专利名称：：一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因及其应用，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：真菌分泌的纤维素酶主要有外切葡聚糖苷酶，内切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶液可以用于生物质转化，纺织和食品等行业。不同的应用方向对酶液中酶系比例要求是不同的。在某些方面，需要较高的β-glucosidase酶酶活。例如在生物质转化方面,真菌分泌的纤维素酶液β-glucosidase的酶活较低，通常导致纤维二糖的积累，致使其反馈抑制纤维二糖水解酶和内切酶的酶活。所以可以提高酶液中β-glucosidase所占的比例，解除纤维二糖积累，提高生物质转化效率。在医药领域，人参皂苷具有很好的预防和抗肿瘤的功效。β-glucosidase将人参阜苷Rbl转化成医药活性更高的人参阜苷Rd和化合物K。(Lin-HuQuan,Jin-ffooMin,YanJin,ChaoWang,Yeon-JuKim,andDeok-ChunYang。EnzymaticBiotransformationofGinsenosideRbltoCompoundKbyRecombinantβ-GlucosidasefromMicrobacteriumesteraromaticumJ.Agric.FoodChem.,2012,60(14),pp3776-3781)银杏黄酮具有广泛的药理作用，也是极好的天然抗氧剂，银杏黄酮被水解成苷元后清除人体氧自由基的生物活性要明显高于糖苷型黄酮，将银杏黄酮苷转变成黄酮苷元是一种有效的方法是利用β-glucosidase的水解活性。(伍毅，王洪新，马朝阳(2009)。固定化B-葡萄糖苷酶水解糖苷型银杏黄酮的研究。哈尔滨工程大学学报第30卷第5期；584-588)。在啤酒行业，β-glucosidase通过水解糖苷键增加啤酒中芳香族物质含量，从而提高啤酒香味。(C。Iasanta,I,caro,I.Perez(2009).β-glucosidaseimmobilizationonionexchangeresinsforusingasaromaticenhancementofwines.ChemicalEngineeringTransaction，Vol.17;897_902)o然而在某些方面，内切酶在酶液当中占的比例应当较为高。如洗涤行业，内切酶通过对棉纤维的非结晶区水解，迫使被纤维素分子封闭的污垢释放，但同时又不降低棉纤维的牢固度，从而达到较好的洗涤效果。在此发明当中，我们从斜卧青霉114-2数据库和里氏木霉QM6a数据库中分别筛选得到了一个基因，利用高效基因操作平台，对这个基因进行了基因敲除，发现敲除菌株相比出发菌株，各种纤维素酶活及蛋白含量都发生改变。此发明可以根据不同的需求用于不同的行业。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种真菌纤维素酶酶活调控基因及其应用。本发明技术方案如下一种真菌纤维素酶酶活调控基因，核苷酸序列如SEQIDNO.I或SEQIDNO.4所/Jnο由上述真菌纤维素酶酶活调控基因编码的真菌纤维素酶酶活调控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示。上述真菌纤维素酶酶活调控基因在制备特定用途纤维素酶中的应用。上述应用，通过构建序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.6所示的敲除盒取代上述真菌纤维素酶酶活调控基因来实现。有益效果本发明所述的真菌纤维素酶酶活调控基因及其调控因子可用于调控真菌中纤维素酶的酶活，通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，相比原初发菌株，纤维素酶活可改变20%左右，从而可以满足各行业对不同纤维素酶酶活的需求。图I是实施例I制得的敲除盒的电泳图；其中1、实施例I中斜卧青霉当中构建的敲除盒，2、IKbMarker；图2是实施例I得到的转化子验证示意图。图3是实施例I得到的转化子PCR验证图。其中M2kbPlusMarker,I:利用pEl和pE9验证转化子I,2:利用pEl和pER验证转化子1，3:利用pEl和pE9验证转化子2，4:利用pEl和pER验证转化子2；图4是实施例I得到的转化子Southernblotting验证图。图5是实施例I转化子与出发株胞外发酵液中β-葡萄糖苷酶比活力图。图6是实施例I转化子与出发株胞外发酵液中外切酶酶比活力图。图7是实施例I转化子与出发株胞外发酵液中内切酶酶比活力图。图8是实施例2制得的敲除盒的电泳图；其中1、木霉当中构建的敲除盒，2、lKbMarker；图9是实施例2得到的转化子验证示意图。图10是实施例2得到的转化子PCR验证图。其中M2kbPlusMarker,I:利用tEl和tE9验证转化子1,2:利用tEl和tER验证转化子I;3:利用tEl和tE9验证转化子2，4:利用tEl和tER验证转化子2；图11是实施例2得到的转化子Southernblotting验证图。图12是实施例2转化子与出发株胞外发酵液中β_葡萄糖苷酶比活力图。图13是实施例2转化子与出发株胞外发酵液中外切酶比活力图。图14是实施例2转化子与出发株胞外发酵液中内切酶比活力图。图15是实施例2转化子与出发株胞外发酵液中滤纸酶活比活力图。具体实施例方式下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。培养基麸皮培养基组分如下，均为重量百分比10wt%麸皮浸出液，2wt%琼脂，余量水。