在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了根据下式(I)的包含氨基酸1和3位取代基修改的环孢菌素A类似物。所公开的化合物包括对亲环素包括亲环素A具有亲和性的化合物，且所述化合物与环孢菌素A及其仅在1位改性的类似物相比降低了免疫抑制性。
【专利说明】在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于环孢菌素家族的新类似物的分子，包括环孢菌素A(CsA)的类似物和包括具有降低的或没有免疫抑制活性且结合亲环素(CyP)的类似物。
【背景技术】
[0002]环孢菌素是具有有效免疫抑制剂活性的环状多肽种类的成员。至少部分这类化合物(如环孢菌素A(CsA))是由物种多孢木属真菌{Tolypocladium inf latum)的次级代谢物产生的。CsA为有效的免疫抑制剂，已证明其能抑制体液免疫和细胞介导的免疫反应，诸如同种异体移植物排斥、迟发型超敏反应、实验性变应性脑脊髓炎、弗氏佐剂性关节炎和移植物抗宿主疾病。其被用于在器官移植中预防器官排斥；以及用于治疗类风湿性关节炎和用于治疗银屑病。
[0003]尽管环孢菌素家族中许多化合物是已知的，但CsA可能是医学上最广泛应用的化合物。CsA的免疫抑制效应涉及抑制T细胞介导的激活事件。免疫抑制是通过环孢菌素与普遍存在的称为亲环素(cyclophilin) (CyP)的胞内蛋白相结合来实现的。该复合物又抑制钙神经素酶的钙和钙调蛋白-依赖性丝氨酸-苏氨酸磷酸酶的活性。钙神经素的抑制阻止转录因子如NFATP/。和NF-K B的激活，这对于T细胞激活中细胞因子基因iJL-2、IFN_Y、IL-4和GM-CSF)的诱导是必需的。
[0004]自从最初发现环孢菌素以来，已经分离和鉴定了广泛多样的天然存在的环孢菌素。另外，已经通过部分或完全合成手段和通过应用改良的细胞培养技术制备了许多非天然存在的环孢菌素。因此，包含环孢菌素的物种基本上包括例如天然存在的环孢菌素A?Z ;多种非天然存在的环孢菌素衍生物；人工或合成的环孢菌素，包括二氢环孢菌素和异环孢菌素；衍生的环孢菌素(例如MeBm`t残基的3’ -O-原子可被酰化，或3-位肌氨酰基残基上可引入其它取代基);其中MeBmt残基存在异构形式的环孢菌素(例如其中MeBmt残基位置6’和7’位置上的构型为顺式而非反式)；和其中肽序列中特定位置上掺入变体氨基酸的环孢菌素。
[0005]在位置I含有改性氨基酸的环孢菌素类似物公开于WO 99/18120和WO 03/033527中，在此将其全文引入作为参考。这些申请描述了称为“ ISATX247 ”或“ ISA247 ”或“ ISA”的环孢菌素衍生物。该类似物除了在氨基酸I位残基上的修改外，结构上与环孢菌素A相同。 申请人:先前发现，ISA247的顺式和反式异构体的一些混合物(包括主要包含反式ISA247的混合物)显示出增强免疫抑制性效力和降低毒性的组合作用，优于天然存在和目前已知的环孢菌素。
[0006]已经确定环孢菌素有三个细胞靶标；钙神经素，CyP亚型(包括但不限于CyP-A、CyP-B和CyP-D)，和P-糖蛋白(PgP)。环孢菌素与钙神经素的结合导致显著的免疫抑制，且负责与移植和自体免疫迹象的传统联系。
[0007]亲环素家族
CyPs(酶学委员会(EC)编号5.1.2.8)属于一类蛋白质，具有肽酰-脯氨酰顺-反式异构酶活性；这种蛋白质统称为亲免素，并包括FK-506-结合蛋白质和小细胞蛋白(parvulins) □ CyPs被发现在所研究的所有生物体(原核生物和真核生物)的所有细胞中，且在进化中是结构上保守的。人类有7种主要CyPs，即CyP-A、CyP-B.CyP_C、CyP-D.CyP-E.CyP-40、和CyP_NK(首次从人天然杀伤细胞中鉴定出来)，总计16种独特的蛋白质(Galat A.Peptidylprolyl cis/trans isomerases (immunophilins): biologicaldiversity - targets - functions.Curr Top Med Chem 2003， 3:1315-1347 ；WaldmeierPC 等.Cyclophilin D as a drug target.Curr Med Chem 2003，10:1485-1506)。
[0008]在哺乳动物中鉴定的第一个CyPs成员是CyP-A。CyP-A是18_kDa的细胞溶质蛋白质，且是CsA结合的最丰富蛋白质。据估计，CyP-A组成0.6%的总细胞溶质蛋白质(Mikol
V等.X-ray structure of monmeric cyclophilin A-cycloporin A crystal complexat 2.1 A resolution.J.MoL Biol.1993，234:1119-1130 ;Galat A，MetcalfeSM.Peptidylproline cis/trans isomerases.Prog.Biophys.MoL Biol.1995，63:67-118)o
[0009]亲环素的细胞位置
