专利名称：一种纯化野生刺叶小檗中小檗碱的新型工艺方法
技术领域：
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生三颗针里提取纯化小檗碱的方法，特别是涉及一种利用生物酶解、超声波提取结合柱层析纯化技术，纯化小檗碱的新方法。
背景技术：
刺叶小檗，别名东北三颗针，落叶小灌木，生于高海拔石砾山坡。产于大兴安岭得布尔林业局大秃山和塔河林业局等地。高达100厘米余。树皮暗灰黑色，枝上有细纵沟；枝条暗灰褐色，于短枝的基部生有5 8叉的刺；枝条下部的刺分叉更多，细而尖，呈暗灰色。叶簇生于短枝上，倒卵形，倒披针形或倒卵状长圆形，叶长I 1. 8厘米，宽5 9毫米，基部楔形，先端圆或为钝头，边缘有细针状疏齿牙，叶两面均为黄绿色，叶质较硬稍为革质；萼片6，其下有2 3个小苞。花单生于短枝端叶丛中，很少有2花，花梗长约I厘米，花为淡黄绿色；花瓣6，较萼片为小，基部具2蜜脉；雄蕊6，触它物则起颤动，药为2裂。浆果，倒卵形，长约8毫米，成熟后暗红色，花期6月；果期9月。成分根茎含有小檗胺，大叶小檗碱，药根碱，木兰花碱，小檗碱、掌叶防己碱、异治防己碱，非洲防己碱，氧化小檗碱，尖刺碱等。此外，全株均含有生物碱，香豆素，黄酮，香草酸，阿魏酸等。小檗碱具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种功效。国内提取小檗碱工艺主要是酸水提取法及乙醇煎煮直接提纯后经盐酸沉淀而成，其纯化效果远远不如运用生物酶解，超声波强化提取再进行硅胶柱层析的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服常规技术提取率较低、产品纯度低等缺点，提供一种利用生物酶解，超声波强化 提取再进行硅胶柱层析纯化三颗针中小檗碱的方法，为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其步骤如下(I)酶解三颗针粉碎后，采用复合纤维素酶，在40-50°C下酶解，保温沉淀l_3h ；(2)超声提取加入乙醇，超声波提取，超声频率50-80KHZ，料液比1: 8_10，超声时间50_80min，薄层层析检测分析，回收乙醇，得粗提液；(3)得粗粉将所获初提物用乙醇加热溶解,用酸调其pH值为2. O 2. 5，静置、过滤、并用水洗涤至中性，浓缩干燥得小檗碱粗提粉；(4)硅胶柱层析将所得粗粉溶于热乙醇加适量硅胶搅拌，烘干过60-80目筛，干法上样，上200-300目硅胶柱层析；
(5)洗脱用乙酸乙酯-乙醇溶液以一定比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集小檗碱各阶段洗脱液；(6)浓缩回收乙醇，将小檗碱各阶段洗脱液浓缩，得含量为80%以上的盐酸小檗碱粉末；(7)重结晶取小檗碱粉按一定的量加乙醇，加热溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜，析出结晶，过滤，分离晶体；将剩余物用如上方法加热溶解，重结晶，如此反复两次，得到精制的纯度在98%以上的小檗碱成品。
具体实施例方式实施案例1:一种利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其步骤如下(I)酶解IOOg粉碎至20目的三颗针，采用复合纤维素酶，酶用量为底物的O. 2%，酶解温度40°C，保温 Ih (2)超声提取加入50%乙醇，料液比1: 8，超声波提取，超声频率50KHZ，超声时间50min，薄层层析检测分析，回收乙 醇，得粗提液；(3)得粗粉将所获初提物用乙醇加热溶解，用酸调其pH值为2.0，静置、过滤、并用水洗涤至中性，浓缩干燥得小檗碱粗提粉；(4)硅胶柱层析将所得粗粉溶于热乙醇加适量硅胶搅拌，烘干过60目筛，干法上样，上200目硅胶柱层析；(5)洗脱用乙酸乙酯-乙醇溶液以5 I比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集小檗碱各阶段洗脱液；(6)浓缩回收乙醇，将盐酸小檗碱各阶段洗脱液浓缩，得含量为87. 8%的盐酸小檗碱粉末；(7)重结晶取小檗碱粉按一定的量加乙醇，加热溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜，析出结晶，过滤，分离晶体；将剩余物用如上方法加热溶解，重结晶，如此反复两次，得到精制的纯度在984%的小檗碱成品。实施案例2 :—种利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其步骤如下(I)酶解IOOg粉碎至30目的三颗针，采用复合纤维素酶，酶用量为底物的O. 4%，酶解温度45°C，保温 2h (2)超声提取加入60%浓度的乙醇，超声波提取，超声频率70KHZ，料液比1: 9，超声时间60min，薄层层析检测分析，回收乙醇，得粗提液；(3)得粗粉将所获初提物用乙醇加热溶解，用盐酸调其pH值为2. 