专利名称：抗癌融合蛋白的制作方法
抗癌融合蛋白本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白的序列片段和短的促细胞调亡肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列,包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。细胞调亡(程序性细胞死亡)是在预防癌症和治疗癌症(使用诱导异常癌细胞的细胞调亡的试剂)中具有重要作用的过程。细胞调亡的信号传导可以起源于细胞外部(外部或死亡受体途径)或起源于细胞内部(内部或线粒体途径)。人类癌细胞中的外部细胞调亡途径的激活需要配体与细胞死亡受体结合以激活受体。在配体结合之后，激活的受体诱导细胞调亡信号。通过线粒体途径的细胞内的内部细胞调亡的起始可以起始于不同水平的细胞调亡级联以最终引起促细胞调亡蛋白(细胞色素c、SmaCDiablo、AIF、p53、BC12蛋白家族，包括BH3结构域家族)的功能的诱导或恢复，核酸降解或胱天蛋白酶的激活。TRAIL蛋白属于细胞因子家族(肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体)，也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体I和2 (TRAIL-R1/R2)结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5(死亡受体4和死亡受体5)，属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。所述受体的激活可诱导独立于抑制基因P53的外部细胞调亡信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时不影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，其包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了 TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL (rhTRAIL)(在INN下称作dulanermin)的人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。近期的研究显示TRAIL蛋白可具有比氨基酸114-281更短的形式，以这种形式也能结合DR家族的膜受体(死亡受体DR1、DR2、DcRU DcR2和0PG)并通过这些受体诱导细胞调亡(F. , FANG, A. , WANG, S. , F. , YANG, Anti tumor activity of a novelrecombinant mutanthuman tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand, ActaPharmacologica Sinica2005Nov;26(11):1373 - 1381)。最近报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签相关，非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎也显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性(见例如W02007/022214)。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在不同水平的TRAIL诱导的细胞调亡途径表现其自己，从细胞表面上的受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了 TRAIL作为抗癌试剂的有用性。此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(W02009/002947; A. Almasan andA. Ashkenazi, CytokineGrowth Factor Reviewsl4(2003)337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol3，No6, 2001，535-546，Soria JC et al. , J. Clin. Oncology, Vol28, No9 (2010), p. I527-1533)。在W02009/140469中描述了 rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡钼)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见 A. I. Guo et al, ChineseJournal of Biochemistry and MolecularBiology2008, vol. 24(10)，925-930。包含血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)的Tumstatinl83_230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N. Ren et al, Academic Journal of Second MilitaryMedical University2008, vol. 28(5)，676-478。US2005/244370和对应的W02004/035794公开了 TRAIL95-281 的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。此外，与TRAIL治疗相关的问题已被证明是其低稳定性和在施用后从体内迅速被消除。虽然目前可获得很多临床癌症治疗法，但是它们通常不够有效并且具有很多熟知的缺点，其中最令人苦恼和限制治疗的缺点之一是缺乏针对癌细胞的选择性、严重的副作用和抗性——原发性的或在治疗过程中获得的。目前，仅已知有限数目的既有效又对癌细胞具有选择性的抗癌试剂。因此，对于能够扩大可用的试剂的范围并发现更有效(细胞毒性)和选择性的试剂的需求仍然是迫切的和未满足的。也需要具有增强的稳定性和改善的药代动力学的新的选择性试剂。本发明提出了解决该问题的方案提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的结构域和具有内部(细胞内)或外部(细胞外)促细胞调亡活性的短的效应子肽结构域，所述短的效应子肽结构域不包括TRAIL片段，其增强或补充TRAIL的作用。此外，在很多情况下，本发明的融合蛋白被证明显示出比可溶性TRAIL及其变体(包括序列的片段)更强的活性，在很多情况下还克服了对于TRAIL的抗性。此外，效应子肽的加入引起了延长的半衰期和蛋白在肿瘤中的延长的保留并最终增强了其功效。
现在将通过阅读附图详细描述本发明。图I显示了根据Ex. UEx. 2、Ex. 3、Ex. 4和Ex. 5的本发明的融合蛋白的示意性结构。图2 显示了根据 Ex. 6、Ex. 7、Ex. 8、Ex.结构。图
意性结构。图意性结构。图
显示了根据 Ex. 11、Ex. 12、Ex. 13、显示了根据 Ex. 16、Ex. 17、Ex. 18、
9和Ex. 10的本发明的融合蛋白的示意性Ex. 14和Ex. 15的本发明的融合蛋白的示Ex. 19和Ex. 20的本发明的融合蛋白的示的本发明的融合蛋白以及Ex. 24,Ex. 25和Ex. 30和Ex. 31的本发明的融合蛋白的示Ex. 35和Ex. 36的本发明的融合蛋白的示Ex. 40和Ex. 41的本发明的融合蛋白的示Ex. 45和Ex. 46的本发明的融合蛋白的示10显示了根据Ex. 47、Ex. 48、Ex. 49、Ex. 50和Ex. 51的本发明的融合蛋白的示11显示了根据Ex. 52、Ex. 53、Ex. 54和Ex. 55的本发明的融合蛋白的示意性结
6显示了根据 Ex. 27、Ex. 28、Ex. 29、
7显示了根据 Ex. 32、Ex. 33、Ex. 34、
9 显示了根据 Ex. 42、Ex. 43、Ex. 44、
显示了根据 Ex. 21、Ex. 22 和 Ex. 23Ex. 26的比较性融合蛋白的示意性结构。图意性结构。图意性结构。图8 显示了根据 Ex. 37、Ex. 38、Ex. 39、
意性结构。图意性结构。图意性结构。图构。图12显示了负载了结肠癌Colo205、以本发明的融合蛋白治疗的SCID/N0D小鼠中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。图13显示了负载了结肠癌Colo205、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第29天的肿瘤生长抑制值，与使用hTRAILl 14-281治疗的小鼠比较。图14显示了负载了人肺癌NCI-H460、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114_281治疗的小鼠比较。图15显示了负载了人肺癌NCI-H460、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第29天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAILl 14-281治疗的小鼠比较。图16显示了负载了人小细胞肺癌A549、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114_281治疗的小鼠比较。图17显示了负载了人小细胞肺癌A549、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第34天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAILl 14-281治疗的小鼠比较。图18显示了负载了人胰腺癌上皮样细胞系PANC-1、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114_281治疗的小鼠比较。图19显示了负载了人胰腺癌上皮样细胞系PANC-1、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第43天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAILl 14-281治疗的小鼠比较。图 20 显示了 Ex. I, Ex. 2，Ex. 14，Ex. 24，Ex. 51 和 Ex. 42 的融合蛋白以及rhTRAI114-281的圆二色性光谱，以比椭圆性(specific ellipticity)表示。发明详述本发明涉及融合蛋白，其包含结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%同源性的序列，和结构域(b)，其为促细胞凋亡效应子肽的序列，其通过内部细胞凋亡途径发挥其促细胞调亡作用，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何能够诱导细胞调亡信号的片段。本领域技术人员还将认识到TRAIL的70%的同源性的存在是本领域已知的。根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸的分子构建物。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽的结构域(b )不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分。在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，从肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列均为左侧为N末端，右侧为C末端。本发明的融合蛋白可包含效应子肽的单一结构域(b)，其连接于结构域(a)的C末端或N末端。本发明的融合蛋白也可以包含效应子肽的2个结构域(b)，在这种情况下，一个结构域(b)连接于结构域(a)的C末端,另一个连接于结构域(a)的N末端。当本发明的融合蛋白包含效应子肽的2个结构域(b)时，这些结构域可以是相同或不同的。优选地，在该情况下，结构域(b)是不同的。在具体实施方式