CyPs可发现在大多数组织的大多数细胞腔隙中，且编码独特的功能。在哺乳动物中，CyP-A和CyP-40是细胞溶质的，而CyP-B和CyP-C具有氨基-末端的信号序列，使其革巴向于内质网蛋白质分泌途径(综述于Galat，2003 ；Dornan J等.Structuresof immunophilins and their ligand complexes.Curr Top Med Chem 2003，3:1392-1409)。CyP-D 具有信号序列，使其指向线粒体(Andreeva L 等.Cyclophilins andtheir possible role in the stress response.1nt J Exp Pathol 1999， 80:305—315 ；Hamilton GS 等.1mmunophilins: beyond immunosuppression.J Med Chem 1998，41:5119-5143) ； CyP-E具有氨基-末端的RNA-结合域，且位于胞核(Mi H等.A nuclearRNA-binding cyclophilin in human T cells.FEBS Lett 1996， 398:201-205)，和 CyP-40 具有 TPRs，且位于胞液(Kieffer LJ 等.cyclophilin-40，a protein withhomology to the P59 component of the steroid receptor complex.Cloning of thecDNA and further characterization.J Biol Chem 1993， 268:12303-12310)。人CyP-NK是最大的CyP，具有巨大的亲水性和带正电荷的羧基端，且位于胞液(Anderson SK等.Α cyclophiI in-related protein involved in the function of natural killercells.Proc Natl Acad Sci USA 1993，90:542-546 ;Rinfret A 等.The N-terminalcyclophiI in-homologous domain of a 150-kilodalton tumor recognition moleculeexhibits both peptidylprolyl cis transisomerase and chaperone activities.Biochemistry 1994， 33:1668-1673)。
[0010]亲环素的功能与活性
CyPs是在许多细胞过程中涉及的多功能蛋白质。因为CyPs在进化中`始终是高度保守的，这表明CyPs有至关重要的作用。最初，人们发现CyPs具有催化肽基_脯氨酰键顺反异构化的特异酶性能(Galat，1995 ；Fisher GA 等.A phase I study of paclitaxel(taxol) (T) in combination with SDZ valspodar, a potent modulator of multidrugresistance (MDR).Anti cancer Drugs.1994 ；5 (Suppl I): 43)。因此，CyPs 被称为妝酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPI酶)，它可以在新合成的蛋白质固有折叠中充当加速因子，PPI酶也参与修复由于环境应激受损的蛋白质，所述环境应激包括热应激、紫外线照射、细胞环境的PH变化、和用氧化剂的治疗。此功能被称为分子陪伴活性(Yao Q等.Rolesof cyclophilins in Cancers and Other Organs Systems.World J.Surg.2005, 29:276-280)。
[0011]此外，最近显示，CyPs的PPI酶活性涉及不同的细胞过程，包括细胞内蛋白质运输(Andreeva, 1999 ；Caroni P 等.New member of the cyclophilin familyassociated with the secretory pathway.J Biol Chem 1991，266:10739-42)、线粒体功會泛(Halestrap AP 等.CsA binding to mitochondrial cyclophilin inhibitsthe permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.Mol Cell Biochem 1997， 174:167-72 ;Connern CPj HalestrapAP.Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial innermembrane under conditions of oxidative stress that enhance the opening of acalcium-sensitive non-specific channel.Biochem J 1994，302:321-4)、mRNA 前体力口工(Bourquin JP等.Α serine/argininerich nuclear matrix cyclophilin interactswith the Cterminal domain of RNA polymerase I1.Nucleic Acids Res 1997，25:2055-61)、和多蛋白复合体稳定性维护(Andreeva，1999)。
[0012]环孢菌素在疏水口袋内经由接触以纳摩尔亲和力结合CyP-A (Colgan J等.Cyclophilin A-Deficient Mice Are Resistant to Immunosuppression byCyclosporine.The Journal of Immunology 2005， 174: 6030-6038， Mikolj 1993)，并抑制PPI酶活性。然而，这种效应被认为是与免疫抑制不相关的。更正确地，CsA和CyP-A之间的复合体建立了组合表面，其结合并阻止钙神经素调控细胞因子的基因转录(Friedman J等.Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealedby affinity for a new cyclophilin: one in the presence and one in the absenceof CsA.Cell 1991，66: 799-806 ；Liu J 等.Calcineurin is a common target ofcyclophiIin-CsA and FKBP-FK506 complexes.Cell 1991 ， 66: 807-815)。
