专利名称：一种分离纯化凝血因子viii的方法
技术领域：
本发明涉及血液制品分离纯化领域，具体地，本发明涉及一种分离纯化凝血因子 VIII的方法。
背景技术：
VIII (FVIII)是一种重要的内源性凝血因子，缺失VIII (FVIII)将导致无法治愈的甲型血友病(HA)。该疾病在世界范围内普遍存在，平均每5000个男性中就有I个患有此病(Singleton T,et al,Emergency Department Care for Patients with Hemophilia and Von Willebrand Disease, The Journal of Emergency Medicine,2010,39 (2) :158-165)。 HA传统的治疗方式是给患者输注新鲜血液或补充富含FVIII的血浆制品，该法具有一定疗效，但存在输注量较大和病毒污染(HIV、HBV)等风险，已经逐渐被淘汰。已有研究者利用基因工程手段重组表达FVIII并用于血友病的治疗，取得了一定的效果。但欧洲药物评价署 (EMEA)的监测结果表明，重组FVIII制品在治疗过程存在引发患者免疫应答的风险(SFDA EMEA警告，重组人凝血因子VIII产生抗体的风险，药物警戒快讯，2006，3 (3) :187)。此外， 重组FVIII产品还存在生产成本高、药物传递途经有限等不利因素，导致迄今为止基因疗法仍然无法普及(Hongzhi Z, et al, Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion, Blood, 2004,103(9) :3412-3419)。现阶段，血友病的主流治疗方式为注射血浆来源的、高纯度的天然FVIII产品。血浆来源的FVIII的生产工艺大多以离子交换层析作为核心技术步骤。1991年法国的 Burnouf■等(Burnouf T B-R, et a, A highly purified factor VIII concentrate p repared from cryop recip itate by ion exchange chromatography,Vox Sang,1991, 60(1) :8-15)报道了使用阴离子交换剂DEAE-Fractogel TSK 650M制备高纯度的FVIII浓制剂，操作简单、方便。但该方法制备的FVIII溶解性不理想；卫生部武汉生物制品研究所应用一种改良的离子交换层析法分离高纯度的FVIII，这一改良的Burnouf法快速简单，适合大规模生产(邹金森等，用改良的离子交换层析法分离高纯度凝血因子FVIII，中国生物制品学杂志，1994，7 (2) :64-66，96)。成都生物制品研究所增加了进样前冷沉淀处理-酸洗沉淀，从人血浆冷沉淀中制备高纯FVIII (罗亮等，离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂， 华西药学杂志，2000,15 (3) :174-176)。Anita Mitico Tanaka 等(Anita Mitico Tanaka, et al,Purification of porcine plasma factor VIII using chromatographic methods, Biotechnology Letters, 2000, 22 :257-260)通过吸附、沉淀、两步 Q-Sepharose FF 离子交换层析，从猪血浆中分离纯化出高活性FVIII。目前FVIII产品的产量严重不足，远远无法满足血友病患者的需要，导致这种困境的主要原因是FVIII蛋白结构非常复杂，分离纯化难度极大，使用传统的分离纯化方法往往无法同时得到具有高凝血活性和高收率的FVIII产品。正常人血浆中的FVIII是以其和von Willebrand因子(VWF)形成的复合体形式存在的(TERRAUBE V, et al, Factor VIII and von Willebrand factor interaction biological,clinical and therapeuticimportance, Haemophilia 2010,16, 3-13), VffF 作为 FVIII 的载体蛋白，在凝血过程中起到了非常重要的作用。而在现有的分离纯化过程特别是离子交换层析中，大分子蛋白复合体容易解离，从而影响最终产品的活性(Zhou WB, et al, Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line,Journal of Chromatography A 2005,1095,119-125);此外，离子交换层析是纯化FVIII的关键步骤，由于FVIII的半衰期较短，现有离子交换纯化操作时间过长，这一步骤导致大量的产品活性损失。
发明内容