基本培养基组分如下，每升组分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO4O.6g，CaCl20.6g，FeSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g，胰蛋白胨IOg,pH5.5。下层培养基组分如下，每升组分如下葡糖糖20g,KH2PO415g,Sorbitol182.Ig,琼脂糖10g,O.2μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。上层培养基组分如下，每升组分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO4O.6g，CaCl20.6g，FeSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g,胰蛋白胨IOg,Sorbitoll82.lg,0.2μg/ml的抗硫胺素，I.5%琼脂糖。选择培养基组分如下，每升组分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO40.6g，CaCl20.6g，FeSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g，胰蛋白胨10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，I.5%琼脂糖。生理盐水组分如下，均为重量百分比0.9wt%NaCl,0.5wt%吐温80。抽提缓冲液组分如下，组分如下200mMTris-HCl,250mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA，2%十二烷基硫酸钠，pH8.5。菌株斜卧青霉，菌种保藏编号=CGMCC5302，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。里氏木霉QM9414菌株，菌种保藏编号ATCC26921，购自美国菌种保藏中心。PME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备TakafumiKUB0DERA,NobuoYAMASHITA,AkiraNISHIMURA.2000.Pyrithiamineresistancegene(ptrA)ofAspergillusoryzae:cloning,characterizationandapplicationasadominantselectablemarkerfortransformation.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry.Vol.64(2000)No.7P1416-1421)实施例I真菌纤维素酶酶活调控基因敲除盒的获得(I)将斜卧青霉菌株在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照IXlO8比例接入基本培养基中，200rpm，30°C生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于I.5ml离心管中；(2)向离心管中加入500μI抽提缓冲液和0.Ig石英砂，漩涡剧烈振荡lmin，使菌体分散于抽提缓冲液中，650C，放置20min;加入500μI苯酚/氯仿(混合比例I:I)，漩涡剧烈振荡30s,12000rpm室温离心IOmin,收集上清；将上清液转至另一无菌的I.5ml离心管中，加入0.I倍体积的3MNaAc溶液(pH4.8)和O.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20°C放置15min;12000rpm，4°C，lOmin，弃上清，力口浓度为O.Iμg/μIRNAase的ddH20200μ1，37。。，静置Ih;加入200μI苯酚/氯仿(混合比例I:1)抽提一次，12000rpm,IOmin;上清转移至另一I.5ml离心管中，加0.I倍体积3MNaAc(ρΗ4·8)和O.6倍体积异丙醇，_20°C放置20min,12000rpm,4°C,IOmin,收集沉淀；力口700μI70%乙醇(￥八)，洗涤一次(12000印111，21^11);待乙醇挥发完全，用5(^1ddH20溶解斜卧青霉基因组DNA，制得斜卧青霉基因组DNA；(3)以其斜卧青霉基因组DNA为模板，利用引物上游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAG，和下游引物pE2CCAATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCTTTGCCCGGCAAAAAGTATAC,进行PCR扩增，PCR条件为-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段I。(4)以斜卧青霉基因组DNA为模板,利用引物上游引物pE3CAAGAGCGGCTCATCGTCACCCCATTGCGAAACGACTTACAATAATAC,和下游引物pE4GATCATCATCTCCTCACAGACTCACACAGAGACATTTCATGTGCGATG,进行PCR扩增，PCR条件为-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段2。(5)以pME2892质粒作为模板，利用引物上游引物pE5AGTCGGTATGAATGTCACTGGGCAATTGATTACGGGATC,和下游引物pE6GCGGCTCATCGTCACCCCATA,PCR扩增硫胺嘧啶基因，PCR条件为94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°C2.5min,30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段3。