专利名称：人hcrcn81的原核重组质粒及其所表达的蛋白与兔抗人多克隆抗体及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种原核重组质粒及其所表达的蛋白与兔抗人多克隆抗体及用途。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。癌症是一种常见的恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，已经发现一些致癌基因的激活(如survivin、c_myc、Bcl-2等)和抑癌基因的失活(如p53、DCC> nm23、APC> PTEN、DPC4等)，所述致癌基因和抑癌基因与人癌症的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多的致癌基因、抑癌基因尚未发现。
人hcrcn81基因已在GenBank注册，注册号NM_001013649. 3，定量荧光PCR显示，人hcrcn81基因的mRNA的表达在结直肠腺癌组织中下调，NM_001013649. 3在肿瘤组织中的低表达可能导致相应蛋白在恶性肿瘤细胞中的低表达，从而导致相关癌基因的激活及抑癌基因的失活，hcrcn81可能与结直肠腺癌的发病有关(见Qin Jiang, Chunle Zhang, Yao Chen . NM_001013649. 3 gene is down-regulated in human colorectal adenocarcinoma. Molecular Medicine Reports. 2011 ;4(6) : 1279-1281)。因此，有必要进一步研究HCRCN81蛋白质在人恶性肿瘤中的作用。
抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合，产生各种生理效应的球蛋白。多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第一步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史。多克隆抗体能有效提高抗原摄取、加工和识别，因此，有必要制备新型多克隆抗体，为进一步研究hcrcnSl基因的功能提供工具。发明内容
本发明的目的是提供一种人hcrcn81的原核重组质粒、重组人HCRCN81蛋白质和兔抗人多克隆抗体，并证明所述兔抗人多克隆抗体可用于检测人癌细胞和人组织中 HCRCN81蛋白质的表达，为研究hcrcn81基因在人癌症发生发展中的作用和地位提供有用的工具。
人hcrcn81基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所述。本发明所述原核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段与原核表达载体构建而成，所述基因片段是 SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表达载体。
本发明所述原核重组质粒，其原核表达载体为pET质粒系统，包括pET_28a、 pET_30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
本发明所述重组人HCRCN81蛋白质，由上述原核重组质粒表达而成,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
本发明所述兔抗人多克隆抗体，由上述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清纯化得到，其制备方法依次包括以下步骤
(I)通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因，即序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列；
(2)将步骤(I)扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核表达载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；
(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA序列分析；
(4)将正确克隆的原核重组质粒转化工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组人HCRCN81蛋白质；
(5)采用SDS-PAGE、质谱分析鉴定重组人HCRCN81蛋白质的正确性；
(6)将所述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清；
(7)采用抗原亲和纯化方法从步骤(6)所收集的抗血清中获得兔抗人多克隆抗体 (Anti-HCRCN81)。
本发明用雷帕霉素处理结肠癌细胞，并对处理之前和处理之后的结肠癌细胞所表达的总蛋白进行Western blot试验,验证所述兔抗人多克隆抗体(Anti_HCRCN81)对结肠癌细胞表达的HCRCN81蛋白的检测效果。
本发明提取人结直肠癌组织和正常结直肠组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Western blot试验,验证所述兔抗人多克隆抗体(Anti_HCRCN81)对人结直肠癌组织和正常结直肠组织所表达的HCRCN81蛋白的检测效果。