中，结构域(a)是hTRAIL序列的片段，始于hTRAIL114至hTRAIL121 (含端点)的氨基酸，终于氨基酸hTRAIL281，或公开于GenBank登记号P50591的hTRAIL序列的其他功能片段。特别地，结构域(a)可以选自对应于下列的序列hTRAILl 14-281 (SEQ.No. 27), hTRAILl19-281(SEQ. No. 28)和 hTRAIL121-281(SEQ. No. 29), hTRAILl16-281 和hTRAIL120-281o在另一个实施方式中，结构域(a)可以是序列hTRAIL95_281。
结构域(b)的促细胞调亡效应子肽，通过内部细胞调亡途径(细胞内地)发挥其细胞调亡活性，可通过激活细胞调亡的线粒体途径的信号传导级联成分直接诱导调亡，或通过直接诱导细胞中的线粒体细胞调亡而诱导细胞调亡。在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，效应子肽是选自下列的通过内部细胞调亡途径作用的肽SEQ. No. 30，No. 31, SEQ. No. 32，SEQ. No. 33，SEQ. No. 34，SEQ.No. 35，SEQ. No. 36，SEQ. No. 37，SEQ. No. 38，SEQ. No. 39，No. 40，SEQ. No. 41，SEQ. No. 42，SEQ.No. 43，SEQ. No. 44，SEQ. No. 45，SEQ. No. 46，和 SEQ. No47,或 SEQ. No. 151，SEQ. No. 152，SEQ.No. 153，SEQ. No. 154，SEQ. No. 155，SEQ. No. 156，SEQ. No. 157，SEQ. No. 158SEQ. No. 159，SEQ.No. 160，No. 161，SEQ. No. 162，SEQ. No. 163，SEQ. No. 164，SEQ. No. 165 和 SEQ. No. 166。上述组的SEQ. NO. 30的效应子肽是源自Bax蛋白的BH3结构域的肽，其抑制抗细胞调亡因子，具体为如下所示的16个氨基酸的肽KKLSECLKRI ⑶ELDS SEQ. No. 30。相信基于Bax蛋白的BH3结构域的序列的肽能够有效结合抗细胞调亡蛋白Bcl_2和Bcl-XL。Bcl-2和Bcl-XL蛋白的抗细胞调亡活性是基于它们与存在于负责细胞调亡的起始的因子(Bax, Bak, Bad)中的BH3结构域的相互作用。BH3结构域的结合阻止蛋白Bcl_2和Bcl-XL与它们的天然配体的相互作用，并抑制它们的活性，从而促成细胞调亡的起始。上述组的SEQ. NO. 31的效应子肽是如下所示的包含Bid蛋白的BH3结构域的15个氨基酸的肽RNIARHLAQV ⑶SMD (SEQ. No. 31)。Bid蛋白属于Bcl-2家族，其主要负责促细胞调亡因子Bax的激活。相信引入到本发明的融合蛋白中的包含Bid蛋白的BH3结构域的16个氨基酸的肽将有效诱导细胞调亡。上述组的SEQ. NO. 32的效应子肽是核糖核酸酶A (RNase A)的肽同源物，如下所示KETA AKFERQHMDS STSAASSSNY CNQMMKSRNL TKDRCKPVNT FVHESLADVQAVCSQKNVAC KNGQTNCYQS YSTMSITDCR ETGSSKYPNC AYKTTQANKHIIVACEGNPY VPVHFDASV(SEQ. No. 32).核糖核酸酶是具有潜在抗癌性质的小的蛋白，在与带负电的细胞膜结合后通过胞吞作用进入细胞，然后泄露进入细胞质，在那里它们作为酶引起RNA的降解。从IOnM的浓度开始，它们阻抑细胞周期并引起细胞调亡。上述组的SEQ. NO. 33的效应子肽是如下所示的细胞色素C分子⑶VEKGKKIFIMKCS QCHTVEKGGK HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNKGIIffGEDTLM EYLENPKKYI PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNE(SEQ. No. 33)细胞色素C从线粒体释放进入细胞质是通过所谓的线粒体途径诱导细胞调亡的主要信号之一。该蛋白是调亡体复合物的一部分，其激活胱天蛋白酶9。上述组的SEQ. NO. 34的效应子肽是粒酶(granzyme) B,如下所示IIGGHVAKPH SRPYMAYLMI WDQKSLKRCG GFLIRDDFVL TAAHCffGSSINVTLGAHNIKEQEPTQQFIP VKRAIPHPAT NPKNFSNDIM LLQLERKAKRTRAVQPLRLP SNKAQVKPGQ TCSVAGffGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQEDRKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK ⑶SGGPLVCN KVAQGIVSYG
RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRY(SEQ. No. 34).粒酶,在文献中也被称作断裂蛋白(fragmentin),是Tc淋巴细胞和NK细胞的细胞颗粒性的典型的丝氨酸蛋白酶。在人类中目前鉴定了 5种不同的粒酶A，B, H,K(tryptase)和M(metioninase)。研究已经确认这些酶是淋巴细胞针对祀细胞的细胞毒性反应的元件。已经表明这些酶激活穿孔蛋白(perforin)，穿孔蛋白是在细胞膜中产生孔并从而介导细胞毒性应答的蛋白。此外，相信这些酶直接参与靶细胞的细胞凋亡的诱导。粒酶B将选择的前胱天蛋白酶激活为它们的活性形式(例如胱天蛋白酶3)，并通过蛋白水解释放Bid蛋白(属于Bcl-2蛋白家族的蛋白)的活性形式，其通过掺入线粒体膜并在膜上产生孔而起始细胞凋亡的细胞内途径，然后释放细胞调亡诱导性因子(细胞色素C、胱天蛋白酶9、Apaf)。通过与组蛋白结合，粒酶B也可参与染色质结构的松弛，其引起它的松弛并增加核酸内切酶与DNA的靠近。上述组的SEQ. NO. 35的效应子肽是Nur77蛋白的片段，如下所示 FSRSLHSLL (SEQ. No. 35)。核受体Nur77是非常强的细胞调亡诱导子。其作用机理之一是与Bcl_2蛋白结合的能力，Bcl-2蛋白是重要的抗-细胞调亡因子。这种相互作用引起Bcl-2结构的构象变化，使其转化为细胞调亡的诱导子。上述片段是来自Nur77的序列的9个氨基酸的区域，其被鉴定为负责结合并转化Bcl-2和诱导细胞的细胞调亡(Kolluri et al, CancerCelll4:285-298，2008)。上述组的SEQ. NO. 36的效应子肽是包含Bak蛋白的BH3结构域的15个氨基酸的肽，如下所示GQVGRQLAII ⑶DIN (SEQ. No. 36)。相信掺入本发明的融合蛋白中的该短肽将有效诱导细胞调亡信号。上述组的SEQ. NO. 37的效应子肽是蛋白PUMA/BBC3的BH3结构域，如下所示EEQffAREIGA QLRRMADDLN AQYE SEQ. No. 37。PUMA/BBC3(细胞调亡/Bcl-2结合成分3的p53上调的调节子)是Bcl_2蛋白家族的成员(仅-BH3亚家族)。其通过p53依赖性和非依赖性方式介导细胞调亡。PUMA/BBC3与所有已知的促存活Bcl-2蛋白的直接相互作用引起它们的失活、线粒体功能失调并由此引起胱天蛋白酶的激活和细胞死亡。PUMA还间接影响诸如Bak和Bax的分子的促细胞调亡活性的恢复。BH3结构域负责PUMA与促存活蛋白的结合。上述组的SEQ. NO. 38的效应子肽是蛋白PUMA/BBC3，如下所示ARAR QEGSSPEPVE GLARDGPRPF PLGRLVPSAV SCGLCEPGLA AAPAAPTLLPAAYLCAPTAP PAVTAALGGS RffPGGPRSRP RGPRPDGPQPSLSLAEQHLESPVPSAPGAL AGGPTQAAPG VRGEEEQffAR EIGAQLRRMA DDLNAQYERRRQEEQQRHRR SPffRVLYNLI MGLLPLPRGH RAPEMEPN(SEQ. No. 38).相信当被掺入本发明的融合蛋白中时，蛋白PUMA/BBC3及其BH3结构域都能有效诱导细胞调亡信号。上述组的SEQ. NO. 39的效应子肽是蛋白SMAC/Diablo的8个氨基酸的片段，如下所示AVPIAQKP (SEQ. No. 39)。
SMAC/DIABLO (具有低PI的胱天蛋白酶/直接IAP结合蛋白的第二线粒体衍生的激活子)是从线粒体释放的胱天蛋白酶的激活子。其N末端基序竞争性结合IAP蛋白，阻止它们的BIR2和BIR3结构域使胱天蛋白酶失活。相信当掺入本发明的融合蛋白中时，该短肽将有效诱导细胞调亡信号。上述组的SEQ. NO. 40的效应子肽是buforin IIb肽,如下所示RAGLQFPVGR LLRRLLRRLL(SEQ. No. 40)。buforin IIb是源自组蛋白H2A的肽，其能够独立地穿透细胞膜并具有抗细菌性质(Park et al, Biochem Biophys. Res. Commun. , 244:253-257，1998)。关于其用作抗癌试剂的研究表明其能够选择性结合多种癌细胞，穿透细胞并在细胞核中累积，通过线粒体途径诱导细胞调亡(Lee et al, Cancer Letters, 271:47-55，2008)。上述组的SEQ. NO. 41的效应子肽是豹娃酶(onconase)肽,如下所示QDffLT FQKKHITNTR DVDCDNMST NLFHCKDKNTFIYSRPEPVK AICKGIIASKNVLTTSEFYL SDCNVTSRPC KYKLKKSTNK FCVTCENQAP VHFVGVGSC(SEQ. NO.41).豹娃酶或P-30是最初源自娃(Rana pipiens)卵母细胞的裂解物的蛋白。其为单链蛋白，具有12kDa的分子量，是RNase A的结构同源物。关于该蛋白的研究显示其具有针对肿瘤细胞的显著的细胞毒性活性(Y Wu，SM Mikulski，W Ardelt, SM Rybak and RJYoule, The Journal of Biological Chemistry268, 10686-10693)。