(6)将上述PCR扩增的三个片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，大约在2000bp。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收三个片段；将片段I、片段2、片段3按照I:1:3的摩尔比例混合，采用的PCR条件为94°C2min；94°C2min，58°C10min，72°C3min,12个循环；72°C，10min，4°C保存。(7)取出1μ1，稀释10倍做为模板，利用引物上游引物ρΕ7GCCAGCCGCAGGACTGGAAC,和下游引物ρΕ8GACCGAGAGCGAACATGAGTACTG，PCR扩增条件94°C2min；94°C2min，57°C10min，72°C6min，30个循环；72°C，lOmin，制得敲除盒，序列如SEQIDNO.3所示，命名为pE，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，约6000bp,如图I所示。转化斜卧青霉菌株(I)将斜卧青霉菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μI孢子悬液，涂布均匀，30°c培养约15h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。(2)加O.Ig裂解酶(购自sigma公司，商品名称sigma#L_1412)到20ml溶液I(I.2M山梨醇，O.IMKH2PO4)中，轻轻摇均；吸取23ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加23ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30°C培养箱中。酶解约90min后，用镊子(无菌)挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中,然后用数毫升溶液I冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4°C离心lOmin，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/LCaCl2,10mmol/LTrisHCl)重悬原生质体,2000rpm,4°C离心IOmin,去除上清液,用O.5I.Oml溶液2(4°C)重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。(3)将转化体系(200μI原生质体悬液，10μI纯化ρΕ，50μI聚乙二醇分子量(5000-7000))在冰上放置20min，后加2mlPEG(室温)，轻轻混匀，20°C放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取O.2Iml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30°C培养。在筛选培养基上培养34d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。(4)传两代后(培养3天)，将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证，利用引物上游引物pERGAGGGCATACGATGGAAGTCATGGAATACTTTTGGCTGGAC,和下游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAG，进行PCR扩增，PCR条件为94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min，30个循环；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，发现有一条2000bp的条带，如图2所/Jnο利用引物上游引物pE9:GGTTAGATATTCGTTTTGCCGAATAGAAT，和下游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAGA，采用PCR条件为940C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min,30cycle；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，发现2000bp的条带，如图2所示。southern验证转化子(I)以提取的斜卧青霉基因组DNA为模版，利用引物上游引物pEtl:TGGAACAGACTTTATGCTGTTTGAG，和下游引物pEt2GAAAGGTTTGCCCTTGAGACC,采用PCR条件为94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°Clmin，30个循环；72°C，10min，4°C保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，结果发现有一条1050bp条带，制得探针模板；(2)取16μI的探针模板(IOng3ug),沸水浴中煮沸IOmin,迅速插入冰中，制得变性模板；将DIG-HighPrime(购自Roche公司)充分混匀，取4μI加入上述变性模板中，混匀后离心，37°C，孵育20h，65°C水浴lOmin，终止反应。