专利名称：一种海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物领域，具体地涉及一种生产抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽。
背景技术：
当今社会，恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是人类社会的第一杀手。临床上恶性肿瘤治疗手段多是采用综合疗法，以手术切除、放疗、化疗和免疫治疗相结合。目前已使用的抗肿瘤药物虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在着治疗有效率低、选择性差、毒副作用明显、易产生细胞耐药等问题。因此，寻找高效、低毒、作用靶点明确的抗肿瘤药物仍是生物、医学科研领域的研究热点。由于海洋独特的地理、气候及环境特点，海洋生物具有的新颖性与多样性，在科学研究、应用开发等方面都具有重要价值。海洋因此被认为是个潜在、重要的生物资源库，可能是产生新型生物活性物质和先导化合物的潜在种源地，将会给新型天然药物的筛选与发现带来新的机遇与突破。海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，它们多为生物碱类、萜类、大环内酯类化合物，主要来源于海洋放线菌和海洋真菌。但是来源于海洋细菌的抗肿瘤先导化合物研究的相对较少，有待于在这方面做深入的研究。
发明内容
本发明的要解决的技术问题是提供一种产抗肿瘤活性物质的海洋芽孢杆菌N16(Bacillus sp.N16);该菌株能够产生具有抗肿瘤活性的多肽。一种海洋芽孢杆菌，是从海水中培养分离得到产新型抗肿瘤物质的海洋芽孢杆菌，命名为海洋芽孢杆菌N16(Bacillus sp.N16)，该海洋芽孢杆菌N16于2013年3月4日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013063。本发明还提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌N16多肽，该多肽分子量为1015Da,由 9 个氛基酸组成，氛基酸序列为 Arg-Cys-Phe-Ser-1le-Met-Ser-Asp-Arg。本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其步骤为:(I)发酵培养将海洋芽孢杆菌N16发酵，发酵条件:发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏4_6g/L、蛋白胨 8-12g/L、氯化钠 4-7g/L、ρΗ7.0-7.6，灭菌 1.05kg/cm2，20_35min，150_250r/min、25°C的条件下在旋转摇床中培养20-33h ；(2)超滤分离 将海洋芽孢杆菌N16的发酵液，分批次离心，8000-10000g，5-10min,收集上清液，用分子量为0.3kDa、5kDa和50kDa的超滤膜超滤，获得分子量0.3_5kDa和5_50kDa的不同组分，检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量0.3-5kDa组分的抗肿瘤活性最佳；(3) 二 乙氨乙基(DEAE) FF阴离子交换层析将超滤获得的具有最佳抗肿瘤活性的组分，过DEAE FF阴离子交换层析预装柱，上样缓冲液为3-6mmol/L pH8.0-9.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为 5-20ml，洗脱液为含 0.5-2mol/L NaCl 的 3_6mmol/L pH8.0-9.5 Tris-HCl，洗脱液以0-100% (v/v)的浓度进行梯度洗脱,流速为3-6mL/min,检测波长为280nm,收集各峰,检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存；(4) Superdex30 凝胶过滤层析取DEAE收集的具有较好抗肿瘤活性峰的组分,过Superdex30凝胶过滤预装柱,每次上样量为1-lOml，流动相为超纯水，流速为l_5ml/min，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N16多肽。进一步，所述的抗肿瘤活性的检测方法为以肝癌细胞BEL-7402为靶细胞，采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分。进一步，所述的MTT法:取对数生长期的肝癌细胞BEL-7402，用胰酶消化后，以