`[0013]亲环素的同源性
CyP-A，典型的家族成员，是哺乳动物细胞中高度保守的蛋白质(Handschumacher RE等.Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for CsA.Science 1984，226: 544-7)。人CyP-A的序列同源性分析显示，其与人CyP_B、CyP_C、和CyP-D是高度同源的(Harding MWj Handschumacher RE，Speicher DW.1solation and amino acidsequence of cyclophilin.J Biol Chem 1986，261:8547-55)。通过高度保守区域的约109个氨基酸，形成了所有CyPs的环孢菌素结合口袋。已知的CyPs中，CyP-D具有与CyP-A的最高同源性。事实上，CyP-A和CyP-D之间在这一区域的序列同一性是2003 ;Kristal BS 等.The Mitochondrial Permeability Transition as a Target forNeuroprotection.Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2004， 36 ( 4)；309-312)。因此，CyP-A亲和性是CyP-D亲和性非常好的预言者，反之亦然(Hansson MJ等.The Nonimmunosuppressive Cyclosporine analogues NIM811 and UNIL025 DisplayNanomolar Potencies on Permeability Transition in Brain-Derived Mitochondria.Journal of Bioenergetics and Biomembranes， 2004, 36 (4): 407-413)。这种关系已经反复得到环孢菌素类似物的经验性证明(Hansson，2004 ；Ptak Rg等.1nhibition ofHuman Immunodeficiency Virus Type I Replication in Human Cells by Debio-025,a Novel Cyclophilin Binding kgent.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2008:1302-1317 ；Millay DP 等.Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrialdependent necrosis attenuates muscular dystrophy.Nature Medicine 2008， 14(4):442-447 ；Harris R 等.The Discovery of Novel Non-1mmunosuppressive CyclosporineEthers and Thioethers With Potent HCV Activity.Poster # 1915， 59th AnnualMeeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD),2008)。CyPs的序列同源性提议，所有CyPs是环孢菌素类似物的潜在靶标。因为CyPs涉及的众多细胞过程，这进一步提议，保持显著结合CyP的CsA类似物可用于治疗许多疾病的适应证。
[0014]亲环素介导的疾病
人免疫缺陷病毒(HIV):
HIV是逆转录病毒家族的慢病毒属，并在某些病毒感染和复制过程中充当CyP参与的实例。CyP-A在十年前就已被确定为抗HIV化疗中有效的祀标(Rosenwirth BA等.Cyclophilin A as a novel target in ant1-HIV-1 chemotherapy.1nt.Antivir.News 1995，3:62-63)。CyP-A在HIV-1复制周期中满足早期的基本功能。它被发现特异性结合 HIV-1 Gag 多聚蛋白(Luban JKL 等.Human immunodeficiency virus type
IGag protein binds to cyclophilins A and B.Cell 1993，73: 1067-1078)。衣壳蛋白p24(CA)的G89和P90周围确定的氨基酸序列被鉴定为CyP-A的结合位点(Bukovsky AAA 等.Transfer of the HIV-1 cyclophiI in-binding site to simianimmunodeficiency virus from Macaca mulatta can confer both cyclosporinesensitivity and cyclosporine dependence.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1997，94:10943-10948 ；Gamble TRF 等.Crystal structure of human cyclophilin A bound tothe amino-terminal domain of HIV-1 capsid.Cell 1996， 87: 1285-1294)。 