关于豹娃酶的作用机理的研究显示，在内化过程之后其进入细胞，在那里进行28S和18S核糖体rRNA的降解过程，这导致蛋白合成的抑制和细胞死亡。上述组的SEQ. NO. 42的效应子肽是pl4ARF蛋白的20个氨基酸的N末端片段，其是促存活Mdm2蛋白的抑制子,如下所示VRRFLVTLRI RRACGPPRV (SEQ. No. 42)。P14ARF是调节Mdm2蛋白活性的蛋白，其结合肿瘤抑制子p53并导致其降解并因此引起转化的细胞的存活的可能性。P14ARF蛋白通过结合Mdm2而阻止其与p53的相互作用。据报道源自P14ARF的短肽足以阻断Mdm2与p53的相互作用并阻止后者的降解(Midgleyet al,0ncogenel9:2312-2323, 2000)。上述组的SEQ. NO. 43的效应子肽是结合Mdm2的11个氨基酸的肽，如下所示PRFMDTffEGL N (SEQ. No. 43)。上述肽显示出与p53的序列的序列同源性并显著有效抑制Mdm2_p53相互作用(Bott er et al，0ncogenel3:2141-2147, 1996)，从而阻止 p53 的降解。上述组的SEQ. NO. 44的效应子肽是Iunasin肽的17个氨基酸的片段，如下所示CEKHIMEKIQ GRGDDDD (SEQ. No. 44)。Lunasin是源自大豆(Glycine max)的43个氨基酸的肽,具有强抗癌潜力。该分子的一般作用机理在于抑制组蛋白的乙酰化。已知具有脱乙酰酶活性的分子也具有转录过程的共抑制剂的作用(Leong et al, Cancer Lett, 18:42-48,2007)。上述组的SEQ. NO. 45的效应子肽是Bik蛋白的BH3结构域，如下所示LALRLAC I⑶EMDVS (SEQ. No. 45)。Bik蛋白与起始存活信号的细胞和病毒因子(例如Bcl-2)相互作用，从而刺激细胞调亡。与很多其它促细胞调亡蛋白一样，其包含与Bcl-2相互作用必需的BH3结构域。包含BH3结构域的源自该蛋白的肽可通过激活其它促细胞调亡蛋白或通过抑制抗细胞调亡蛋白而起始细胞调亡(Del Gaizo Moore, V, et al, Blond, 111: 2300-2309，2008)。上述组的SEQ. NO. 46的效应子肽是合成的肽一蛋白酶体抑制剂，如下所示AGAGGGAGG AGAGGGAGGA G (SEQ. No. 46)。该肽由Gly和Ala残基的一系列重复序列组成，其是蛋白酶体抑制剂，能够通过诱导TRAIL受体DR5的过表达而加强TRAIL诱导的细胞调亡。上述组的SEQ. NO. 47的效应子肽是蛋白酶体S5a的C末端片段的结构域，如下所示MTISQQEFG RTGLPDLSSM TEEEQIAYAM QMSLQGAEFG QAESADIDAS SAMDTSEPAKEEDDYDVMQD PEFLQSVLEN LPGVDPNNEA IRNAMGSLAS QATKDGKKDK KEEDK(SEQ.No.47).来自蛋白酶体S5a片段的该结构域包含直接参与泛素结合的UIM基序并因此具有诱导细胞调亡的能力。上述组的SEQ. NO. 151的效应子肽是azurin衍生的肽。azurin是含铜的氧化还原蛋白，由致病细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)释放，对于很多癌细胞系具有高度细胞毒性。其进入细胞质并迁移至细胞核。其活性严格依赖于癌细胞中P53的活性形式的存在。已经表明azurin结合p53并翻译后地增加p53和Bax的水平。就Mdm2-p53功能相互作用的这种表观的拮抗作用表明azurin与p53的结合可能干扰Mdm2-p53结合并因此阻止p53的降解。在结合之后，其激发线粒体细胞色素C释放进入细胞质。该过程激活胱天蛋白酶(包括胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-7)级联，从而起始细胞调亡过程(Punj V, et al Oncogene. 2004Mar25; 23 (13) : 2367-78，Funari G et al. J Mol Recognit. 2010Jul Aug; 23 (4) : 343-51)。关于源自 azurin 序列的肽的活性的详细分析揭示了负责有效的细胞穿透并激发细胞调亡的28个氨基酸的区域(Yamada i wsp. , Cell Microbiol, 7:1418 - 1431，2005)。上述组的SEQ. NO. 152的效应子肽是全长的azurin肽。上述组的SEQ. NO. 153的效应子肽是从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计而来的肽。在EP1309680中报告了 aPP蛋白和重新设计的促细胞调亡Bak蛋白的嵌合物是人Bcl-2和Bcl-X的高度强烈的和特异性的配体(另见Chin Jff, Schepartz A. Design andevolution of a miniature Bcl-2 binding protein Angew Chem Int Ed Engl. 20010ct15;40(20):3806-3809)。上述组的SEQ. NO. 154的效应子肽是从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计而来的另一种肽。上述组的SEQ. NO. 155的效应子肽是Reticulon RTNl-C衍生的肽。RTNl-C蛋白是位于ER并表达于神经系统的膜蛋白，其生物学作用尚未完全知晓。RTNl-C的C末端区域，对应于残基186-208的片段，能够结合核酸并与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)相互作用，降低它们的活性。上述组的SEQ. NO. 156的效应子肽是全长人Reticulon3(同种型a)。Reticulon(RTN)构成一组整合膜蛋白，其与其它已知的细胞调亡相关结构域不具有同源性。RetiCulon3同种型a在肿瘤细胞系中过表达，使它们对于TRAIL介导的细胞调亡变得敏感。上述组的SEQ. NO. 157的效应子肽是是修饰的组成型活性的胱天蛋白酶_3 (单链)(Srinivasula SM, Ahmad M,MacFarlane M, Luo Z,Huang Z, Fernandes-AlnemriTj Alnemri ES. Generation of constitutively active recombinant caspases-3and_6byrearrangement of their subunits. J Biol Chem. 1998Apr24;273(17):10107-11)。上述组的SEQ. NO. 158的效应子肽是来自Par_4蛋白(前列腺细胞调亡应答蛋白par-4)的SAC结构域。Par-4是具有促细胞调亡功能的肿瘤抑制子蛋白。Par_4的癌症特异性促细胞调亡作用在于位于其中心的SAC结构域。该分子的功能通过两种不同方式实现细胞死亡机构的分子成分的激活(Fas和FasL向质膜的转位)和促存活因子的抑制(NF-κ B途径)(Zhao Y, Rangnekar VM. Apoptosis and tumor resistance conferred by Par~4. CancerBiol Ther.2008Dec;7 (12):1867-74. Epub 2008 Dec 8. Review) 上述组的SEQ. NO. 159的效应子肽是Noxa蛋白。Noxa编码Be I _2蛋白家族的Be I _2仅同源物3 (BH3)成员；该成员包含BH3区域但不含其它BH结构域。Noxa是p53依赖性细胞凋亡的介导子并经历BH3基序依赖性的向线粒体的定位，并与抗细胞凋亡Bcl-2家族成员相互作用，引起胱天蛋白酶-9的激活。上述组的SEQ. NO. 160的效应子肽是线粒体定位必需的Noxa蛋白的IOAA (KLLNLISKLF)片段(MTD-线粒体靶向结构域或CKP —细胞杀伤肽)。其被描述于 W02006/001582 和 Young-Woo Seo et al. The Journal of Biological ChemistryVol. 278, No. 48, Issue of November 28，pp.48292 - 48299，2003。上述组的SEQ. NO. 161的效应子肽是短的杂合肽Antp-TPR，其被描述于W02010055929。Antp-TPR是靶向Hsp90的工程化的杂合肽，由于抑制了 Hsp90与Hop的TPR2A结构域的相互作用而具有针对癌细胞的选择性细胞毒性活性。上述组的SEQ. NO. 162的效应子肽是Stat3蛋白的SH2结构域的肽抑制剂。Stat蛋白的SH2结构域负责一系列导致促进细胞生长和分化的事件，其是通过响应于生长因子和细胞因子的正常STAT信号传导。上述组的SEQ.N0. 163的效应子肽是源自Bak蛋白(Bcl_2家族)的BH3结构域的妝 GQVGRQLAIIGDDINR(Castelli M, Reiners JJ, Kessel D. A mechanism for theproapoptotic activity of ursodeoxycholic acid:effects on Bcl_2 conformation.Cell Death Differ. 2004Aug; 11 (8) :906-14) Bak 蛋白是 Bcl_2 家族的促细胞凋亡成员，其参与细胞凋亡的起始。上述组的SEQ. NO. 164的效应子肽是源自Bad蛋白(Bcl_2家族)的BH3结构域的肽 KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL(Wang JL, Zhang ZJ, Choksi S，Shan S，LuZ,Croce CM,Alnemri ES,Korngold R,Huang Z.CelI permeable Bcl_2bindingpeptides:a chemical approach to apoptosis induction in tumor cells. CancerRes.2000Marl5;60(6):1498-502)。上述组的SEQ. NO. 165的效应子肽是来自Bfll蛋白的肽ATAP。
