与α-螺旋部分的β I结构域中具有域内二硫桥。更重要的是，许多MHC II类分子在β I结构域的折叠层中包含额外的游离半胱氨酸，它不参与任何二硫键的形成，但可以与新引入的非天然半胱氨酸残基形成错误的二硫键。因此，在本发明优选的实施方式中，特别是在使用原核生物表达的实施方式中，剔除了该残基，例如通过突变成保留完整结构的其它残基，如丝氨酸或丙氨酸。技术人员能够很容易地在任何MHCII类等位基因中确定该半胱氨酸残基的位置。例如，图3Β(如SEQ ID NO 2)所示的全长MGT参考序列Η-2ΕΒ*01中的β链残基38对应的半胱氨酸，或者成熟MGT参考序列
(即无信号肽的序列)中的残基12。其它β I结构域半胱氨酸(形成桥的半胱氨酸)，该半胱氨酸也可以与新引入的非天然半胱氨酸残基促进错误二硫键形成，也可以很容易地被技术人员找到。例如，位于图3Β (SEQ ID NO 2)所示的全长MGT参考序列Η_2ΕΒ*01中的残基42和106，或分别是成熟IMGT参考序列(即无信号肽)的残基16和80。在本发明替代和优选的实施方式中，不存在一个或多个这些半胱氨酸残基。这可以通过将适当的天然半胱氨酸残基中的一个或多个突变为不参与二硫键形成的另一种氨基酸残基来实现，以防止键的形成。取代半胱氨酸的代表性残基为保留分子完整结构的，例如，保留氢键。上述Ser或Ala为首选的。上述一个或多个天然半胱氨酸残基的剔除应当有利于防止在天然半胱氨酸残基和本发明新改造的非天然半胱氨酸残基之间形成错误的二硫键。因此，在本发明优选的实施方式中，剔除了 β I结构域中的一个或多个天然半胱氨酸残基。在本发明特别优选的实施方式中，对应全长参考序列H-2EB*01 (SEQ ID NO 2)位置38、42或106的半胱氨酸残基中的一个或多个(或成熟参考序列中的相应残基)，或者其它MHC II类亚类中相应位置处半胱氨酸残基中的一个或多个被剔除。本文使用的术语“功能性肽结合结构域”是指本发明重组MHC II类分子中能够与肽(如T细胞效应器肽或抗原肽)结合的结构域。这种肽结合应当处于能够检测的水平且用来检测结合的适当方法为本领域技术人员所公知，如表面等离子体共振(SPR)技术或流式细胞术技术。在一些实施例中，所述肽以这样的方式被结合，从而能够将所述肽递呈至TCR，或者至少测试所述肽是否能够被递呈至TCR。优选地该肽以这样的方式与MHC II类分子结合或联合，从而能够使TCR与pMHC复合体结合。更优选地，这种与TCR的相互作用使得识别pMHC复合体的T细胞被染色或是可见。优选地，这种肽结合结构域能够结合肽，然后开始通过TCR活化T细胞，如能够诱导T辅助细胞例如分泌细胞因子如IL-2，或者诱导细胞增殖(如通过将BrdU并入为cpm进行测量)。这种肽结合结构域通常由来源于MHC II类分子α I和β I结构域的残基形成。本发明的MHC II类分子可以以无修饰或空载的形式提供，即没有肽结合到上述的肽结合结构域(即不含肽)。在这种情况下，随后可以在体外用任何适当的肽装载MHC II类分子。这种体外装载优于许多在先的MHC II类分子，为了有助于II类异二聚体的稳定，必须附加肽而制备，如按照借助短接头(linker)将肽制备成具有MHC β链的共价融合蛋白的方式制备。体外装载能够产生真正通用的MHC II类分子，而无需为每个不同的MHC-肽复合体提供不同的表达载体。在本发明的一些实施方式中，重组MHC II类分子含有与上述肽结合结构域结合或联合的肽。可以使用任何适于与由MHC II类分子的α I和β I结构域的残基形成的肽结合结构域相结合或联合的肽。通常这种肽为12-25mer，且通常由α I和β I结构域形成的凹槽两端伸出。在天然的MHC II类分子中，该肽源于外源性抗原。在本发明中，可以使用任何这种多肽。例如，本领域已经鉴定的和文献报导的一些由MHC II类分子递呈并引起TCR结合和T细胞活化的特异性T细胞效应器肽，且这些肽中的任何一个可以与本发明结合使用。特别地，已经确定了由MHC II类分子递呈的特定肽与特定疾病存在联系，且在本发明重组MHC II类分子与肽联合的实施方式中，优选疾病特异性肽。本领域已经描述了一些这样的肽，而其它的在将来将被鉴定，这些肽中的任何一个均适于与所述MHC II类分子使用。与MHC II类分子肽结合结构域联合或结合的代表性肽为已被发现·的由HLA-DQ2MHC II类分子递呈且与腹腔疾病相关的人类a -II-醇溶蛋白(N-PQPELPYPOPE-C);已被发现的由HLA-DR4MHC II型分子递呈且与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)相关的人类 hCkappaaa4CH48 (N-WKIDGSERQ-C);已经发现的由 HLA-DP1MHC II类分子递呈且与破伤风相关的人类TTaa94Hfi7(n-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-C)；以及已经发现的由鼠I-Ed II类分子递呈且源自H型流感(H. influenza) (aal 10-120 N-SFERFEIFPKE-C)的禽流感膜蛋白(HA)衍生的肽。另外，可以使用其它肽，例如鉴定这些肽是否可以与肽结合结构域结合以及它们是否能够使T细胞结合以及优选通过TCR使T细胞染色或使T细胞活化。以这种方式，本发明的分子可以用于鉴定充当T细胞表位的新的和先前未知的肽(如抗原肽)。另外，重组MHC II类分子可以与无关的或非T细胞效应器肽(所谓的“填充”肽)联合，所述无关的或非T细胞效应器肽可以通过打开将其连附至MHC分子的接头而从MHCII类分子中释放出来，然后被参与体外肽交换反应的T细胞效应器肽取代。可以以任何适当的方式促进所述肽与MHC II类分子的结合或联合。例如，可以改造本发明的构建体，使得这种肽与MHC II类分子结合而制得(如通过在相同的构建体上编码它们，如编码通过适当的接头序列共价连接至PMHC II类链或a MHC II类链的肽，或者在相同宿主细胞中的不同构建体)，从而促进重组MHC II类分子的制备(该重组MHC II类分子可递呈或结合或联合被适当的T辅助细胞识别的所述肽)。制备所述肽联合分子的适当方法如Kozono等1994 (Nature, 369 :151-154)所述。Kozono的方法使用18aa的残基接头，然而在本发明优选的实施方式中，更短的接头如15aa接头(如Gly-Ser接头如(G4S)3)或 6、7 或 8aa 残基接头(如 Gly-Ser 接头如 GSGSGS、GGSGSGS、SGSGSGS 或 SGGSGSGS)，最优选使用6aa的残基接头。本发明普遍适用于任何类型的MHC II类分子，例如适用于任何物种的MHC II类分子和那个物种中MHC II类分子的任何子型(sub-type)。特别地，本文鉴定的残基(该残基用于突变为非天然半胱氨酸残基以促使一个或多个链间二硫键的形成)为物种间保守的，从而支持了方法的普遍性。因此，本发明能够适用于所有哺乳动物的MHC II类分子，如人类、小鼠、大鼠、猪、山羊和绵羊，特别是人类和小鼠分子。例如，本发明适用于DP、DQ和DR人类MHC II类分子(即三种在人类中鉴定的功能性MHC II类分子类型)和小鼠I-A和I-E分子(例如I-Ed和I-Ek分子，优选I-Ed)。其它I-A和I-E分子的例子如下表所示。用常规使用的近交系小鼠(inbred mouse strain)表达MHC等位基因