CyP-A 对CA的亲和力促进CyP-A在组装中掺入病毒体颗粒(Thali MA等.Functional associationof cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994，372: 363-365)。实验证据表明，CyP-A-CA的相互作用是HIV-1复制必不可少的；抑制这种相互作用会损害人类细胞中HIV-1 的复制(Hatziioannou TD 等.Cyclophilin interactions with incoming humanimmunodeficiency virus type I capsids with opposing effects on infectivity inhuman cells.J.Virol.2005，79: 176-183 ;Steinkasserer AR 等.Mode of actionof SDZ NIM 811， a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against humanimmunodeficiency virus type I (HIV-1):1nterference with early and late eventsin HIV-1 replication.J.Virol 1995, 69: 814-824)。在CyP-A涉及的病毒复制周期中的步骤被证明是在病毒颗粒渗透后和双链病毒DNA整合到细胞基因组前的事件(BraatenDEK 等.Cyclophilin A is required for an early step in the life cycle of humanimmunodeficiency virus type I before the initiation of reverse transcription.J.Virol 1996 70: 3551-3560 ；Mlynar ED 等.The non-1mmunosuppressive CsAanalogue SDZ NIM 811 inhibits cyclophilin A incorporation into virions andvirus replication in human immunodeficiency virus type 1—infected primaryand growth-arrested T cells.J.Gen.Virol 1996，78: 825—835 ;Steinkasserer，1995) o CsA 抗 HIV-1 的活性首先报道于 1988 年(Wainberg MA 等.The effect of CsAon infection of susceptible cells by human immunodeficiency virus type 1.Blood 1998，72: 1904-1910)。对CsA和许多衍生物抑制HIV-1复制的评价揭示了非免疫抑制的CsA类似物具有抗HIV-1的活性，其相当于或者甚至优于那些免疫抑制的类似物(Bartz SRE 等.1nhibition of human immunodeficiency virus replication bynon immunosuppressive analogs of CsA.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1995， 92:5381-5385，Billich AF等.Mode of action of SDZ NIM 811，a nonimmunosuppressiveCsA analog with activity against human immunodeficiency virus (HIV) type 1:1nterference with HIV protein-cyclophilin A interactions.J.Virol 1995， 69:2451-2461 ;Ptak， 2008)。
[0015]炎症
疾病中的炎症涉及白细胞(白血细胞)流入感染区域。白细胞被趋化因子(化学吸引剂家族)吸引到该区域。体外研究表明，细胞外的CyP-A是人白细胞和T细胞的有效化学吸弓I剂(Kamalpreet A Extracellular cyclophilins contribute to the regulationof inflammatory responses Journal of Immunology 2005 ；175: 517—522 ；YurchenkoVG 等.Active-site residues of cyclophilin A are crucial for its signalingactivity via CD147.J.BioL Chem.2002 ；277: 22959-22965 ;Xu QMC 等.Leukocytechemotactic activity of cyclophilin.J.Biol.Chem.1992 ；267: 11968-11971;Allain FC 等.Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilinB to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytesto extracellular matrix.Proc.Natl.Acad.ScL USA 2002 ；99: 2714-2719)。此外，当体内注入时，CyP-A可诱导迅速的其特征在于白细胞流入的炎症应答(Sherry BN等.1dentification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product oflipopoIysaccharide-activated macrophages.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1992 ；89:3511-3515)。CyP-A普遍分布在细胞内，然而在炎症应答过程中，CyP-A通过活的和濒死的细胞释放到细胞外组织间隙(Sheiry，1992)。事实上，在几种不同的炎症性疾病(包括败血症、类风湿关节炎)和血管平滑肌细胞疾病中，已经报告了升高水平的CyP-A(Jin ZG等.Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress.Circ.Res.2000 ；87: 789-796 ；Teger, 1997 ；Billich, 1997)。在类风湿关节炎的情形中，报道了类风湿关节炎患者滑液中的CyP-A水平和嗜中性粒细胞数量之间的正相关性(Billich，1997)。