ATAP (两性的尾部锚定肽)(双功能的Bcl2家族蛋白Bfll的残基147-175)特异性靶向线粒体并诱导胱天蛋白酶依赖性的不需要Bax或Bak的细胞凋亡。上述组的SEQ. NO. 166的效应子肽是来自Bfll蛋白的另一个ATAP肽。ATAP蛋白融合于来自 HCCSl 的 MTS 结构域(Ko JK, Choi KH, Pan Z, Lin P, Weisleder N, Kim Cff, MaJ. The tail-anchoring domain of Bfll and HCCSl targets mitochondrial membranepermeability to induce apoptosis. J Cell Sci.2007 Aug 15;120(Pt 16):2912-23.Epub 2007Jul 31)。如上文所描述，结构域(b)的促细胞凋亡效应子肽的第一变体可以是通过内部细胞凋亡途径(细胞内的)发挥其细胞凋亡活性的肽，其通过激活细胞凋亡的线粒体途径的信号传导级联成分而直接诱导细胞凋亡，或通过直接诱导细胞中的线粒体细胞凋亡。在第一变体的一个实施方式中，通过内部途径发挥其活性的结构域(b)的一组促细胞凋亡效应子肽可以是在结合后抑制和/或调节细胞内抗细胞凋亡或促存活因子例如抗细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的肽。上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其存在于实施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 37所示的肽，其存在于实施例11和47的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中；SEQ. NO. 158所示的肽，其存在于实施例42和43的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中。在所述第一变体的另一个实施方式中，通过内部途径发挥其活性的结构域(b)的一组促细胞凋亡效应子肽可以是在细胞内发挥其直接破坏效应以阻抑细胞周期的肽。所述的在线粒体内部途径中在细胞内的直接破坏效应可以通过效应子肽在不同水平的胱天蛋白酶级联上起始，导致细胞死亡。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的实例有核酸的降解，特别是完整细胞RNA或DNA的降解，和降解性核酸酶的诱导。此类效应可通过例如核糖核酸酶来进行，例如胰腺RNAse A超家族的核糖核酸酶，包括人胰腺RNAse，人血管生长素(核糖核酸酶5，hAng)，人嗜曙红细胞衍生的神经毒素(EDN)和牛核糖核酸酶，以及它们的同源物和变体。RNAse同源物的实例有豹娃酶(onconase),分离自Rana catesbiana和Ranajaponica的核糖核酸酶。上述通过降解核酸发挥作用的示例性效应子肽是SEQ. NO. 32所示的肽，其存在于实施例3、4和27的融合蛋白中；SEQ. NO. 41所示的肽，其存在于实施例16、17和46的融合蛋白中；SEQ. NO. 157所示的肽，其存在于实施例41的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是胱天蛋白酶激活。此类效应可通过下列来实现例如细胞色素c (SEQ. NO. 33)，其存在于实施例5和6的融合蛋白中；粒酶B(SEQ. NO. 34)，其存在于实施例7和8的融合蛋白中，或源自蛋白Smac/DIABLO的肽(SEQ. NO. 39)，其存在于实施例14、21、33、34和35的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是蛋白酶体抑制，由于促细胞凋亡蛋白的稳定化对于P53功能恢复的影响。通过蛋白酶体抑制而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 46所示的肽，其掺入实施例22的融合蛋白中；SEQ. NO. 47所示的肽，其掺入实施例23的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是由于促细胞凋亡蛋白的表达对于P53功能恢复的影响的增强而调节组蛋白。通过调节组蛋白而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是buforin IIb肽,如SEQ. NO. 40所示，其掺入实施例15的融合蛋白；SEQ. NO. 44所示的lunasin，其掺入实施例20的融合蛋白。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是p-53功能的恢复，例如通过抑制其降解。抑制p-53降解可通过抑制p-53的负调节子例如鼠双微体2 (MDM2)以破坏其负调节来实现。这可以通过MDM2结合性肽来实现，其与MDM2竞争向p_53的结合，所述结合性肽是例如Azurin,其是含铜的氧化还原蛋白；细胞周期调节子pl4ARF,或SuperTIP (ThioredoxinInsert蛋白，细菌硫氧还蛋白的活性位点环内的mdm_2结合肽),或它们的片段。通过恢复p-53的功能而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 42所示的肽，其掺入实施例18的融合蛋白中；SEQ. NO. 43的肽，其掺入实施例19的融合蛋白中；SEQ. NO. 151的肽，其存在于实施例29、30和31的融合蛋白中；SEQ. NO. 152的肽，其掺入实施例32的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是影响即激活、抑制或调节 Bcl-2 蛋白家族，例如蛋白 Bax, Bak, Bok, Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma,Bik, BNIP3 和 Spike,更具体是仅 BH3 蛋白家族，包括 Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma,Bik, BNIP3和Spike。特别地，Bcl-2家族成员的BH3结构域的片段将是优选的效应子肽。其它组的效应子肽是细胞核受体RXR(类维生素a X受体)家族的片段，例如细胞核受体Nur770通过影响Bcl-2蛋白家族而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其掺入实施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其存在于实施例2、4和8的融合蛋白中；SEQ. NO. 32所示的肽，其掺入实施例3的融合蛋白中；SEQ. NO. 35所示的肽，其掺入实施例9的融合蛋白中；SEQ. NO. 36所示的肽，其掺入实施例10的融合蛋白中；SEQ.NO. 37所示的肽，其存在于实施例11和47的融合蛋白中；SEQ. NO. 38所示的肽，其存在于实施例12和13的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中；SEQ.NO. 160所示的肽，其掺入实施例45的融合蛋白中；SEQ. NO. 163所示的肽，其掺入实施例51的融合蛋白中；SEQ. NO. 164所示的肽，其存在于实施例52和53的融合蛋白中；SEQ. NO. 165所示的肽，其掺入实施例54的融合蛋白中；SEQ. NO. 166所示的肽，其掺入实施例55的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是会聚TRAIL与TRAIL受体结合特别是通过胱天蛋白酶激活而诱导的细胞凋亡信号。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是促进凋亡体的形成。通过促进凋亡体的形成而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其掺入实施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其掺入实施例2的融合蛋白中；SEQ. NO. 33所示的肽，其掺入实施例5和6的融合蛋白中；SEQ. NO. 35所示的肽，其掺入实施例9的融合蛋白中；SEQ. NO. 36所示的肽，其掺入实施例10的融合蛋白中；SEQ. NO. 37所示的肽，其掺入实施例47的融合蛋白中；SEQ. NO. 39所示的肽，其存在于实施例33、34和35的融合蛋白中；SEQ. NO. 40所示的肽，其掺入实施例14的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中；SEQ. NO. 153所示的肽，其存在于实施例36和37的融合蛋白中；SEQ. NO. 154所示的肽，其掺入实施例38的融合蛋白中；SEQ. NO. 157所示的肽，其掺入实施例41的融合蛋白中；SEQ. NO. 158所示的肽，其存在于实施例42和43的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中；SEQ. NO. 160所示的肽，其掺入实施例45的融合蛋白中；SEQ. NO. 163所示的肽，其掺入实施例51的融合蛋白中；SEQ.NO. 164所示的肽，其存在于实施例52和53的融合蛋白中。所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是促进线粒体外膜(MOMP)渗透，由此，线粒体释放的蛋白能够在胱天蛋白酶激活水平上发挥作用。通过促进MOMP渗透而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其掺入实施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其掺入实施例2和48的融合蛋白中；SEQ. NO. 33所示的肽，其掺入实施例5和6的融合蛋白中；SEQ. NO. 39所示的肽，其存在于实施例14、33、34和35的融合蛋白中；SEQ. NO. 40所示的肽，其掺入实施例15的融合蛋白中；SEQ. NO. 41所示的肽，其掺入实施例46的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中。如上文所描述，本发明的结构域(b)的促细胞凋亡效应子肽的第二变体是通过外部途径(细胞外地)发挥作用的促细胞凋亡效应子肽的组，它们的效应需要结合存在于癌细胞表面上的受体。下列TNF-配体(TNF—肿瘤坏死因子)或TNF-类似物作为在细胞外作用的肽，用作比较性效应子肽-VANPQAEGQL 十肽(SEQ. No. 48)；-LANGVE 六肽(SEQ. No. 49)，或-七肽CPSEGLC (SEQ. No. 50)。SEQ. NO. 48所示的十肽在JP60，226，816中被描述为TNF的类似物/激动剂。SEQ. NO. 49所示的六肽源自TNF，在DE3，841，768中已被描述。SEQ. NO. 50所示的七肽是在C末端和N末端侧接2个半胱氨酸残基的5个氨基酸的肽，其是源自TNF细胞因子与其细胞受体TNFR55和TNFR75的相互作用的表面的TNF细胞因子的一部分。半胱氨酸残基通过形成氨基酸之间的硫桥而使肽环稳定。环化的目的是使肽稳定并改善其活性。与癌细胞表面上存在的TRAIL受体结合之后，融合蛋白将发挥双重效应。结构域(a), TRAIL的功能性片段，将发挥其已知的激动活性，即，与细胞表面上的死亡受体结合并激活细胞凋亡的外部途径。在包含细胞内发挥作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白通过胞吞内化之后，结构域(b)将能够潜在地在细胞内发挥其作用，与TRAIL结构域的活性平行。通过这种方式，TRAIL的抗癌活性可通过细胞凋亡的其它元件和机制的激活得以加强。掺入了在细胞外发挥作用的促细胞凋亡肽的比较性融合蛋白应该潜在地另外地起始细胞凋亡途径，其是通过结合并激活除了 TRAIL受体以外的促细胞凋亡受体。在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的结构域(a)和(b)可彼此直接连接。在另一实施方式中，结构域(a)和结构域(b)通过结构域(C)连接,结构域(C)包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的切割位点序列。