权利要求
1.一种重组MHC II类分子，其特征在于，该重组MHC II类分子包括 (i)MHCII类分子α链细胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII类分子β链细胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了有功能性肽结合结构域，且其中⑴和(ii)通过位于所述α链的α 2结构域和所述β链的β 2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中。
2.根据权利要求I所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子不包括亮氨酸拉链基序。
3.根据权利要求I或2所述的重组MHCII类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E 亚类的 Pro 96a2-Ser 11902 (第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12102 (第 2 排)或 Arg 94a2_Asn15102(第3排)的半胱氨酸残基或其它MHC II类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。
4.根据权利要求3所述的重组MHCII类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E亚类的Ser 95a2-Ser 121@2(第2排)的半胱氨酸残基或其它MHC II类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，对应参考序列H-2EB*01(SEQ ID NO :2)位置38、42或106的半胱氨酸残基中的一个或多个，或者其它MHCII类亚类中相应位置处的半胱氨酸残基中的一个或多个被剔除。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子在丝状噬菌体的表面表达。
7.根据权利要求6所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子表达为与噬菌体表面蛋白 gpIII、gpVII、gpVIII 或 gpIX 的融合。
8.根据权利要求7所述的重组MHCII类分子，其中，所述噬菌体表面蛋白为gpIX。
9.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子为可溶性分子。
10.根据权利要求9所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)与免疫球蛋白的Fe部分融合。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子为多聚体。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)源自小鼠或人类MHC II类分子，优选为人类。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子由细菌宿主产生。
14.根据权利要求13所述的重组MHCII类分子，其中，所述细菌宿主为大肠杆菌，优选大肠杆菌K12衍生物，更优选具有BL21表型的大肠杆菌或其衍生物。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述二硫键为MHCII类分子的稳定提供了唯一的方式。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子能够使T细胞染色。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子进一步包括与所述肽结合结构域结合的肽。
18.一种能够在原核宿主中表达的重组MHC II类分子，其特征在于，该重组MHC II类分子包括 (i)MHCII类分子α链细胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII类分子β链细胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中⑴和(ii)通过位于所述α链的α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中。
19.一种制备重组MHC II类分子的方法，其特征在于，该方法包括 (i)MHCII类分子α链细胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII类分子β链细胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中⑴和(ii)通过位于所述α链的α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α 2和β 2结构域中， 所述方法包括在原核宿主中表达所述重组分子。
20.一种能够被T细胞识别的抗原肽表位的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤将权利要求17所述的重组MHC II类分子与T细胞受体接触，并检测所述重组MHC II类分子与所述T细胞受体的结合。
21.—种样品中抗原特异性T细胞的检测方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求17所述的重组MHC II类分子与所述样品接触，并检测所述重组MHCII类分子与所述T细胞的结合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述方法用于检测样品中的疾病特异性T细胞的存在并诊断疾病的存在或消失。
全文摘要
本发明涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。特别地，本发明提供了一种重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。在原核系统中制备这些分子的方法以及这些分子的各种用途构成了另外的方面。
文档编号C07K14/435GK102947330SQ201180011237
公开日2013年2月27日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者吉尔·艾吉·洛塞特, 泰耶·弗里格斯塔德, 英格·桑德莱, 比亚内·博根 申请人:奥斯陆大学