用和HindIII内切酶(购自Fermentas公司)和SalI内切酶(购自Fermentas公司)酶切基因组DNA，酶切反应体系为60μIlOX酶切缓冲液，3U内切酶/μgDNA，30μg基因组DNA，无菌ddH20补足至600μI；37°C酶切过夜，65°C加热，IOmin终止酶切反应。(3)将酶切后的基因组DNA用氯仿/异戊醇(混合比例1:1)抽提一次，无水乙醇_20°C沉淀过夜，70%乙醇洗涤2次，三蒸水重溶，体积控制在20μI左右；O.8wt%琼脂糖凝胶电泳分离，缓冲液为IXTBE，电泳电压40v，按照需要待指示剂溴酚蓝迁移至合适位置时停止电泳；然后将凝胶经变性液(O.5MNaoH,I.5MNacl)处理20min,重复一次，再用去离子水漂洗两次，将凝胶浸泡于中和液(O.5MTris-Hcl(pH7.5)，3MNacl)中和20min，并重复一次。将DNA从胶中转移到尼龙膜上，转移时间14小时，然后用2*SSC漂洗膜，121烘干半小时。(4)将烘干后的尼龙膜放入杂交杯中，加入杂交液3mL到杂交杯中，68°C预杂交2h。预杂交结束后，弃预杂交液，加入含探针杂交液。杂交温度45度，杂交过夜。50mL洗涤液I(5ml20*SSC，44.5mL水，O.5ml10%十二烷基硫酸钠。)洗膜5minX2次，然后用50mL洗涤液II(I.25ml20*SSC，47.25ml水+0.5ml10%SDS。)洗膜于杂交炉中，68°C洗15minX2次，然后加入马来酸缓冲液10ml，室温洗涤5分钟。加入20ml的I*封堵液(18ml马来酸缓冲液，2mll0*封堵缓冲液)，室温放置30min。加入稀释10000倍的抗体20ml(1.6ml10*抗体溶液，14.4ml马来酸缓冲液，I.6ul抗体)室温放置30min。加入80ml洗液(80ml马来酸缓冲液+240ulTween20)室温放置15min，重复一次。加入16ml检测液室温放置5min。加入IOml底物显色液(IOml检测液+200ulBCIP)，黑暗放置3小时。然后膜于无菌水中冲洗，晾干后扫描，见图4.转化子及出发菌株发酵液中，蛋白浓度，滤纸酶活，内切酶酶活，ΑΤΡ，β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活测定将转化子、出发菌株，在麸皮培养基上培养3天后，洗脱下孢子，按照IX107的孢子量接入产酶培养基(麸皮2wt%，(NH4)SO45g/l,KH2PO415g/l，MgSO4O.6g/l,CaCl20.6g/l,微晶纤维素2wt%,水余量),200rpm,30°C,从第三天起每天取样2ml,将剩余发酵液，12000rpm离心，IOmin,取出上清液,利用Lowery测定蛋白浓度，以pNPG和pNPC为底物测定β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活。选用DNS法测定内切酶酶活，将各种酶活换算成比活力。分析本申请成功将SEQIDNO.I中的核苷酸序列利用SEQIDNO.3中核苷酸序列取代，经PCR和Southernblotting验证正确,在产酶培养基上,敲除株相对出发株，β-葡萄糖苷酶比活力最最低降低28%，外切酶比活力最低下降30%，内切酶比活力基本不变。实施例2真菌纤维素酶酶活调控基因敲除盒的获得(I)将里氏木霉QM9414菌株在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照IXio8比例接入基本培养基中，200rpm,30°C生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于I.5ml离心管中；(2)向离心管中加入500μI抽提缓冲液和O.Ig石英砂，漩涡剧烈振荡lmin，使菌体分散于抽提缓冲液中，650C，放置20min;加入500μI苯酚/氯仿(混合比例I:I)，漩涡剧烈振荡30s,12000rpm室温离心IOmin,收集上清；将上清液转至另一无菌的I.5ml离心管中，加入O.I倍体积的3MNaAc溶液(pH4.8)和O.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20°C放置15min;12000rpm，4°C，lOmin，弃上清，力口浓度为O.Iμg/μIRNAase的ddH20200μ1，37。。，静置Ih;加入200μI苯酚/氯仿(混合比例I:1)抽提一次，12000rpm,IOmin;上清转移至另一I.5ml离心管中，加O.I倍体积3MNaAc(ρΗ4·8)和O.6倍体积异丙醇，_20°C放置20min,12000rpm,4°C,lOmin,收集沉淀；力口700μI70%乙醇(￥八)，洗涤一次(12000印111，21^11);待乙醇挥发完全，用5(^1ddH20溶解里氏木霉QM9414基因组DNA，制得里氏木霉QM9414基因组DNA；(3)以里氏木霉QM9414为模板，利用引物上游引物tElGGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC,和下游引物tE2TGATGGATGATTGTACCCCAGCTGCGCGTGTGGTTGTGCAGGTCG,进行PCR扩增，PCR条件为-MV2min；94°C2min,65°C30s,72。。2.5min，30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段I。(4)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，利用引物上游引物tE3:CCGAGAGGGTAGTAATGAGGGAGACGCTCGAACACAGCTGGTGAT，和下游引物tE4CTGACCTCTGCTTCGCTGGCCCCCTTAAAGGTGCCC,进行PCR扩增，PCR条件为-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段2。