蛋白酶切割位点可以选自 被金属蛋白酶MMP识别的序列，特别是序列PLGLAG (SEQ. No. 51), PLGIAGE (SEQ.No.171)或 PLGLAGQ(SEQ. No. 173)；被尿激酶uPA识别的序列，特别是RVVR序列(SEQ. No. 52);和被弗林蛋白酶识别的序列，特别是序列RKKR(SEQ. No. 53)或序列RKKRVKR(SEQ.No. 172)；以及它们的组合。特别地，蛋白酶切割位点是被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合，以任何顺序彼此相邻。在一个实施方式中，结构域(c)是MMP/uPA SEQ. NO. 51/SEQ. NO. 52的组合，即序列PLGLAGRVVR,或 uPA/MMP SEQ. No52/SEQ. No. 51 的组合，即序列 RWRPLGLAG。蛋白酶金属蛋白酶、尿激酶和/或弗林蛋白酶在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在使得构建体在内化之后能够使结构域(a)从结构域(b)切割下来，即释放功能性结构域(b)并由此实现其激活。蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，由此增加了融合蛋白被存在于细胞中的蛋白酶随机降解之前肽向其作用位点转运的机会。另外，可以向本发明的融合蛋白的效应子肽的结构域(b)上添加转运结构域(d)，其选自(dl)靶向内质网的序列；(d2)穿过细胞膜转运的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9个Arg残基；(d3)铜绿假单胞菌的转位结构域(SEQ. NO. 54)；(d4)膜转运结构域；(d5)细胞核定位结构域；和(d6)线粒体靶向结构域；及其组合。结构域(dl)、(d2)和(d3)的组合可具体包含下列组合(dl)/(d2)，(dl)/(d3)或(dl)/(d2)/(d3)。结构域(dl)，(d2)，(d3)，(d4)和(d5)的组合可具体包含下列组合(dl) /(d2), (dl)/(d3), (dl)/(d4), (dl)/(d5)和(dl)/(d2)/(d3), (d3)/(d5), (d2)/(d5), (dl)/(d3)/(d5), (d2)/(d3)/(d6)。此外，结构域(dl)，(d2)，(d3)，(d4)和(d5)的组合可包括彼此相邻并连接至结构域(b)的一个末端的结构域；和/或连接至结构域(b)的不同末端的结构域。应该理解,在融合蛋白既具有连接至结构域(b)的转运结构域(d)又具有结构域(a)与(b)之间的切割位点结构域(C)的情况下，结构域(C)的位置是在构建体被切割之后，转运结构域(d)仍然与结构域(b)相连。换言之，如果融合蛋白包含转运结构域(d)和切割位点结构域(c)，则结构域(d)位于结构域(b)与结构域(c)之间，或位于结构域(b)的与连接了结构域(d)的位置相对的末端。本发明不包含这样的变体，其中结构域(d)位于结构域(c)与结构域(a)之间，即，当构建体被切割之后，转运结构域仍然与TRAIL结构域相连。
转运序列可以连接于结构域(b)的N末端或C末端。在一些实施方式中，转运序列也可以是整个构建体的末端部分，例如C末端或N末端部分，这取决于结构域(a)和(b)的连接方式。铜绿假单胞菌的转位结构域能够通过溶酶体膜转位至细胞质，并且可用于将效应子肽导入肿瘤细胞腔室。铜绿既假单胞菌的转位结构域是熟知的，如下所示PEGGSLA ALTAHQACHL PLETFTRHRQ PRGffEQLEQC GYPVQRLVAL YLAARLSffNQVDQVIANALA SPGSGGDLGE AIRESPEQAR LALTLAAAES ERFVRQGTGNDEAGAANGPA D (SEQ. No. 54)靶向内质网的序列(dl)可以是本领域已知的靶向内质网的任何信号序列，例如但不限于 KDEL, HDEL, RDEL, DDEL, ADEL, SDEL, KEDL0 序列(dl)优选选自序列 KDEL(SEQ. No. 55)和 KEDL (SEQ. No. 56)。优选地，靶向序列(dl)位于本发明的融合蛋白的C末端并构成其C末端部分。膜转运结构域(d4)可以是本领域已知的通过质膜转运的任何信号序列，例如但不限于 KPRRPY 或 K PRRPYR。细胞核定位序列(d5 )可以是本领域已知的靶向细胞核的任何信号序列，例如但不限于 EEEAAGRKRKKRT (SEQ. No. 168)，FFFAAGRKRKKRT, NNNAAGRKRKKRT, YYYAAGRKRKKRT, AAKKK或 GR KRKKRT。线粒体靶向结构域(d6)可以是本领域已知的靶向线粒体的任何信号序列，例如但不限于RVSFCRPGWSAMARSRLTATSVSQVQENGFVK(SEQ. No. 166)，人细胞色素氧化酶亚基IV (hCOXIVl)的片段MLATRVFSLVGKRAISTSVCVR，或鸟氨酸转氨甲酰酶先导肽。除了融合蛋白的主要功能元件转运结构域和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含结构域(e)，即促进三聚体稳定性的多聚半胱氨酸基序，例如但不限于CkkCkkkC 序列(SEQ. No. 177)或 CAAECAAAC (SEQ. No. 178)。此外，多聚半胱氨酸结构域(e)可连接于结构域(b)的一个末端和/或连接于结构域(b)的不同末端。应该理解，在融合蛋白既具有连接于结构域(b)的多聚半胱氨酸结构域(e)又具有结构域(a)与(b)之间的切割位点结构域(C)的情况下，结构域(C)的位置是在构建体被切割之后，多聚半胱氨酸结构域(e)仍然与结构域(a)相连。换言之，如果融合蛋白包含多聚半胱氨酸结构域(e)和切割位点结构域(C)，则结构域(e)位于结构域(a)与结构域(C)之间，或位于结构域(a)的与连接了结构域(d)的位置相对的末端。本发明不包含这样的变体，其中结构域(e)位于结构域(C)与结构域(b)之间，S卩，当构建体被切割之后，多聚半胱氨酸结构域仍然与效应子肽结构域相连。除了融合蛋白的主要功能元件转运结构域和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间连接子(间隔子)的序列，其包含丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸和丝氨酸残基。此类连接子/间隔子是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了使得通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白的正确折叠。特别地，柔性空间连接子可以选自GGSG(SEQ. No. 57)，GGGS(SEQ.No. 58)，GGGGS (SEQ. No. 59)，GGSGG (SEQ. No. 60)，GGGSGG (SEQ. No. 61), GGGSGGG (SEQ.No. 62)，GGGSGGGS (SEQ. No. 63)，GGGSGGGGS (SEQ. No. 64)，ASGG (SEQ. No. 65)，GGGSASGG (SEQ.No. 66)SGCGS(SEQ. No. 169)，GGGGSGGGG(SEQ. No. 180)，GGSHG(SEQ. No. 182)，SGGCGGS(SEQ.No. 183)和 AACAA (SEQ. No. 184)。在一个实施方式中，结构域(a)和结构域(b)之间另外还有(f)适合将本发明的融合蛋白与PEG分子连接的结构域(PEG连接子)。此类连接子可以是已知的序列AlaSerGlyCysGlyProGlu (以单字符表示是ASGCGPE),在序列表中表示为SEQ. NO. 170。PEG连接子也可以选自AlaAlaCysAlaAla(AACAA)，SerGlyGlyCysGlyGlySer (SGGCGGS)和(SGCGS)，在序列表中分别表示为 SEQ.No. 178，SEQ. No. 177 和 SEQ. No. 179。在另一实施方式中，结构域(a) (b) (c) (d) (e)和(f)另外可被至多3个氨基酸残基间隔开，所述氨基酸残基特别地选自甘氨酸和谷氨酰胺。此外，在一些实施方式中，融合蛋白可包含hTRAIL的非功能性片段，作为整个构建体的C末端部分，例如序列hTRAIL95-121，其位于允许其从构建体上被切割下来的序列、有利地是蛋白酶切割位点、优选地凝血酶识别的序列之后。此类小的hTRAIL非功能片段的掺入赋予了整个构建体更大的亲水性，因此允许在表达过程中改善蛋白的溶解性。在纯化步骤之后，hTRAIL95-121将被凝血酶切割。在这样的情况下，hTRAIL95_121将不会存在于用于制备药物组合物的融合蛋白中。本领域已知的被凝血酶识别的任何序列都可使用，特别是序列LVPRGS (SEQ.No. 174)。在亲脂性效应子肽的情况下并且当结构域(a)起始于全TRAIL的114位氨基酸或更高位的氨基酸时，此类另外的hTRAIL95-121序列是特别优选的。本发明的融合的蛋白的具体实例是包含在细胞内作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白，选自SEQ. No. I, SEQ. No. 2，SEQ. No. 3，SEQ. No. 4，SEQ.，No. 5，SEQ. No. 6，SEQ. No. 7，SEQ.No. 8，SEQ. No. 9，SEQ. No. 10，SEQ. No. 11，SEQ. No. 12，SEQ. No. 13，SEQ. No. 14，SEQ.No. 15，SEQ. No. 16，SEQ. No. 17，SEQ. No. 18，SEQ. No. 19，SEQ. No. 20，SEQ. No. 21，SEQ.No. 22，SEQ. No23, SEQ. No. 93，SEQ. No. 94，SEQ. No. 95，SEQ. No. 96，SEQ.，No. 97，SEQ.No. 98，SEQ. No. 99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ. No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ.No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ. No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. Ill, SEQ.No. 112，SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. Nol 15，SEQ. No. 116，SEQ. No. 117，SEQ. No. 118，SEQ.No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。本发明的融合蛋白的其它具体实施方式