4X 104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔180 μ L，在37°C，培养24h，然后加样，样品溶液应先经过微孔滤膜过滤除菌，用培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入20 μ L，4个平行孔，置于细胞培养箱中继续培养48h，然后，加入5mg/mL MTT 20 μ L，置CO2培养箱37°C培养4h ;弃除孔中培养液，然后每孔加入DMSO 150μ L，37°C恒温振荡30min以充分溶解甲瓒结晶，酶标仪检测各孔在570nm波长处吸光度值，实验至少重复3次；细胞抑制率=[(A对照-A样品)/A对照]X 100%，其中A为吸光度值；采用Excel分析软件计算半数抑制浓度 IC50。进一步， 上述步骤(3)中的洗脱液中NaCl的浓度优选为lmol/L。进一步,上述步骤(3)中的洗脱液的流速优选为5.0mL/min。进一步，上述步骤(3)中每次上样量优选为10mL。进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。进一步,上述步骤(4)中流动相为超纯水,流速优选为2.6mL/min。本发明还提供一种抗肿瘤药物，该药物包含海洋芽孢杆菌N16多肽。本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽在肿瘤治疗药物中的应用。本发明与现有技术相比的有益效果:该菌株能够稳定的表达抗肿瘤活性的多肽，该多肽具有较好的酸碱和热稳定性，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，对人正常细胞的细胞毒相对较小，具有较好的研究和应用价值。
图1菌株N16的扫描电子显微镜照片图2粗提物的DEAE FF阴离子层析图谱图3离子交换活性组分的superdex30凝胶过滤层析图谱图4MALD1-TOF-TOF测定海洋芽孢杆菌多肽的氨基酸序列图5海洋芽孢杆菌N16多肽的对人不同肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒海洋芽孢杆菌N16，拉丁文名称为Bacillus sp.N16，于2013年3月4日保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013063。
具体实施例方式下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式的限制。并不限于下列实施例:实施例1海洋芽孢杆菌N16的筛选分离过程( I)活性初筛分别采用海水基础培养基2216E和牛肉膏蛋白胨培养基NRG等不同培养基对海水样品进行选择性的分离培养，共获得47株单菌。对这47株微生物发酵产物进行抗肿瘤活性初步筛选，结果发现，对肝癌细胞BEL-7402的抑制率达到60%以上的有I株；抑制率达到50-60%以上的共有I株。(2)菌株复筛测定上述2种活性菌株发酵液对其他肿瘤细胞，包括人乳腺癌细胞MCF-7、人胶质瘤细胞U251和人非小细胞肺癌细胞A549的增值抑制作用。结果表明，其中有一菌株N16的发酵液对以上肿瘤细胞均·具有较好的细胞增殖抑制作用，其中对人乳腺癌细胞MCF-7、人胶质瘤细胞U251和人非小细胞肺癌细胞A549人的抑制率分别为68.1%、59.8%,63.1%。实施例2海洋芽孢杆菌N16形态特征与生理生化特征(I)形态特征对菌株进行革兰氏染色，为革兰氏阳性菌。菌株N16具有杆菌形态和产芽孢能力这两种芽孢杆菌属的重要特征杆菌，采用平皿插片法培养，用扫描电镜观察菌株N16的菌体形态，0.8-2.Ομπι长，0.2-0.6μπι宽(图1)。25°C下，在海水基础培养基2216Ε上培养24h后，菌落椭圆形、全缘、扁平，直径0.5至1.5mm，光滑无光泽，粘液状外观，乳白色。该菌为好氧菌，在pH值为7.5，培养温度为25°C，培养基中NaC16% (w/v)时生长良好。(2)生理生化反应特征主要根据《普通细菌学方法手册》和《常见细菌系统鉴定手册》的方法，测定部分生理生化特征，阴性:氧化酶试验、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧、脲酶、明胶酶、色氨酸脱氢酶、吲哚实验，阳性:硝酸还原、VP实验、半乳糖式酶、β -半乳糖苷酶、柠檬酸利用、H2S产生；发酵利用:阴性结果，甘露醇、蔗糖、蜜二糖、肌醇、山梨醇，阳性结果，葡萄糖、阿拉伯糖；同化实验为阴性:甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、朽1檬酸。实施例3制备小量的细菌基因组DNA，通过PCR扩增16S rDNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物为单一条带后直接送上海生工测序。测两个反应，测通。序列全长为1542bp，16SrDNA序列见序列表。将该16SrDNA序列在NCBI网站进行BLAST比对，进行同源序列检索，结果发现该菌为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为海洋芽孢杆菌N16 (Bacillus sp.N16)。该海洋芽孢杆菌N16于2013年3月4日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013063。16S rDNA基因序列在某些位点发生突变的几率有所不同，但在种、属水平上表现出结构和功能的保守性，有“细菌化石”之誉，是生物进化史的计时器。采用16S rDNA作为分子指标，可以实现对微生物进行快速、准确、微量、简便的分类鉴定。实施例4具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌N16多肽的制备(I)发酵培养取斜面保存的海洋芽孢杆菌N16菌株一环接种于种子发酵液，25°C，200r/min培养24h，发酵液4000r/min离心20min，所得上清液即为含抗肿瘤多肽的粗液。发酵液中各成分的终浓度为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L, NaC15g/L, pH 7.5。(2)超滤分离将菌株发酵液，分批次离心，8000g，7min，共收集约5000mL上清液，用分子量为