本发明的目的在于为了克服上述问题提供了一种分离纯化凝血因子VIII的方法。根据本发明的分离纯化凝血因子VIII的方法，所述方法采用超大孔离子交换层析分离含有凝血因子VIII的层析原料。根据本发明的分离纯化凝血因子VIII的方法具体的包括如下步骤(I)以血浆或含有FVIII的血浆组分为原料进行超大孔离子交换层析分离，获得高活性的FVIII产品；或者(I)将血浆或含有FVIII的血浆组分进行粗分离处理，得到含有FVIII的粗分离样品;(2)以含有FVIII的粗分离样品为原料进行超大孔离子交换层析分离，获得高活性的FVIII产品。根据本发明的分离纯化凝血因子VIII的方法，其中，所述的层析原料为不同含 FVIII的组分，层析原料为血液、血浆或血浆组分，所述血液为人血或动物血，所述血浆为人血衆或动物血衆，所述血衆组分为人Cohn沉淀组分I、动物Cohn沉淀组分I、人血衆冷沉淀或动物血衆冷沉淀。根据本发明的分离纯化凝血因子VIII的方法，其中，为了减轻后续超大孔层析分离的压力，可以对血浆或含有FVIII的血浆组分进行粗分离。具体方法为凝胶过滤层析将血浆或含有FVIII的血浆组分进料到分离范围适宜的凝胶过滤柱中，并使用20mM柠檬酸缓冲液+0. 15M Na2SO4作为运行缓冲液进行洗脱，收集分子量大于100KD的流分，得到含有FVIII的血浆组分，其中，分离范围适宜的凝胶过滤柱包括 Superdex 200 柱、Sephacryl S-300 柱、Sephacryl S-400 柱、Sephacryl S-500 柱、 Sepharose 6FF 柱、Sepharose 4FF 柱、Sepharose CL-4B 柱、Sepharose CL-6B 柱、Superose 6柱，但本发明的保护不局限于此；或者PEG沉淀将血浆或含有FVIII的血浆组分调节pH到5. O到9. O,优选pH为6. O 到8. 0，并向其中加入5-20%的PEG，混匀后，静置2小时，离心得到含有FVIII的沉淀并进行复溶得到含有FVIII的粗分离样品；或者硫酸铵沉淀将血浆或含有FVIII的血浆组分调节pH到5. O到9. 0，优选pH为6. O 到8. 0，并向其中加入5-20%的硫酸铵粉末，混匀后，静置2小时，离心得到含有FVIII的沉淀并进行复溶得到含有FVIII的粗分离样品；或者
超滤法调节血浆或含有FVIII的血浆组分pH值到5.0-10.0，优选pH值为 6. 0-8. 0，优选采用截留分子量100-1000KD的超滤膜超滤，收集保留液，得到含有FVIII的粗分离组分，其中，超滤膜截留分子量越大，去除杂蛋白效率越高，但FVIII的回收率较低。根据本发明的分离纯化凝血因子VIII的方法，其中，所述的超大孔离子交换层析，具体方法为将血浆或含有FVIII的血浆组分或含有FVIII的粗分离组分调节pH到5. 0-10. 0， 优选PH值为6. 0-8. 0 ;根据样品类型选择合适的超大孔离子交换层析介质、进样量和进样速度，将样品进样到用平衡缓冲液平衡好的超大孔离子交换层析柱中，层析过程使用280nm 紫外吸收波长进行蛋白检测，进样的样品体积为0. 5-10. 0倍层析柱体积，优选为I. 0-3. 0 倍层析柱体积；使用含有0. 15-0. 4M NaCl的缓冲液洗脱杂质流分，使用含有0. 3-0. 8M NaCl的缓冲液洗脱含有FVIII的流分，使用含有0. 7-2M NaCl的缓冲液洗脱强保留流分； 收集含有FVIII的流分。作为优选，所述超大孔离子交换层析中，介质选择可以聚合的材料为基质，所述的材料可为乙烯类、苯乙烯类、甲基丙烯酸类、甲基丙烯酸酯类、(甲基)聚丙烯酰胺类、环氧类、乙酸乙烯酯类以及它们的混合物；作为优选，所述超大孔离子交换层析中，介质选择与FVIII存在静电相互作用的分子作为配基，该介质表面的电荷基团为季铵化聚乙烯亚胺(HQ)或聚乙烯亚胺(PI)或N， N-二乙基氨基乙基(DEAE)或羧甲基(CM)或N，N-二乙基氨基-2-羟丙基(QAE)或季胺(Q) 或磺丙基(SP)；作为优选，所述超大孔离子交换层析中，介质选择亲水性化合物作为表面改性物质，所述的表面改性物质包括多糖类化合物如琼脂糖或葡聚糖或羟乙基纤维素或羧甲基支链淀粉、多醇类化合物如聚乙二醇或聚乙烯醇。作为优选，所述超大孔离子交换层析中，介质孔径选择适于FVIII及FVIII-VWF聚集体进出的范围。所述的孔径范围为200nm到60 y m ;作为优选，所述超大孔离子交换层析中，缓冲液体系可采用磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液，优选为柠檬酸缓缓冲液；平衡缓冲液为20-100mM， pH 6. 0-8. 0的柠檬酸缓缓冲液；洗脱缓冲液为上述平衡缓冲液另加2MNaCl ；作为优选，所述超大孔离子交换层析中，所使用的无因次流速范围为0.002