[0016]癌症
最近在许多癌症组织和细胞系中，包括但不限于在小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌和乳腺癌中，CyP-A显示出过度表达(Li, 2006 ；Yang H等.Cyclophilin A isupregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal.Biochemicaland Biophysical Research Communications 2007 ；361:763-767 ；Campa, 2003)。在提供外源性CyP-A的情况下，显示出刺激癌细胞的生长(Li，2006 ；Yang, 2007)，而CsA阻止该生长(Campa，2003)。最近，已经证明了 CyP(A和B)错综复杂地参与允许人乳腺癌细胞生长的生化途径，和CyP敲除实验降低了癌细胞的生长、增殖和运动(Fang F等.The expression of Cyclophilin B is Associated with Malignant Progressionand Regulation of Genes Implicated in the Pathogenesis of Breast Cancer.TheAmerican Journal of Pathology 2009 ；174 (I): 297-308 ； Zheng J等.Prolyl IsomeraseCyclophilin A Regulation of Janus-Activated Kinase 2 and the Progression ofHuman Breast Cancer.Cancer Research 2008 ；68 (19): 7769-7778)。最有趣地，CsA治疗异种移植乳腺癌细胞的小鼠，诱发了肿瘤坏死和完全地抑制转移(Zheng，2008)。研究人员得出“亲环素B的作用可显著地促成人乳腺癌的发病机制”和“亲环素的抑制可能是一种人乳腺癌治疗的新治疗策略” (Fang, 2009 ；Zheng, 2008)。
[0017]丙型肝炎
丙型肝炎病毒(HCV)是世界上最普遍的肝脏疾病，被世界卫生组织视为流行病。因为HCV可以在被发现之前感染患者数十年，它通常被称为“静息的”流行病。研究表明，全世界超过2亿人感染了 HCV，世界人口约3.3%的总发病率。仅在美国，近4百万人感染或已经感染HCV ;其中270万人经历慢性感染。所有HCV感染个体处于正发展为严重威胁生命的肝脏疾病的风险中。慢性丙型肝炎的当前标准治疗为两种广义抗病毒剂聚乙二醇干扰素与利巴韦林组合的联用(Craxi A等.Clinical trial results of peginterferons incombination with ribavirin.Semin Liver Dis 2003 ；23 (Suppl I): 35-46)。这种治疗的失败率约为 50% (MoIino BF.Strategic Research Institute: 3rd annual viralhepatitis in drug discovery and development world summit 2007.AMRI TechnicalReports ； 12 (I))。
[0018]最近已证实，CyP-B是HCV基因组有效复制的关键(Watashi K等.CyclophilinB Is a Functional Regulator of Hepatitis C Virus RNA Polymerase.Molecular Cell2005, 19: 111-122)。对于其有效的基因组复制，病毒依赖于宿主衍生的因子诸如CyP_B。CyP-B与HCV RNA聚合酶NS5B相互作用，以直接刺激其RNA结合活性。RNA干扰(RNAi)介导的内源性CyP-B表达的减少和N`S5B结合CyP-B引起的损失均降低了 HCV的复制水平。因此，CyP-B充当HCV复制机构中NS5B的刺激调节剂。这种对病毒复制的调节机制可鉴别CyP-B为抗病毒治疗策略的靶标。