0.3kDa、5kDa和50kDa的超滤膜超滤，获得分子量0.3_5kDa和5_50kDa的不同组分，检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量0.3-5kDa的组分抗肿瘤活性最佳。(3) 二乙氨乙基(DEAE) FF阴离子交换层析将超滤获得的具有最佳抗肿瘤活性组分，过DEAE FF阴离子交换层析预装柱，上样缓冲液为4mmol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液，每次上样量为10mL，洗脱液为含lmol/LNaCl 的 4mmol/L pH8.5 Tris-HCl,洗脱液先依次以 3%(v/v) >6%(v/v) >9%(v/v)、12%(v/v)、24%(v/v)、100%(v/v)的浓度进行梯度洗脱,流速为5mL/min,检测波长为280nm,层析图谱(图2)，收集各峰，检 测各峰组分的抗肿瘤活性，结果表明峰2组分具有最佳抗肿瘤活性，把峰2组分脱盐后真空冷冻干燥保存。(4) Superdex30 凝胶过滤层析取上述步骤的最佳抗肿瘤活性组分,过Superdex30凝胶过滤预装柱,每次上样量为5mL，流动相为超纯水，流速为2.6mL/min，收集各峰，层析图谱(图3)，检测各峰组分的抗肿瘤活性，结果表明峰8组分具有抗肿瘤活性，把峰8组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N16多肽。所述的各峰组分抗肿瘤活性分析为以肝癌细胞BEL-7402为靶细胞，采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分。MTT法:取对数生长期的肝癌细胞BEL-7402，用胰酶消化后，以4X104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔180μ L，在37°C，培养24h。然后加样，样品溶液应先经过微孔滤膜过滤除菌，用培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入20 μ L，4个平行孔，置于细胞培养箱中继续培养48h。然后，加入MTT (5mg/mL)20yL，置CO2培养箱37°C培养4h。弃除孔中培养液，然后每孔加入DMSO 1501^，371:恒温振荡301^11以充分溶解甲瓒结晶。酶标仪检测各孔在570nm波长处吸光度(A)值，实验至少重复3次。细胞抑制率=[(A对照-A样品)/A对照]X 100%。采用Excel分析软件计算半数抑制浓度IC50。实施例5海洋芽孢杆菌N16多肽分子量测定及氨基酸分析:将通过以上流程制备的图3中的峰8抗肿瘤活性组分进行高压液相分析，结果为单一峰。用串联飞行时间质谱仪(Proteomics Analyzer, T0F/T0F TM)进行质谱分析,采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据。进行质谱(Mass Specrometry, MS)分析,检测到活性组分的分子量约为lOlOTa，由9个氨基酸组成。进一步经MS/MS分析，De NovoExplorer从头测序,测序结果见图4,得到海洋芽孢杆菌N16多肽的氨基酸序列为Arg-Cys-Phe-Ser-1le-Met-Ser-Asp-Arg。在NCBI 网站进行protein to protein BLAST 比对，没有检测到与其相匹配的活性肽；由此说明，海洋芽孢杆菌N16产生的该多肽为一种新的抗肿瘤活性多肽，命名为海洋芽孢杆菌N16多肽。实施例6海洋芽孢杆菌N16多肽对不同肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒。分别以人肝癌细胞BEL-7402、人胶质瘤细胞U251、人非小细胞肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7等肿瘤细胞为靶细胞，采用MTT法，检测海洋芽孢杆菌N16多肽对各种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，其中，对BEL-7402的IC5tl值为5.96 μ mol/L，对人肺成纤维细胞HFLl的细胞毒性相对较小，如图5所示。因此，本发明的海洋芽孢杆菌N16多肽可以在治疗人肝癌、胶质瘤、 肺癌、乳腺癌的药物中进行应用。
权利要求
1.一种海洋芽孢杆菌，其特征在于它是从海水中培养分离得到，能产新型抗肿瘤物质，该菌株命名为海洋芽孢杆菌N16 (Bacillus sp.N16)，该海洋芽孢杆菌N16于2013年3月4日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013063。
2.本发明还提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌N16多肽，该多肽分子量为1015Da,由 9 个氛基酸组成，氛基酸序列为 Arg-Cys-Phe-Ser-1le-Met-Ser-Asp-Arg。