0.02s-1 ;其中，所述超大孔离子交换层析中，缓冲液体系可以加入保护剂以保护FVIII和 FVIII-VWF聚集体的凝血活性，所加保护剂可为Gly、CaCl2, HSA，但本发明的保护不局限于此。在现有技术中由于离子交换层析依赖层析介质的作用，FVIII和VWF复合体的解离及过长的层析时间导致蛋白质失活，从而影响最终产品的活性和收率，在本发明中为了解决该问题，发明人选用不同的层析介质。常规离子交换介质的孔径较小(5 30nm) (Djuro J, et al, Size-exclusion chromatography of plasma proteins with high molecular masses, Journal of Chromatography A, 796 (1998) 289-298),而蛋白质分子较大，有些蛋白尺寸达到20nm，FVIII和VWF复合物尺寸也超过了 10nm，这些大蛋白在这些离子交换孔道中的传递速率较低，分离操作耗时较长，由于FVIII半衰期很短，过长的分离纯化时间会导致FVI11终产品活性较低。同时由于FVIII和VWF复合物尺寸接近孔道尺寸，导致蛋白质和固相表面的作用机会增加，蛋白质复合体容易在固相表面的吸附作用下解离， 从而进一步影响FVIII产品的活性。为了解决这些问题，使分离得到的凝血因子VIII产品同时具有高凝血活性和高收率，在本发明中选用超大孔离子交换层析介质取代常规的离子交换层析介质，设计了新型离子交换分离纯化工艺，在本发明中所选用的超大孔层析介质的孔道尺寸可达600 800nm，FVIII-VWF复合体蛋白可以快速、便利地进入介质孔道，从而实现高通量、快速分离纯化(Tingyue Gu, et al, Rigid gigaporous chromatographic media and their potential impact on downstream processing, CHINA PARTICU0L0GY, 2005,3(6) :349-353),同时最大限度地保护聚集体的天然结构，最终得到活性较高的 FVIII产品。本发明所述方法中FVIII层析回收率稳定高达85%左右，比活高达154IU/mg 蛋白，工艺稳定，易于放大，而现有技术中FVIII层析回收率稳定一般为25%左右，比活为 20-50IU/mg蛋白，因此相对于现有技术本发明的方法取得了意想不到的技术效果。
图I为超大孔离子交换层析分离纯化FVIII的色谱图；图2为SDS-PAGE鉴定FVIII非还原性图谱，M为分子量Marker，1-4分别为超大孔离子交换层析100% B、50% B、30% B、20% B浓度梯度洗脱峰，其中，50% B为目标洗脱峰即FVIII组分。
具体实施例方式本发明的方法通过以下实施例进行详细说明。实施例I取冰冻保存的健康人血浆在37°C水浴融化，并不断震荡使FVIII等充分溶解，完全溶解后进样40mL到用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的柠檬酸盐缓冲液平衡好的P0R0S 50HQ离子交换层析柱中，柱内径2. 6厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，无因次流速0. 02S—1，进样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM 氯化钙和IM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为20%、30%、50%和 100%，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集50%梯度的洗脱峰35mL，蛋白浓度为0. 73g/L，比活为139. 56IU/mg,活性回收率为79. 44%。经SDS-PAGE电泳鉴定纯度(银染法)，由附图 2可见50% B目标洗脱峰在相应位置清晰的VWF和FVIII条带。实施例2取健康人血浆Cohn沉淀所得组分I在37°C水浴融化，并不断震荡使FVIII等充分溶解，完全溶解后进样20mL到用20mM，pH7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的柠檬酸盐缓冲液平衡好的二乙胺-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯-三聚异氰尿酸三烯丙酯) 型阴离子交换层析柱中，柱内径2. 6厘米,柱床高度5厘米,层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，无因次流速0. OIS—1，上样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙和 IM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为25%、60%和100%，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集60%梯度洗脱峰39mL，蛋白浓度为0. 43g/L，比活为65. 94IU/mg,活性回收率为85. 44%。实施例3取3g健康人血浆冷沉淀用50ml 20mM, pH7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的柠檬酸盐缓冲液溶解，取40mL溶解液进样到用上述柠檬酸盐缓冲液平衡好的P0R0S50Q离子交换层析柱中，柱内径2. 6厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外 280nm波长吸收检测，无因次流速0. OOSS'上样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至 280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙和IM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为35^^55%和100%，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集50%梯度洗脱峰33mL，蛋白浓度为0. 57g/L，比活为88. 79IU/mg，活性回收率为 80. 19%。实施例4取冰冻保存的健康猪血浆在37°C水浴融化，并不断震荡使FVIII等充分溶解，完全溶解后进样40mL到用20mM，pH6. 6含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的磷酸盐缓冲液平衡好的POROS 20QE离子交换层析柱中，柱内径I. 6厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA ExplorerlOO，紫外280nm波长吸收检测，无因次流速0. OOSS'上样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH6. 6含120mM甘氨酸、ImM 氯化钙、IM氯化钠和1% HSA的磷酸盐盐缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为33%、70% 和100%，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集目标洗脱峰40mL，蛋白浓度为1.03g/L，比活为 74. 99IU/mg，活性回收率为85. 32%。取离子交换层析目标洗脱峰30mL进样到用20mM，pH 7. 4含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 200凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米,柱床高度60厘米， 层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速0. 5mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH 7. 4含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集80mL处的蛋白峰共50mL， 蛋白浓度为0. 22g/L，比活为148IU/mg，活性回收率为70. 26%。实施例5取冷冻保存的健康人血浆于4°C冰箱静约24h后，3800r/min离心25min得冷沉淀。将3g冷沉淀用50ml 20mM, pH8. 0含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液溶解，取4mL溶解液进样到用上述柠檬酸盐缓冲液平衡好的P0R0S50HS离子交换层析柱中，柱内径I厘米，柱床高度5厘米,层析设备GE AKTA ExplorerlOO,紫外280nm波长吸收检测，无因次流速0. OieS'上样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH8. 0含120mM甘氨酸、ImM氯化钙、IM氯化钠的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为20 %、30 %、50 %，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集50%洗脱峰41mL，蛋白浓度为0. 45g/L，比活为80. 39IU/mg，活性回收率为 93. 58%。对比实施例I取冰冻保存的健康人血浆在37°C水浴融化，并不断震荡使FVIII等充分溶解，完全溶解后进样40mL到用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化钙的柠檬酸盐缓冲液平衡好的Q Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径2. 6厘米,柱床高度10厘米,层析设备 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，无因次流速0. 02S—1，进样完毕后用上述柠檬酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH 7. 5含120mM 甘氨酸、ImM氯化钙和IM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，浓度梯度分别为20%、 30 %、50 %和100 %，每个梯度洗脱两个柱体积，并收集50 %梯度的洗脱峰35mL，蛋白浓度为I. 23g/L，比活为27. 32IU/mg，活性回收率为26. 2%0通过本发明所述FVIII层析方法的回收率稳定高达85%左右，比活高达154IU/mg 蛋白，工艺稳定，易于放大，而现有技术中FVIII层析回收率稳定一般为25%左右，比活为 20-50IU/mg蛋白，因此相对于现有技术本发明的方法取得了意想不到的技术效果。