(5)以里氏木霉QM9414基因组作为模板，利用引物上游引物tE5CGCAGCTGGGGTACAATC,和下游引物tE6CGTCTCCCTCATTACTACCCTC,PCR扩增，PCR条件为94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C2.5min，30个循环；72°C，10min，4°C保存，制得片段3。(6)将上述PCR扩增的三个片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，大约在2000bp。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收三个片段；将片段I、片段2、片段3按照I:1:3的摩尔比例混合，采用的PCR条件为94°C2min；94°C2min，58°C10min，72°C3min,12个循环；72°C，10min，4°C保存。(7)取出Iμ1，稀释10倍做为模板，利用引物上游引物tE7TGAGTTCAGTGAAGGGGGAGGGAGTTTA,和下游引物tE8AGATGCTGTTGATGGCATCCTGAGCGGC,PCR扩增条件94°C2min；94°C2min，57°C10min，72°C6min，30个循环；72°C，lOmin，制得敲除盒，序列如SEQIDNO.3所示，命名为pE，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，约6000bp,如图I所示。转化里氏木霉QM9414菌株(I)将里氏木霉QM9414菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μI孢子悬液，涂布均匀，30°c培养约15h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。(2)加O.Ig裂解酶(购自sigma公司，商品名称sigma#L_1412)到20ml溶液I(1.2M山梨醇，O.IMKH2PO4)中，轻轻摇均；吸取23ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加23ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30°C培养箱中。酶解约90min后，用镊子(无菌)挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中,然后用数毫升溶液I冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4°C离心lOmin，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/LCaCl2,10mmol/LTrisHCl)重悬原生质体,2000rpm,4°C离心IOmin,去除上清液,用O.5I.Oml溶液2(4°C)重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。(3)将转化体系(200μI原生质体悬液，10μI纯化tE，50μI聚乙二醇(分子量5000-7000)在冰上放置20min，后加2mlPEG(室温)，轻轻混匀，20°C放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取O.2Iml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30°C培养。在筛选培养基上培养34d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。(4)传两代后(培养3天)，将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证，利用引物上游引物tERTCATCGACTGGGCGCACATTG,和下游引物tElGGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC,进行PCR扩增，PCR条件为-MV2min；94°C2min,55°C30s，72°C6min，30个循环；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，发现有一条2000bp的条带，如图2所/Jnο利用引物上游引物tE9:AGTCTCTTAGGATCCCTTG，和下游引物tEl:GGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC，采用PCR条件为94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min,30cycle；72°C,10min，4°C保存。用lwt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，发现没有2000bp的条带，如图2所示。southern验证转化子(I)以提取的里氏木霉QM9414基因组DNA为模版，利用引物上游引物pEtl:TGGAACAGACTTTATGCTGTTTGAG，和下游引物pEt2GAAAGGTTTGCCCTTGAGACC,采用PCR条件为94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°Clmin,30个循环；72°C，10min，4°C保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，结果发现有一条1050bp条带，制得探针模板；(2)取16μI的探针模板(IOng3ug),沸水浴中煮沸IOmin,迅速插入冰中，制得变性模板；将DIG-HighPrime(购自Roche公司)充分混匀，取4μI加入上述变性模板中，混匀后离心，37°C，孵育20h，65°C水浴lOmin，终止反应。