[0019]不像HCV的其他治疗，CyP抑制不直接靶向于HCV病毒。因此认为，对CyP结合药物的耐受将比目前HCV治疗药物出现得更慢(Manns MP等.The way forward inHCV treatment-finding the right path.Nature Reviews Drug Discovery 2007 ；6: 991-1000)。此外，通过在宿主-病毒相互作用水平的干扰，CyP抑制可能会打开抗HCV治疗的新途径，它不仅对干扰素为基础的治疗，而且对直接靶向HCV复制酶如蛋白酶和聚合酶抑制剂的未来治疗均可为互补的(Flisiak R, Dumont JM, Crabbe R.Cyclophilin inhibitors in hepatitis C viral infection.Expert Opinion onInvestigational Drugs 2007, 16(9): 1345-1354)。影响 HCV 病毒复制的新型抗 HCV药物的开发已显著受碍于缺乏合适的实验室HCV模型。这一障碍最近通过开发几种合适的细胞培养模型(Subgenomic HCV Replicon Systems)和含有人肝细胞的小鼠模型(Goto K等.Evaluation of the ant1-hepatitis C virus effects of cyclophilininhibitors, CsAj and NIM811.Biochem Biophys Res Comm 2006 ；343: 879-884;Mercer DF等.Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers.Nat Med 2001 ；7: 927-933)才得到克服。环孢菌素最近在筛选模型和小型临床试验中被证实了抗 HCV 活性(Watashi K 等.CsA suppresses replication of hepatitis Cvirus genome in cultured hepatocytes.Hepa to logy 2003 ;38:1282—1288 ;Inoue K，Yoshiba M.1nterferon combined with cyclosporine treatment as an effectivecountermeasure against hepatitis C virus recurrence in liver transplantpatients with end—stage hepatitis C virus related disease.Transplant Proc2005 ；37:1233-1234)o
[0020]肌肉退行性障碍
CyP-D是所有细胞中线粒体通透性转换孔(MTP)的组成部分。MTP孔的功能是提供细胞内钙稳态。在正常条件下，MTP孔的开放和关闭是可逆的。在涉及过量钙流入细胞内的病理条件下，这使线粒体超负荷且诱导MPT孔的不可逆开放，导致细胞死亡或凋亡。据报道，CsA在乌尔里希(Ullrich)先天性肌营养不良症和Bethlam肌病的患者中纠正了其线粒体的功能障碍和肌细胞凋亡[(Merlini L 等.CsA corrects mitochondrial dysfunction andmuscle apoptosis in patients with collagen VI myopathies.PNAS 2008 ； 105 (13):5225-5229]。CsA已在体外证实了其剂量依赖性地抑制离体心肌线粒体的MTP开放，从而阻止细胞凋亡和允许细胞有宝贵的修复时间(Gomez L等.Inhibition of mitochondrialpermeability transition improves functional recovery and reduces mortalityfollowing acute myocardial infarction in mice Am J Physiol Heart Circ Physiol2007，293: H1654-H1661)。在58例存在急性心肌梗死患者的临床研究中，与安慰剂所观察的结果相比，证实了在再灌注时间施用CsA与较少的梗死相关(Piot C等.Effect ofCyclosporin on Reperfusion Injury in Acute Myocardial Infarction.New EnglandJournal of Medicine 2008 ；395 (5): 474-481))。
[0021]慢性神经退行性疾病
`CsA可用作由于头部外伤的急性脑缺血和损坏情况中的神经保护剂(Ke印M等.1ntrathecal cyclosporine prolongs survival of late—stage ALS mice.BrainResearch 2001 ；894: 327-331)。相对在缺乏治疗时只有10%存活率，经CsA治疗的动物显示出引人注目的80%的存活率。经后来确定，这主要是Csk结合线粒体CyP-D的结果。经随后确定，CsA的效用延伸到慢性神经退行性变,如同后来被卢伽雷(Lou Gerhig)氏病(ALS)的大鼠模型所证实(美国专利号5，972，924)，其中CsA治疗增加了一倍以上的剩余寿命。最近还表明，在CyP-D敲除小鼠中CyP-D失活保护了实验性自身免疫性脑脊髓炎(多发性硬化症的动物模型)的轴突(Forte M等.Cyclophilin D inactivationprotects axons in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model ofmultiple sclerosis.PNAS 2007 ； 104 (18): 7558-7563)。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，CyP-D缺乏基本上提高了学习、记忆和突触的功能(Du H等.Cyclophilin D deficiencyattenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning andmemory in Alzheimer’s disease Nature Medicine 2008, 14(10): 1097-1105)。此外，CsA在亨廷顿病大鼠模型中被证明是有效的(Leventhal L等.CsA protects striatalneurons in vitro and in vivo from 3-nitropropionic acid toxicity.Journal ofComparative Neurology 2000，425(4): 471-478)，和在帕金森病小鼠模型是部分有效的(Matsuura K等.CsA attenuates degeneration of dopaminergic neurons induced by6-hydroxydopamine in the mouse brain.Brain Research 1996， 733(1): 101-104)。因此，线粒体依赖性坏死代表突出的发病机制，提议抑制CyP-D可以提供这些疾病的新药理学治疗策略(Du，2008)。