权利要求
1.一种分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述方法采用超大孔离子交换层析分离含有凝血因子VIII的层析原料。
2.根据权利要求I所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述方法还包括在超大孔离子交换层析分离前进行粗分离处理的步骤。
3.根据权利要求2所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述粗分离处理的方法为凝胶过滤层析血浆或含有凝血因子VIII的血浆组分进料到凝胶过滤柱中，收集分子量大于100，000的流分，得到含有凝血因子VIII的血浆组分；或PEG沉淀血浆或含有凝血因子VIII的血浆组分中加入5-20%的PEG，混匀后，静置2 小时，离心得到含有凝血因子VIII的沉淀并进行复溶得到含有凝血因子VIII的粗分离样品；或硫酸铵沉淀血浆或含有凝血因子VIII的血浆组分中加入5-20%的硫酸铵粉末，混匀后，静置2小时，离心得到含有凝血因子VIII的沉淀并进行复溶得到含有凝血因子VIII的粗分离样品；或超滤调节血浆或含有凝血因子VIII的血浆组分pH值为5. 0-10. O,采用截留分子量 100-1000KD的超滤膜超滤，收集浓缩液。
4.根据权利要求1、2或3所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述含有凝血因子VIII的层析原料为血液、血浆或血浆组分，所述血液为人血或动物血，所述血衆为人血衆或动物血衆，所述血衆组分为人Cohn沉淀组分I、动物Cohn沉淀组分I、人血楽； 冷沉淀、动物血浆冷沉淀、PEG沉淀FVIII组分或甘氨酸沉淀FVIII组分。
5.根据权利要求4所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述血浆为人血衆，血液组分人Cohn沉淀组分I。
6.根据权利要求1、2或3所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔离子交换层析的介质为多孔固相介质，孔径范围为100-2000nm，孔隙率为10-90%。
7.根据权利要求6所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述的多孔固相介质的孔径范围为200-1000nm，孔隙率为50-90 %。
8.根据权利要求6所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔离子交换层析的介质为圆柱形，该圆柱形介质为整体柱，直径范围为lO-lOOOmm，高度范围为1Q-SOOOmm ;或所述超大孔离子交换层析的介质为颗粒，该颗粒为球形颗粒，直径范围为3-2000 μ m。
9.根据权利要8所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述球形颗粒直径范围为20-500 μ m。
10.根据权利要求1、2、3、5或7所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔离子交换层析的介质表面材料为多糖类化合物或多醇类化合物。
11.根据权利要求10所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述多糖类化合物为琼脂糖、葡聚糖、羟乙基纤维素或羧甲基支链淀粉，所述多醇类化合物为聚乙二醇或聚乙烯醇。
12.根据权利要求1、2、3、5或7所述的分离纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔离子交换层析的介质表面电荷基团为季铵化聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺或N，N- 二乙基氨基乙基或羧甲基或N，N- 二乙基氨基-2-羟丙基或季胺或磺丙基。
13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述超大孔离子交换层析中所使用的无因次流速为O. 002 O. 02sP'
全文摘要
本发明涉及血液制品分离纯化领域，具体地，本发明涉及一种分离纯化凝血因子VIII的方法。所述方法采用超大孔离子交换层析分离含有凝血因子VIII的层析原料，所述方法还包括在超大孔离子交换层析分离前进行粗分离处理的步骤。本发明所述方法中FVIII层析回收率稳定高达85％左右，比活高达154IU/mg蛋白，工艺稳定，易于放大，而现有技术中FVIII层析回收率稳定一般为25％左右，比活为20-50IU/mg蛋白，因此相对于现有技术本发明的方法取得了意想不到的技术效果。
文档编号C07K1/30GK102584983SQ20121002220
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者康丽梅, 张焱, 罗坚, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所