是包含在细胞外作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白，选自SEQ. No. 24，SEQ. No. 25 和 SEQ. No. 26。上述代表性融合蛋白的详细描述显示于图1-5和9-13，以及如下文的实施例所描述。根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学连接子。融合的蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建
19体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中Bodanszky 和 Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, PierceChemical Company。融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段(结构域)，然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起。此类技术是常规的和本领域已知的。为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。本发明的另一个方面是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著Goeddel, Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego,CA(1990)和A.Staron et al. , Advances Mikrobiol. , 2008, 47, 2, 1983-1995。作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得。本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号的、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞(在体内)中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。此外，表达载体可包含信号序列，将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。连接于靶蛋白的序列的辅助元件可能阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影响。可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系(昆虫、哺乳动物、植物)。优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列SEQ. No. 67，SEQ. No. 68，SEQ. No. 69，SEQ. No. 70，SEQ. No. 71，SEQ. No. 72，SEQ.No. 73，SEQ. No. 74，SEQ. No. 75，SEQ. No. 76，SEQ. No. 77，SEQ. No. 78，SEQ. No. 79，SEQ.No. 80，SEQ. No. 81，SEQ. No. 82，SEQ. No. 83，SEQ. No. 84，SEQ. No. 85，SEQ. No. 86，SEQ.No. 87，SEQ. No. 88)，SEQ. No. 89，SEQ. No. 90，SEQ. No. 91，SEQ. No. 92，SEQ. No. 122，SEQ.No. 123，SEQ. No. 124，SEQ. No. 125，SEQ. No. 126，SEQ. No. 127，SEQ. No. 128，SEQ. No. 129，SEQ.No. 130, SEQ. No. 131，SEQ. No. 132，SEQ. No. 133，SEQ. No. 134，SEQ. No. 135，SEQ.No. 136，SEQ. No. 137，SEQ. No. 138，SEQ. No. 139，SEQ. No. 140，SEQ. No. 141，SEQ. No. 142，SEQ.No. 143)，SEQ. No. 144，SEQ. No. 145，SEQ. No. 146，SEQ. No. 147; SEQ. No. 148，SEQ. No. 149，和SEQ. No. 150 ；其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白SEQ. No. I, SEQ. No. 2，SEQ. No. 3，SEQ. No. 4，SEQ. No. 5，SEQ. No. 6，SEQ. No. 7，SEQ.No. 8，SEQ. No. 9，SEQ. No. 10，SEQ. No. 11，SEQ. No. 12，SEQ. No. 13，SEQ. No. 14，SEQ.No. 15，SEQ. No. 16，SEQ. No. 17，SEQ. No. 18，SEQ. No. 19，SEQ. No. 20，SEQ. No. 21，SEQ.No. 22)，SEQ. No. 23，SEQ. No. 24，SEQ. No. 25，SEQ. No. 26，SEQ No. 93，SEQ. No. 94，SEQ.No. 95，SEQ. No. 96，SEQ. No. 97，SEQ. No. 98，SEQ. No. 99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ.No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ. No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ.No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. 111，SEQ. No. 112，SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. No. 115，SEQ.No. 116，SEQ. No. 117 和 SEQ. No. 118，SEQ. No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体，其包含上述选自SEQ. NO. 67至SEQ. NO. 92和SEQ. NO. 122至SEQ. NO. 150的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4° C)处理，然后进行热击(37-42° C)或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定。在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著Remington’s PharmaceuticalSciences,ed. 20，2000，Mack Publishing Company, Easton, USA。术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)等渗剂。本发明的药学上可接受的载体可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的PH和与体液等渗(如果必要)，并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体乙二醇，脂质例如甘油三酯,植物油,脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组合。
或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5. 5至大约6. 5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼钼金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约O. 01wt%的活性成分。更具体地，组合物可包含1%至75%重量的活性成分,或例如25%至60%重量,但不限于这些数值。施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。组合物可例如以下列剂量施用大约I μ g/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重,或5mg/kg体重至500mg/kg体重。融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。用于过表达融合蛋白的一般性程序质粒的制备靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel (在引导链的5’末端)和Xhol(在引导链的3’末端)的切割位点添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端具有多聚组氨酸标签(6个组氨酸)，其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5，-TAATACGACTCACTATAGG-3’)和 T7 终止子的序列(5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)。
得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，其根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50 μ g/ml, 1%葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了 50 μ g/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。融合蛋白的过表达和纯化一一般程序A以过夜培养物接种含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸锌的LB培养基。将培养物在37°C温育直至600nm下的光密度(OD)达到O. 60-0. 80。然后加入IPTG至终浓度为O. 25-lmM。在25°C摇动温育后(3. 5_20h)，将培养物在6，OOOg离心25分钟。将细菌沉淀物重悬于含有50mM KH2PO4, O. 5M NaCl，IOmM咪唑，pH7. 4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40%振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20，000g、4°C离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡预处理Ni-S印harose树脂(GE Healthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4°C过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4, O. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 4洗涤。使用含有O. 5M NaCl pH7. 