实验结果表明，本发明所述兔抗人多克隆抗体(Anti_HCRCN81)对人癌细胞和人组织所表达的HCRCN81天然蛋白均具有检测作用，可在制备检测人癌细胞和人组织中 hcrcn81基因所表达的蛋白质的检测剂方面应用。
本发明具有以下有益效果
本发明首次制备了重组人HCRCN81蛋白质，并提供了一种新型兔抗人多克隆抗体，实验结果表明，本发明所述兔抗人多克隆抗体对人癌细胞和人组织中的所表达的 HCRCN81天然蛋白均具有检测作用，因而有助于研究hcrcnSl基因在人癌症发生发展中的作用和地位。
图I是原核表达载体pET32a(+)的结构示意图。
图2是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的结构示意图。
图3是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的测序图。
图4是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的PCR电泳图，图中 M:DM2000 Plus Marker，从上到下依次为 8000、5000、3000、2000、1000、750、500、 250、lOObp。
图5是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a⑴/hcrcn81转化BL21(DE3)pLysS感受态细菌所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ;1，2 : BL21 (DE3) pLysS (pET32a)分别 0，ImM IPTG 诱导；3-6 :BL21(DE3)pLysS (pET32a: :hcrcn81)分别 0，0· 01，0· 1，ImM IPTG 诱导。
图6是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a (+) /hcrcn81转化 BL21(DE3)pLysS感受态细菌超声后上清和沉淀所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ；1, 2 0mM IPTG诱导上清和沉淀；3, 4 0. ImM IPTG诱导上清和沉淀。
图7是纯化后的重组人HCRCN81蛋白质的SDS-PAGE电泳图，图中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、 50、40、30、20、15、10kD ;1 :流穿液；2-7 :分别为 10、20、50、100、250、500mM 咪唑洗脱液。
图8是重组人HCRCN81蛋白质电洗脱后SDS-PAGE电泳图，图中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、 70、50、40、30、20、15kD ;1 :电洗脱蛋白；2 :浓缩滤液；3 :lmg/ml BSA 标准品。
图9是重组蛋白质HCRCN81的质谱分析图表。
图10是本发明所述兔抗人多克隆抗体(Anti-HCRCN81)纯化后的SDS-PAGE检测图，图中，I为蛋白Marker ；2为CWRA320抗原亲和纯化兔抗人多克隆抗体；3为CWRA321抗原亲和纯化兔抗人多克隆抗体。
图11的图(a)是使用兔抗人多克隆抗体(Anti_HCRCN81),通过Western blot方法检测结肠腺细胞株SW480中HCRCN81的蛋白表达图，图(b)是使用兔抗人多克隆抗体 (Anti-HCRCN81)，通过Western blot方法检测结肠腺细胞株LoVo中HCRCN81的蛋白表达图；图中，SDS-PAGE 显示 HCRCN81 蛋白在结肠腺细胞株 SW48(TKAPA、SW48(Tdms° 和 LoVc^APA、 LoVo_dms°中的电泳条带，SW480_kapa代表经雷帕霉素处理的结肠腺细胞株SW480，SW480_dms°代表经DMSO处理的结肠腺细胞株SW480，L0V0-kapa代表经雷帕霉素处理的结肠腺细胞株LoVo， LoVo_dms°代表经DMSO处理的结肠腺细胞株LoVo，β -actin为内参照蛋白。
图12是使用兔抗人多克隆抗体(Anti_HCRCN81)、通过Western blot方法检测结肠结肠癌组织和正常组织中HCRCN81的蛋白表达图，其中，图(a)为第一病人的检测图，图中，Tl为第一病人直肠癌的肿瘤组织样本，NI为第一病人肿瘤旁5cm正常组织样本；图(13) 为第二病人的检测图，T2为第二病人直肠癌的肿瘤组织样本，N2为第二病人肿瘤旁5cm正常组织样本。
具体实施方式
实施例I :人hcrcn81的原核重组质粒的构建
根据目的序列(序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列)， 设计全基因合成引物，表 I 中 hcrcn81_lF、hcrcn81_3F、hcrcn81_5F、hcrcn81_7F、 hcrcn81_9F、hcrcn81_llF、hcrcn81-13F 为正义链引物，表 I 中 hcrcn81_2R、hcrcn81_4R、 hcrcn81_6R、hcrcn81_8R、hcrcn81_10R、hcrcn81_12R、hcrcn81-14R 为反义链引物，上游引物hcrcn81_lF添加EcoRI酶切位点(划线处)，下游引物hcrcn81_14R添加HindIII酶切位
表I :全基因合成引物序列