3.本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其步骤为: (1)发酵培养 将海洋芽孢杆菌N16发酵，发酵条件:发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏4-6g/L、蛋白胨 8-12g/L、氯化钠 4-7g/L、ρΗ7.0-7.6，灭菌 1.05kg/cm2，20_35min，150_250r/min、25°C 的条件下在旋转摇床中培养20-33h ； (2)超滤分离 将海洋芽孢杆菌N16的发酵液，分批次离心，8000-10000g，5-10min,收集上清液，用分子量为0.3kDa、5kDa和50kDa的超滤膜超滤，获得分子量0.3_5kDa和5_50kDa的不同组分，检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量0.3-5kDa组分的抗肿瘤活性最佳； (3)二乙氨乙基，简称DEAE，FF阴离子交换层析 将超滤获得的具有最佳抗肿瘤活性的组分，过DEAE FF阴离子交换层析预装柱，上样缓冲液为3-6mmol/L pH8.0-9.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，每次上样量为5_20ml，洗脱液为含 0.5-2mol/L NaCl 的 3_6mmol/L ρΗ8.0-9.5 Tris-HCl，洗脱液以 0_100%(ν/ν)的浓度进行梯度洗脱，流速为3-6mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存； (4)Superdex30凝胶过滤`层析 取DEAE收集的具有较好抗肿瘤活性峰的组分,过Superdex30凝胶过滤预装柱,每次上样量为1-1Oml,流动相为超纯水,流速为l-5ml/min,收集各峰,检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N16多肽。
4.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于所述的抗肿瘤活性的检测方法为以肝癌细胞BEL-7402为靶细胞，采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分。
5.根据权利要求4所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于所述的MTT法:取对数生长期的肝癌细胞BEL-7402，用胰酶消化后，以4X 104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔180 μ L，在37°C，培养24h，然后加样，样品溶液应先经过微孔滤膜过滤除菌，用培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入20 μ L，4个平行孔，置于细胞培养箱中继续培养48h，然后，加入5mg/mL MTT 20 μ L，置CO2培养箱37°C培养4h ;弃除孔中培养液，然后每孔加入DMSO 15(^匕371:恒温振荡301^11以充分溶解甲瓒结晶，酶标仪检测各孔在570nm波长处吸光度值，实验至少重复3次；细胞抑制率=[(A对照-A样品)/A对照]X 100%，其中A为吸光度值；采用Excel分析软件计算半数抑制浓度IC50。
6.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤(3)中的洗脱液中NaCl的浓度为lmol/L。
7.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤(3)中的洗脱液的流速为5.0mL/min，每次上样量为10mL。
8.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤(4)中每次上样量为5mL，流动相为超纯水，流速为2.6mL/min。
9.本发明还提供一种抗肿瘤药物,该药物包含海洋芽孢杆菌N16多肽。
10.本发明 还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽在肿瘤治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽，该菌株保藏在中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013063，从该菌株发酵产物中获得一种新型的具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌多肽；通过MTT法，发现该多肽对人肝癌细胞BEL-7402、人乳腺癌细胞MCF-7、人胶质瘤细胞U251、人非小细胞肺癌细胞A549等肿瘤细胞均具有显著增殖抑制作用，对人成纤维细胞HFL1细胞毒相对较小，可以在治疗人肝癌、胶质瘤、肺癌、乳腺癌的药物中进行应用。
文档编号C07K1/16GK103224898SQ20131012815
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年3月5日
发明者郑兰红, 孙谧, 郑媛, 王伟, 盛军, 纪晓峰, 郝建华 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所