[0022]由于细胞钙离子(Ca2+)稳态丧失的细胞、组织和器官的损伤
Ca2+在细胞水平上参与许多生理进程，包括健康的线粒体功能。在某些病理条件如心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤中，线粒体丧失调节钙水平的能力，过多钙累积在线粒体基质中，导致线粒体内膜大量的孔开放(Rasola A等.The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in celldeath and in disease pathogenesis.Apoptosis 2007, 12: 815-833)。通过孔的高达1.5千道尔顿的离子和分子的非选择性传导，被称为线粒体通透性转变的过程，导致线粒体膨胀和达到细胞死亡包括诱导细胞凋亡的其他事件。MTP的成分之一是CyP-D。CyP-D是亲免素分子，其异构酶活性调节MPTP的开放，通过Csk或Csk类似物抑制异构酶活性可抑制MPTP产生，从而防止细胞死亡。
[0023]非免疫抑制的环孢菌素类似物亲环素抑制剂
尽管Csk在上述适应证中的有利效应，但免疫抑制伴发的效应限制了 Csk作为CyP抑制剂在临床实践中的实用性。目前，只有少数CsA类似物已被证明有很少或降低的免疫抑制活性(即〈10%的CsA免疫抑制效能)，并仍然保留其结合CyP的能力(即与CsA相比>10%的结合能力)。
[0024]NIM 811 (Melle4 _ 环孢菌素)
NIM 811是真菌雪白弯颈霉{Tol`ypocladium niveum)的发酵产物,其在氨基酸4位上被修改并显示无免疫抑制活性(由于缺乏钙神经素结合)，但保留对CyP-A的结合亲和力(Rosenwirth BA 等.1nhibition of human immunodeficiency virus type Ireplication by SDZ NIM 811， a nonimmunosuppressive Cyclosporine Analogue.Antimicrob Agents Chemother 1994，38: 1763—1772)。
[0025]DEBIO 025 (MeAla3EtVal4-环孢菌素)
DEBIO 025是在氨基酸3和4位上双元化学改性的CsA。DEBIO 025也显示没有免疫抑制活性，仍还保留对CyP-A PPI酶活性的结合亲和力(Kristal，2004)。
[0026]SCY-635 (二甲氨基乙基硫代Sar3-羟基Leu4-环孢菌素)
SCY-635在氨基酸3和4位上双元化学改性的CsA。SCY-635也显示没有免疫抑制活性，仍还保留对CyP-A PPI酶活性的结合亲和力(PCT公布号W02006/039668)。
[0027]—般来说，这些化合物具有对负责结合钙神经素的CsA方面的修改，且一般需要修改氨基酸3和4位。氨基酸3和4位的修改是艰苦和复杂的，因为这一做法通常涉及开放环孢菌素的环、取代和/或修改这些氨基酸、然后闭合环以产生修改的环孢菌素。
[0028]与此相反，侧链氨基酸I位的改性不需要打开环孢菌素的环。然而，氨基酸I位与CyP结合(而不是结合钙神经素)相关，且修改增加了 CsA的免疫抑制效果。例如美国专利号6，605，593公开了氨基酸I位的单一修改，其导致CsA类似物具有增加的免疫抑制效能。[0029]因此，容易合成的且在治疗CyP介导的疾病中有效的环孢菌素类似分子(“CAM”)应是令人想要拥有的。还令人想要地提供CsA类似物，该类似物提供至少一些CsA的原来功能，但它相对于原来的CsA具有改善的或额外的性质、效果和功能。
[0030]发明概沭
根据一方面，本发明的化合物包括根据本文定义的非免疫抑制的环孢菌素A类似物。根据另一方面，本发明化合物对亲环素包括亲环素A具有亲和性。根据其它方面，本发明的化合物包括环孢菌素A类似物，其对亲环素介导的疾病或病症是有用的，并发展了这些疾病或病症的疗法。
[0031]根据一个方面，本发明涉及式L的化合物:
【权利要求】
1.式L的化合物:
2.权利要求1的化合物，其中取代基R1-R2选自:
3.权利要求1的化合物，其中R2选自
4.权利要求1-3任何一项的化合物，其中R’为H。
5.权利要求1或4的化合物，其中基团R1-R2包含2到5个碳的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链，其任选被选自氢、酮、羟基、腈、齒素、氧代、羧酸、酯、和1，3-二氧戊烷的取代基取代。
6.权利要求1-5任何一项的化合物，其中R23选自:
7. 权利要求1-5任何一项的化合物，其中R23包括任选取代的C1-C3烷基。
8. 权利要求1-7任何一项的化合物，其中R23被氨基取代。
9.权利要求7或8的化合物，其中R23为Cl-C3-Ala，且其中所述化合物包含D-差向异构体。
10.权利要求9的化合物，其中R23为MeAla。
11.权利要求10的化合物，其中式L中
12.权利要求1-5任何一项的化合物，其中R23是I-6个、I-5个、I-4个、I-3个或2个碳长度的直链或支链的脂肪族碳链。
13.药物组合物，其包括权利要求1-12任何一项的化合物和一种或多种药用赋形剂。
14.治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病的方法，其包括在治疗亲环素介导的疾