用和HindIII内切酶(购自Fermentas公司)和SalI内切酶(购自Fermentas公司)酶切基因组DNA，酶切反应体系为60μIlOX酶切缓冲液，3U内切酶/μgDNA，30μg基因组DNA，无菌ddH20补足至600μI；37°C酶切过夜，65°C加热，IOmin终止酶切反应。(3)将酶切后的基因组DNA用氯仿/异戊醇(混合比例1:1)抽提一次，无水乙醇_20°C沉淀过夜，70%乙醇洗涤2次，三蒸水重溶，体积控制在20μI左右；O.8wt%琼脂糖凝胶电泳分离，缓冲液为IXTBE，电泳电压40v，按照需要待指示剂溴酚蓝迁移至合适位置时停止电泳；然后将凝胶经变性液(O.5MNaoH,I.5MNacl)处理20min,重复一次，再用去离子水漂洗两次，将凝胶浸泡于中和液(O.5MTris-Hcl(pH7.5)，3MNacI)中和20min，并重复一次。将DNA从胶中转移到尼龙膜上，转移时间14小时，然后用2*SSC漂洗膜，121烘干半小时。(4)将烘干后的尼龙膜放入杂交杯中，加入杂交液3mL到杂交杯中，68°C预杂交2h。预杂交结束后，弃预杂交液，加入含探针杂交液。杂交温度45度，杂交过夜。50mL洗涤液I(5ml20*SSC，44.5mL水，O.5ml10%十二烷基硫酸钠。)洗膜5minX2次，然后用50mL洗涤液II(I.25ml20*SSC，47.25ml水+0.5ml10%SDS。)洗膜于杂交炉中，68°C洗15minX2次，然后加入马来酸缓冲液10ml，室温洗涤5分钟。加入20ml的I*封堵液(18ml马来酸缓冲液，2mll0*封堵缓冲液)，室温放置30min。加入稀释10000倍的抗体20ml(1.6ml10*抗体溶液，14.4ml马来酸缓冲液，I.6ul抗体)室温放置30min。加入80ml洗液(80ml马来酸缓冲液+240ulTween20)室温放置15min，重复一次。加入16ml检测液室温放置5min。加入IOml底物显色液(IOml检测液+200ulBCIP)，黑暗放置3小时。然后膜于无菌水中冲洗，晾干后扫描，见图4.转化子及出发菌株发酵液中，蛋白浓度，滤纸酶活，内切酶酶活，ΑΤΡ，β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活测定将转化子、出发菌株，在麸皮培养基上培养3天后，洗脱下孢子，按照IXIO7的孢子量接入产酶培养基(麸皮2wt%，(NH4)SO45g/l,KH2PO415g/l，MgSO4O.6g/l,CaCl20.6g/l,微晶纤维素2wt%,水余量),200rpm,30°C,从第三天起每天取样2ml,将剩余发酵液，12000rpm离心，IOmin,取出上清液,利用Lowery测定蛋白浓度，以pNPG和pNPC为底物测定β-葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活。选用DNS法测定内切酶酶活，以whatman滤纸为底物测定滤纸酶活。将各种酶活换算成酶的比活力，结果见图12，13，14，15.分析本申请成功将SEQIDNO.4中的核苷酸序列利用SEQIDNO.6中核苷酸序列取代，经PCR和Southernblotting验证正确,在产酶培养基上,敲除株相对出发株，β-葡萄糖苷酶比活力最高提高50%，外切酶比活力最低下降30%，内切酶比活力最低下降17%，滤纸酶活比活力下降47%。权利要求1.一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因，核苷酸序列如SEQIDNO.I或SEQIDNO.4所示。2.权利要求I所述真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因编码的真菌纤维素酶酶活调控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示。3.权利要求I所述真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因在制备特定用途纤维素酶中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过构建序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.6所示的敲除盒取代上述真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因来实现。全文摘要本发明涉及一种真菌纤维素酶酶活调控基因及其应用，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.4所示；本发明还涉及真菌纤维素酶酶活调控基因编码的真菌纤维素酶酶活调控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示；以及真菌纤维素酶酶活调控基因在制备特定酶活纤维素酶中的应用。本发明所述真菌纤维素酶酶活调控基因及其调控因子可用于调控真菌中纤维素酶的酶活，通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，相比原初发菌株，纤维素酶比活力可改变20%左右，从而可以满足各行业对不同纤维素酶酶活的需求。文档编号C07K14/37GK102925463SQ20121044585公开日2013年2月13日申请日期2012年11月8日优先权日2012年11月8日发明者方诩,王方忠,王明钰,侯少莉,刘奎美,韩丽娟申请人:山东大学