5，静置、过滤、并用水洗涤至中性，浓缩干燥得小檗碱粗提粉；(4)硅胶柱层析将所得粗粉溶于热乙醇加适量硅胶搅拌，烘干过80目筛，干法上样，上300目硅胶柱层析；(5)洗脱用乙酸乙酯 -乙醇溶液以8 I比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集小檗碱各阶段洗脱液；(6)浓缩回收乙醇，将小檗碱各阶段洗脱液浓缩，得含量为87%的小檗碱粉末；(7)重结晶取小檗碱粉按一定的量加乙醇，加热溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜，析出结晶，过滤，分离晶体，将剩余物用如上方法加热溶解，重结晶，如此反复两次，得到精制的纯度在982%的小檗碱成品。实施案例3 :—种利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其步骤如下(I)酶解IOOg粉碎至40目的三颗针，采用复合纤维素酶，酶用量为底物的O. 6%，酶解温度50°C，保温 3h ；(2)超声提取加入70%浓度的乙醇，超声波提取，超声频率80KHZ，料液比1: 10，超声时间80min，薄层层析检测分析，回收乙醇，得粗提液；(3)得粗粉将所获初提物用乙醇加热溶解，用盐酸调其pH值为2. 0，静置、过滤、并用水洗涤至中性，浓缩干燥得小檗碱粗提粉；(4)硅胶柱层析将所得粗粉溶于热乙醇加适量硅胶搅拌，烘干过60目筛，干法上样，上200目硅胶柱层析；(5)洗脱用乙酸乙酯-乙醇溶液以10 I比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集小檗碱各阶段洗脱液；(6)浓缩回收乙醇，将小檗碱各阶段洗脱液浓缩，得含量为85. 4%的小檗碱粉末；(7)重结晶
取小檗碱粉按一定的量加乙醇，加热溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜，析出结晶，过滤，分离晶体；将剩余物用如上方法加热溶解，重结晶，如此反复两次，得到精制的纯度在98. 32%的小檗碱成品。
权利要求
1.一种利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其步骤如下 (1)酶解 三颗针粉碎后，采用复合纤维素酶，在40-50°C下酶解，保温沉淀l_3h ； (2)超声提取 加入乙醇超声波提取，超声频率50-80KHZ，料液比1: 8-10，超声时间50-80min，薄层层析检测分析，回收乙醇，得粗提液； (3)得粗粉 将所获初提物用乙醇加热溶解，用酸调其PH值为2. 0 2. 5，静置、过滤、并用水洗涤至中性，浓缩干燥得盐酸小檗碱粗提粉； (4)硅胶柱层析 将所得粗粉溶于热乙醇加适量硅胶搅拌，烘干过60-80目筛，干法上样，上200-300目硅胶柱层析； (5)洗脱 用乙酸乙酯-乙醇溶液以一定比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集小檗碱各阶段洗脱液； (6)浓缩 回收乙醇，将盐酸小檗碱各阶段洗脱液浓缩，得含量为80%以上的盐酸小檗碱粉末； (7)重结晶 取小檗碱粉按一定的量加乙醇，加热溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜，析出结晶，过滤，分离晶体；将剩余物用如上方法加热溶解，重结晶，如此反复两次，得到精制的纯度在98%以上的小檗碱成品。
2.根据权利要求1所述的利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化小檗碱的新方法，其特征是所述的步骤(I)中，三颗针粉碎后过20 40目筛，酶用量为底物的0.2-06%。
3.根据权利要求2所述的利用生物酶解藕联超声波强化提取，再结合柱层析纯化檗碱的新方法，其特征是所述的步骤(2)中，有机溶剂乙醇的体积浓度为50-70%。
4.根据权利要求3所述的利用大孔吸附树脂富集纯化三颗针中盐酸小檗碱的方法，其特征是；所述的步骤(5)中，乙酸乙酯-乙醇溶液以5 10 :1比例进行洗脱。
全文摘要
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生三颗针里提取纯化小檗碱的方法，特别是涉及一种利用生物酶解、超声波提取结合柱层析纯化技术，纯化小檗碱的新方法。其优点是1、应用生物酶解技术，使细胞内小檗碱充分溶出。2、采用超声波提取技术，有效成分受热时间降低，活性损失少，产品生物活性高。3、硅胶柱层析和重结晶纯化技术，使有效成分小檗碱的纯度进一步提高，简单易操作，生产成本大大降低，可以工业化使用。本发明利用生物酶解技术使有效成分尽可能溶出，再用超声波提取，乙醇做溶剂，再经柱层析纯化，最后用重结晶二次纯化，将小檗碱纯度提高到98.4％。
文档编号C07D455/03GK103044417SQ201210595638
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者张亚红, 姚德坤, 姚德利, 万莉 申请人:大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司