15.权利要求14的方法，其中所述疾病或损伤是由亲环素过表达介导的，或该疾病是亲环素先天性过表达的。
16.权利要求15的方法，其中所述亲环素介导的疾病或损伤选自:病毒感染；炎症性疾病；癌症;肌肉障碍；神经障碍；和与缺血、再灌注、细胞钙稳态丧失、离子稳态丧失、自由基生产增加、或诱导线粒体功能障碍的毒素相关的损伤；其中所述病毒感染任选是由选自以下的病毒引起的:人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV, hCoV-NL63、hCoV-HKU-K hCoV_0C43、hC0V-229E、冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、和传染性胃肠炎病毒；其中所述炎症性疾病任选地选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、炎性肠病、败血症、血管平滑肌细胞疾病、动脉瘤、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植`排斥、和脉管炎；其中所述癌症任选地选自小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、和前列腺癌；其中所述肌肉障碍任选地选自心肌再灌注损伤、肌营养不良症、胶原VI肌病、心脏骤停后综合征(PCAS)、心力衰竭、动脉粥样硬化、和腹主动脉瘤；其中所述神经障碍任选地选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、中风、糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、双相障碍、兴奋毒性损伤、肝性脑病、低血糖、锰中毒、神经元靶标剥夺、毒性脂肪酸如花生四烯酸、机械性神经损伤、脊髓损伤、和脑损伤；和其中所述与细胞钙稳态丧失相关的损伤任选地选自心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤。
17.制备式L化合物的方法，
18.权利要求17的方法，其中所述式L的制备包括在所述溶剂中加入过量的LiCl以主要形成式L的L-差向异构体，或所述式L的制备在LiCl缺失下进行，以主要形成式L的D-差向异构体。
19.权利要求17-18任何一项的方法，其中所述碱性烷基氨基锂为二异丙基氨基锂。
20.权利要求17-19任何一项的方法，其中所述亲电试剂选自下表中定义的组，以生成所述表中提出的相应R23:`
21.制备权利要求1中所定义式L的方法，其包括以下步骤:1)将式IA的化合物与二甲氨基吡啶在适当的溶剂的存在下进行反应，以形成式2化合物
22.制备权利要求1中所定义式L的方法，其包括以下步骤:将其中R’和R1-R2如权利要求1-5任何一项中所定义的式5化合物与碱性烷基氨基锂，在合适的亲电试剂存在下，在适当的溶剂中进行反应，以形成式L的化合物，其中R23包括任选取代的C1-C3烷基.,MeLeu
23.权利要求22的方法，其中所述碱性烷基氨基锂为二异丙基氨基锂.
24.权利要求1-12任何一项的化合物或权利要求13的组合物在制备治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病或损伤的药物中的用途.
25.权利要求24的用途，其中所述亲环素介导的疾病或损伤选自:a.病毒感染；b.炎症性疾病；c.癌症；d.肌肉障碍；e.神经障碍；和f.与缺血、再灌注、细胞钙稳态丧失、离子稳态丧失、自由基生产增加、或诱导线粒体功能障碍的毒素相关的损伤；其中所述病毒感染任选是由选自以下的病毒引起的:人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV, hCoV-NL63、hCoV-HKU-K hCoV_0C43、hC0V-229E、冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、和传染性胃肠炎病毒；其中所述炎症性疾病任选地选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、炎性肠病、败血症、血管平滑肌细胞疾病、动脉瘤、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥、和脉管炎；其中所述癌症任选地选自小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、和前列腺癌；其中所述肌肉障碍任选地选自心肌再灌注损伤、肌营养不良症、胶原VI肌病、心脏骤停后综合征(PCAS)、心力衰竭、动脉粥样硬化、和腹主动脉瘤；其中所述神经障碍任选地 选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、中风、糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、双相障碍、兴奋毒性损伤、肝性脑病、低血糖、锰中毒、神经元靶标剥夺、毒性脂肪酸如花生四烯酸、机械性神经损伤、脊髓损伤、和脑损伤；和其中所述与细胞钙稳态丧失相关的损伤任选地选自心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤。
【文档编号】C07K1/113GK103443119SQ201180067449
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2011年12月14日 优先权日:2010年12月15日
【发明者】A.赫曼斯, B.W.芬斯克, D.J.特勒帕尼耶, M.D.阿贝尔, S.苏吉亚马, D.R.乌雷 申请人:伊索技术制药公司