4的50mM KH2PO4缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并以50mM Tris缓冲液，ρΗ7· 2，150mM NaCl, 500mM L-精氨酸，O. ImM ZnSO4, O. 01%Tween20 在 4°C过夜透析，同时，以凝血酶切割Histag (1:50)。切割之后，使用Benzamidine Sepharose 树脂从革巴融合蛋白分离凝血酶。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatis et al, MolecularCloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982)。融合蛋白的过表汰和纯化一一般稈序B以过夜培养物接种含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸锌的LB培养基。将培养物在37°C温育直至600nm下的光密度(OD)达到0. 60-0. 80。然后加入IPTG至终浓度为0. 5-lmM。在25°C摇动温育20h后，将培养物在6，OOOg离心25分钟。将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mMKH2P04，0. 5M NaCl, IOmM咪唑，5mM β -巯基乙醇，0. 5mM PMSF (苯基甲基磺酰氟)，pH7. 8的缓冲液中破碎。通过在8，OOOg离心50分钟使得到的提取物澄清。使用获得的上清液过夜温育Ni-S^harose树脂。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4, 0. 5M NaCl, IOmM咪唑，5πιΜβ -巯基乙醇，0. 5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)，pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有 50mM KH2PO4, 0. 5M NaCl, 500mM 咪唑，10% 甘油，0. 5mM PMSF, pH7. 5 的缓冲液洗涤柱。通过 SDS-PAGE 分析获得的级份(Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold SpringHarbor, NY, 1982)。将含有靶蛋白的级份组合并以凝血酶切割(lU/4mg蛋白，16°C，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份以配制缓冲液(500mM L-精氨酸，50mM Tris, 2, 5mMZnSO4, pH7. 4)透析。使用2-D电泳表征融合蛋白为了进一步表征获得的蛋白并精确选择色谱条件，测定了蛋白质的等电点。为此，使用了 2维电泳(2-D)方法，根据下列程序以2步进行。步骤I :在pH梯度和变性条件下进行蛋白的等电聚焦通过与含有10%三氯乙酸和0. 07% β -巯基乙醇/丙酮的沉淀溶液按照I: I的比例混合而沉淀浓度为l_2mg/ml的蛋白制剂。将混合物在_20°C温育30分钟，然后在15，OOOg,4°C离心25分钟。除去上清液并以冷的丙酮(含有0.07%β-巯基乙醇)洗涤沉淀物两次。然后蒸发残余的丙酮直至无可检测的气味。将蛋白沉淀物悬于250ml的复水缓冲液SM尿素，1%CHAPS, 15mM DTT, O. 5% 两性电解质(GE Healthcare)，pH 为 pH3_l I 或 6-11，取决于后续使用的条带。将蛋白溶液置于陶瓷室中进行等电聚焦，然后置于具有合适的PH值(3-11或6-11)的13cm DryStrip (GE Healthcare)中。使用矿物油层覆盖全部。将室置于EttanIPGphor III装置中，根据下列程序(根据条带的尺寸和pH值分配)进行等电聚焦。在20°C脱水16小时。在固定的pH梯度在电场中聚焦
时间电压I小时500VI小时梯度 500 - 1000V2小时30分钟梯度 1000 - 8000V30分钟8000V然后，将含有聚焦的蛋白的条带在去离子水中洗涤I分钟，以考马斯亮蓝染色，然后脱色并存档为图像以标记蛋白的位置。以下列成分的缓冲液平衡脱色的条带2次各15分钟50mM Tris-HCl ρΗ8· 8，6Μ 尿素，1%DTT, 2%SDS, 30% 甘油。步骤2 :通过SDS-PAGE在第二维上分离将条带置于含有单一的孔/大小标准物中的12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶上，然后在200V的电压下进行SDS-PAGE3小时以进行分离。以考马斯亮蓝染色凝胶，然后使用适当的比例保存。通过基于大小标准物测定蛋白的分子量来鉴定蛋白，基于生产商(GEHealthcare)提供的曲线以6_11的标度(pH与从标记为阳极的末端条带的长度的％之比)，或基于通过等电聚焦校正试剂盒(GE Healthcare)通过实验测定的曲线以3_11的标度读取其IPI。以下描述本发明的融合蛋白的代表性实例。实施例I :SEQ. NO. I的融合蛋白SEQ. No. I的蛋白是具有194个氨基酸的长度和22. 7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自Bax蛋白的BH3结构域的16个氨基酸的肽(SEQ. NO. 30)作为效应子肽。在效应子肽的16个氨基酸的序列的C末端连接了 7个Arg/R残基的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列辅助穿透细胞膜和将融合蛋白转运进入细胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL结构域之间掺入了彼此相邻的被尿激酶uPA识别的序列(SEQ.NO. 52)和被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ. NO. 51)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ. NO. I和SEQ. NO. 67，如下所示
25
氨基酸序列SE0 · NO · I
IKKLSECLKRI⑶ELDSRRRRRRRRVVRPLGLAGRVAAHITGTRGRSNTLS
51SPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQ
101TYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEY
151GLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
DNA 序列:SEQ · NO ·67
1 GCCCACCAGA MTGCACCAA AMAGCTGGC TTCATGATCC ATATCMTCAGATGWCATT GGTCACGCTC ACAMMTGC GATCATTTTC TTTCAGTTCA101 MMTGCCAC CCTGATAAAT GCTATACAGG CCATATTCTG CATCTTTGCTCCAACAGCTA TTACGTGCGC TTTTCATCAG CAGAATCGGA TCCGGATAGC201 TGGTATAJTT ATAMTGTAC TGCACCATTT GTTTATCATT TTTGGTAWTTCTTTAATTT CTTCCTGMA GCGMMTAG GTCTGGCTAT ΑΑΑΤΑΤΜΤΛ301 MAGCCTTTT TCATGMTCA CCAGTTCACC ATTACGCAGA TGCAGATTGCTCAGMAGCT ATGACCGCTA CGGCTGCTTT CCCAGCTATT AATTTTGCGA401 CCCAGGGCTT TTTCATTTTT GCTATTCGGG CTGCTCAGGG TATTGCTACGACCACGGGTG CCGGTAATAT GTGCTGCAAC ACGACCTGCC AGACCCAGCfi501 GACGMCAAC ACGACGACGG CGACGACGAC GACGGCTATC CAGTTCATCACCAATACGTT TCAGGCATTC GCTCAGTTTT TT上述结构的氨基酸序列用作模板以产生其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和Tuner (DE3)pLysS (二者都来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。实施例2 SEQ. NO. 2的融合蛋白SEQ. No. 2的融合蛋白是具有193个氨基酸的长度和22. 5kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的N末端连接了源自Bid蛋白的16个氨基酸的肽(SEQ. NO. 31)作为效应子肽。另外，在效应子肽的C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列辅助穿透细胞膜和将融合蛋白转运进入细胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL序列之间掺入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ.N0. 51)和被尿激酶uPA识别的序列(SEQ. NO. 52)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ. NO. 2和SEQ. NO. 68，如下所示
氣基酸序列SEQ. NO. 2
I RNIARHLAQV ⑶SMDRRRRR RRRVVRPLGL AGRVAAHITG TRGRSNTLSS51 PNSKNEKALG RKINSffESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT101 YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQYIYKYTSYPD PILLMKSARN SCffSKDAEYG151 LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVGDNA 序列SEQ. NO. 68
2权利要求
1.融合蛋白，其包含结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%同源性的序列；和结构域(b)，其为促细胞凋亡效应子肽的序列，其通过内部细胞凋亡途径发挥其促细胞调亡作用，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。
2.权利要求I的融合蛋白，其中结构域(a)是可溶性hTRAIL蛋白序列的片段，该片段始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，终于氨基酸hTRAIL281。
3.权利要求I或2的融合蛋白，其中结构域(a)选自hTRAIL114-281(SEQ. No.27)， hTRAIL119-281 (SEQ. No. 28)，hTRAIL121_281 (SEQ. No. 29)， hTRAILl16-281和hTRAIL120-281o