引物名称序列(5’ 一3’)hcrcn81-lFCCGGAATTCATGGAGGCGGGGCCGCATCCCCGGCCGGGGCACTGCTGhcrcn81-3FCGGCTGGACATGAACCACGGCTTCGTGCACCATATCCGACGGAACCAGATCGCTCGGGAhcrcn81-5FGAAGCAGGCGGCCAAGGAGAAGGTGAGGAGGCGGCACACGCCCGCGCCGAChcrcn81-7FGCAGGTGTACCTGCCGCGACACCGAGATGTCTCTGCCCACCCACGCAACCCAGACTAhcrcn81—9FAGCAGTAGTGGAGGCTCTGAGCTGGAGCCTTCTGGCCATCAGCTCTTCTGCTTAGAATAhcrcn81-llFGGTCACATCAGTTATCGTCTATCAGGGTGATGACCCAGGAAAGGTGAGTGAGAAGGhcrcn81-13FCGCCTCTGGATCCACCCATGCGAGAAGCCCTCAAGTTGCGTATCCAGGAGGAhcrcn81-2RCGTGGTTCATGTCCAGCCGCCCCCCAGGCTTGCAGCAGTGCCCCGGCCGGGGATGCGGChcrcn81—4RCTTCTCCTTGGCCGCCTGCTTCACCTTCTTGTCATAGTCGTCCCGAGCGATCTGGTTCChcrcn81-6RTCGCGGCAGGTACACCTGCAGGTCTGGCTTGCGGGGCCGCGTCGGCGCGGGCGTGTGhcrcn81-8RCTCAGAGCCTCCACTACTGCTGCTTTCACCGGACTCTTCATAGTCTGGGTTGCGTGGGhcrcn81-IORGACGATAACTGATGTGACCTCTCCACTGTCTGCCTCGTATTCTAAGCAGAAGAGCThcrcn81-12RATGGGTGGATCCAGAGGCGTGTGTGCCGACACCTTCTCACTCACCTTTCChcrcn81-14RCCCAAGCTTTTATCAGTGTTGGCTCTGGCGCTTTGCAATCTCCTCCTGGATACGCAACT
将第一组引物hcrcn81-lF,hcrcn81- 2R, hcrcn81- 3F, hcrcn81-4R, hcrcn81-5F, hcrcn81-6R, hcrcn81_7F,hcrcn81_8R 混合,PCR 扩增得 hcrcn81 片段 I,PCR 反应体系见表2 ;将第二组引物hcrcn81-9F, hcrcn81-10R, hcrcn81-llF, hcrcn81-12R, hcrcn81-13F, hcrcn81_14R 混合，PCR 扩增得 hcrcn81 片段 2，PCR 反应体系见表 3。
表2 PCR反应体系I
体系I成分体积(μ I)IOXEs Taq buffer5dNTP(2. 5mM each)4MgCl2 (25mM)权利要求
1.一种人hcrcn81的原核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段与原核表达载体构建而成，所述基因片段是SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表达载体。
2.根据权利要求I所述人hcrcnSl的原核重组质粒，其特征在于原核表达载体为pET 质粒系统，包括 pET-28a、pET-30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
3.—种重组人HCRCN81蛋白质，其特征在于由权利要求I或2所述的原核重组质粒表达而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
4.一种兔抗人多克隆抗体，由权利要求3所述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清纯化得到。
5.根据权利要求4所述兔抗人多克隆抗体，其特征在于制备方法依次包括以下步骤(1)通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因，即序列表SEQID NO. I中第 73位至第573位的核苷酸序列；(2)将步骤(I)扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核表达载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA序列分析；(4)将正确克隆的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组人HCRCN81蛋白质；(5)采用SDS-PAGE、质谱分析鉴定重组人HCRCN81蛋白质的正确性；(6)将所述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清；(7)采用抗原亲和纯化方法从步骤(6)所收集的抗血清中获得兔抗人多克隆抗体。
6.权利要求4所述兔抗人多克隆抗体在制备检测人癌细胞和人组织中hcrcnSl基因所表达的蛋白质的检测剂方面的应用。
全文摘要
本发明通过基因工程技术构建人hcrcn81的原核重组质粒，将原核重组质粒转入工程菌进行诱导表达人HCRCN81蛋白质 ，并进行表达产物的提取、纯化，用人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔，制备兔抗人多克隆抗体(Anti-HCRCN81)。实验表明，本发明所述兔抗人多克隆抗体 (Anti-HCRCN81)能够检测癌细胞和人组织中HCRCN81蛋白质的表达，为研究hcrcn81基因在人癌症发生发展中的作用和地位提供了有用的工具。
文档编号C07K14/47GK102936604SQ20121044586
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者陈尧, 温晓霞, 王凯程 申请人:四川大学