4.权利要求I的融合蛋白，其中结构域(a)是序列hTRAIL95-281。
5.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中结构域(b)选自SEQ.NO.30的Bax蛋白的BH3结构域的片段；SEQ.NO.31的Bid蛋白的片段；SEQ.NO.32的核糖核酸酶A ;SEQ.NO.33的细胞色素C ；SEQ.NO.34的粒酶B ；SEQ.NO.35的Nur77蛋白的片段；SEQ.NO.36的Bak蛋白的BH3结构域；SEQ.NO.37的PUMA/BBC3蛋白的BH3结构域；SEQ.NO.38的 PUMA/BBC3 蛋白；SEQ.NO.39的SMAC/Diablo蛋白的片段；SEQ.NO.40的 buforin A ；SEQ.NO.41的豹蛙酶；SEQ.NO.42的Mdm2蛋白的片段；SEQ.NO.43的与Mdm2结合的肽；SEQ.NO.44的Iunasin的片段；SEQ.NO.45的Bik蛋白的BH3结构域；SEQ.NO.46的蛋白酶体的肽抑制剂；SEQ.NO.47的包含蛋白酶体结合性UIM基序的结构域；SEQ.NO.151的azurin衍生的肽；SEQ.NO.152的全长azurine肽；SEQ.NO.153的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽SEQ.NO.154的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽SEQ.NO.155 的 Reticulon RTNl-C 衍生的肽；SEQ.NO.156 的全长人 Reticulon 3 ；SEQ.NO.157的修饰的组成型活性胱天蛋白酶-3 ；SEQ.NO.158的来自Par-4蛋白的SAC结构域；SEQ.NO.159的Noxa蛋白；SEQ.NO.160的Noxa蛋白的MTD/CKP片段； SEQ.NO.161的短的杂合肽Antp-TPR ；SEQ.NO.162的Stat3蛋白的SH2结构域的肽抑制剂SEQ.NO.163的Bak蛋白的BH3结构域衍生的肽；SEQ.NO.164的Bad蛋白的BH3结构域衍生的肽；和SEQ.NO.165的来自Bfll蛋白的肽ATAP。
6.权利要求1-5任一项的融合蛋白，其在结构域(a)和结构域(b)之间包含结构域(C)，所述结构域(C)包含被存在于肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的蛋白酶切割位点，其选自金属蛋白酶MMP识别的序列，尿激酶uPA识别的序列，弗林蛋白酶识别的序列，及其组合。
7.权利要求6的融合蛋白，其中金属蛋白酶MMP识别的序列是SEQ.No. 51，SEQ. No.171或SEQ. No. 173，尿激酶uPA识别的序列是SEQ. No. 52，弗林蛋白酶识别的序列是SEQ. No. 53 或 Seq. No. 172。
8.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域(c)是彼此相邻的金属蛋白酶MMP识别的序列与尿激酶uPA识别的序列的组合。
9.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域(c)是弗林蛋白酶识别的序列。
10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中结构域(b)另外与转运结构域(d)相连，所述转运结构域(d)选自(dl)靶向内质网的序列；(d2)穿过细胞膜转运的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9个Arg残基；(d3)选自SEQ. NO. 54或SEQ. NO. 176的铜绿假单胞菌转位结构域；(d4)膜转运结构域；(d5)细胞核定位结构域；和(d6)线粒体祀向结构域；及其组合。
11.权利要求10的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(dl)是KEDL(SEQ. No. 55)或KDEL (SEQ. No. 56)。
12.权利要求10或11的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(dl)位于融合蛋白的C末端。
13.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸序列(d2)位于融合蛋白的C末端。
14.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸(d2)位于结构域(b)和(c)之间。
15.权利要求10的融合蛋白，其中铜绿假单胞菌转位结构域(d3)位于位于结构域(a)和(c)之间。
16.前述权利要求任一项的融合蛋白，其在结构域(a)，(b),(c)和/或(d)之间另外包含甘氨酸-丝氨酸柔性空间连接子的结构域(e)。
17.权利要求16的融合蛋白，其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子选自GGSG(SEQ. No.57)， GGGS (SEQ. No. 58)， GGGGS (SEQ. No. 59)，GGSGG (SEQ. No. 60)， GGGSGG (SEQ.No. 61)，GGGSGGG (SEQ.No. 62)，GGGSGGGS (SEQ. No. 63)，GGGSGGGGS (SEQ. No.64)，ASGG (SEQ. No. 65)，GGGSASGG (SEQ. No. 66)，GGSHG (SEQ. No. 182)，SGCGS(SEQ. No. 169)，GGGGSGGGG (SEQ. No. 180), SGGCGGS (SEQ. No. 183)和 AACAA (SEQ.No. 184)。
18.权利要求I的融合蛋白，其具有选自下列的氨基酸序列SEQ.No. I; SEQ. No. 2SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8 ; SEQNo. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 12; SEQ. No. 13; SEQ. No. 14; SEQ. No15; SEQ. No. 16; SEQ. No. 17; SEQ. No. 18; SEQ. No. 19; SEQ. No. 20; SEQ. No21; SEQ. No. 22) ; SEQ. No. 23; SEQ. No. 24; SEQ. No. 25，SEQ. No. 26，SEQ. No93，SEQ. No. 94，SEQ. No. 95，SEQ. No. 96，SEQ.，No. 97，SEQ. No. 98，SEQ. No99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ. No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ,No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ. No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. Ill, SEQ. No. 112, SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. No 115，SEQ. No.116，SEQ. No. 117, SEQ. No. 118，SEQ. No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。
19.前述权利要求任一项的融合蛋白，其是重组蛋白。
20.前述权利要求任一项的融合蛋白，其另外包含序列hTRAIL95-121作为其C末端部分，在该序列之前是蛋白酶切割位点的序列，从而允许其从构建体上被切割下来。
21.编码权利要求1-20任一项中定义的融合蛋白的多核苷酸序列。
22.权利要求21的多核苷酸序列，针对在大肠杆菌中的遗传表达进行了优化。
23.权利要求22的多核苷酸序列，选自SEQ.No. 67; SEQ. No. 68; SEQ. No.SEQ. No. 70; SEQ. No. 71; SEQ. No. 72; SEQ. No. 73; SEQ. No. 74 ; SEQ. NoSEQ. No. 76; SEQ. No. 77; SEQ. No. 78; SEQ. No. 79; SEQ. No. 80SEQ. No. 82 ; SEQ. No. 83; SEQ. No. 84; SEQ. No. 85; SEQ. No.87; SEQ. No. 88) ; SEQ. No. 89; SEQ. No. 122; SEQ. No. 123; SEQ.No. 125; SEQ. No. 126; SEQ. No. 127; SEQ. No. 128; SEQ. No. 129SEQ. No. 131; SEQ. No. 132; SEQ. No. 133; SEQ. No. 134; SEQ. No.136; SEQ. No. 137; SEQ. No. 138; SEQ. No. 139; SEQ. No. 140; SEQ.No. 142; SEQ. No. 143; SEQ. No. 144; SEQ. No. 145; SEQ. No. 146;SEQ. No. 148; SEQ; No. 149;和 SEQ. No. 150。
24.表达载体,其包含权利要求21-23任一项的多核苷酸序列。
25.宿主细胞，其包含权利要求24的表达载体。
26.权利要求25的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。
27.药物组合物，其包含权利要求1-19任一项的融合蛋白作为活性成分，与药学上可接受的载体组合。
28.权利要求1-19任一项的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人中的癌症疾病的用途。
29.治疗哺乳动物包括人中的癌症疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的权利要求1-19任一项的融合蛋白或权利要求27的药物组合物。
全文摘要
融合蛋白，尤其是重组的融合蛋白，其包含结构域(a)和结构域(b)，结构域(a)是可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%序列同源性的序列；结构域(b)是促细胞凋亡效应子肽的序列，结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。所述融合蛋白具有抗癌活性。编码所述融合蛋白的核苷酸序列，用于制备所述融合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及所述融合蛋白用于治疗癌症疾病的用途。
文档编号C07K14/435GK102958940SQ201180031414
公开日2013年3月6日 申请日期2011年6月24日 优先权日2010年6月25日
发明者J·S·皮耶奇克兰, S·D·帕夫拉克, B·M·泽雷克, K·K·莱姆克 申请人:阿达梅德公司