专利名称：一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域中的特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种抗氟苯尼考胺IgY抗体的制备方法。
背景技术：
氟苯尼考(Florfenicol’FF)是一种新型的动物专用氯霉素类广谱人工合成抗生素，与同类抗生素相比，因其具有抗菌活性高、无潜在致再生障碍性贫血等优点，而成为氯霉素禁 用后的主要替代药物，在兽医临床上得到广泛的应用。FF的广泛使用而引起的药物残留问题给人们的健康带来了很大的威胁。FF具有较强的免疫毒性，能够抑制免疫接种期或者免疫功能缺陷的动物的免疫反应，且具有一定的血液毒性和胚胎毒性，并能产生耐药性。氟苯尼考胺(Florfenicol Ae, FFA)为氟苯尼考(Florfenicol，FF)的主要代谢产物，且FF及其主要代谢产物在酸水解条件下都可转变为FFA，因此，许多国家都把FFA作为FF残留检测的主要标志物。目前，对于FF及FFA总残留的检测主要为高效液相色谱法(HPLC)、质谱(MS)等理化手段，这些方法虽然灵敏度较高，但是相应的成本也较高，对专业技术要求较高，并不适合大量样本的快速检测，而已有的商品化的ELISA检测试剂盒大多数是针对FF的，对其代谢产物FFA存在很大的漏检风险，因此，建立一种能够快速检测FFA的免疫学检测方法变得极为重要，结合成熟的动物组织样品处理方法，可实现同时对FF和FFA的总残留进行有效检测。卵黄抗体(egg yolk antibody, IgY)是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原,从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50 IOOmg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。与哺乳动物免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fe片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7-7.6之间，在pH4.0 11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4°C储存6 7 年活性下降仅 5% (Jaradat Z ff, Marquardt R R.2000.Studies on the stabilityof chicken IgY in different sugars, complex carbohydrates and food materials.Food and Agricultural Immunology，12 (4): 263-272)(卵黄抗体 IgY，在不同的糖，复合碳水化合物和食品原料的的稳定性研究。粮食和农业免疫学杂志)；IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强(Shimizu M，Nagashima H，SanoK，et al.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G.BiosciBiotechnol Biochem, 56(2):270-274)(鸡和兔免疫球蛋白IgG的分子稳定)。由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，IgY应用于检测也具有多方面的优势如=IgY与风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明旨在于提供一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤:(I)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4°C保存；(3)提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述IgY。需要说明的是，所述制备免疫蛋方法如下:向16周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300 μ g,初次免疫后21天进行二次免疫,免疫剂量为250 μ g, 二次免疫后42天进行三次免疫，免疫剂量为250 μ g三次免疫后63天进行四次免疫,免疫剂量为250 μ g,四次免疫后84天进行五次免疫，免疫剂量为250 μ g。需要说明的是，所述提取IgY的方法如下；(I)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照1:2进行稀释；(2)向稀释液加入质量体积比为3.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；(5)将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋进行透析，使用PBS透析3次，获得的IgY，并保存在-20度备用。需要说明的是，所述PBS的pH值为7.4。作为一种优选的方案，所述禽类为鸡。本发明有益效果在于，可有效增强抗体，具体是，抗氟苯尼考胺IgY在初免2周后，开始产生抗体，在第一次加强免疫后，即第3周，抗体滴度达到1:1280，第四次加强免疫后(14周)，达到最大值 1: 160000，之后，抗体滴度维持在1:160000以上。
图1为本发明合成为免疫抗原的反应方程式；图2为氟苯尼考胺人工抗原合成的紫外分光光度计检测图；图3为抗氟苯尼考胺IgY效价监测图；图4为抗氟苯尼考胺IgY的电泳图。
具体实施例方式下面将结合附图对本发明作进一步的描述。如图1所示，本发明为一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤:(I)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4°C保存；(3)提取IgY，其中 ，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述IgY。需要说明的是，所述制备免疫蛋方法如下:向16周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300 u g,初次免疫后21天进行二次免疫,免疫剂量为250 u g, 二次免疫后42天进行三次免疫，免疫剂量为250 u g,三次免疫后63天进行四次免疫,免疫剂量为250 ii g,四次免疫后84天进行五次免疫,免疫剂量为250 u go需要说明的是，所述提取IgY的方法如下；(I)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照1:2进行稀释；(2)向稀释液加入质量体积比为3.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；(5)将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋进行透析，使用PBS透析3次，获得的IgY，并保存在-20度备用。需要说明的是，所述PBS的pH值为7.4。作为一种优选的方案，所述禽类为鸡。如图2 4所示，为了更好的理解本发明，对抗氟苯尼考胺IgY效价进行测定:(I)包被酶标版:用CBS溶液配制蛋白浓度为5 u g/mL的氟苯尼考胺-卵清蛋白溶液，50 u L/孔加入96孔酶标板，37 °C温育过夜，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；(2)封闭:用5%脱脂奶粉，满孔封闭，37°C温育2h，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；
(3)加IgY提取液:首先每孔加入50 μ L PBS铺底，取出分离纯化得到的IgY溶液，恢复至室温后，用稀释液PBSl: 100稀释，取50 μ L加入第一孔，吹吸混匀后吸取50 μ L加入第二孔，依次倍比稀释至1:102400。空白鸡蛋提取的IgY50yL为阴性对照(NC)，PBS50yL为空白对照(BC)，37°C温育lh，弃去孔内液体，洗板；(4)加酶标二抗:辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY用PBSl:6000稀释，每孔加入50yL，37°C温育lh，弃去孔内液体，洗板；(5)显色:加入新鲜配制的TMB-H2O2底物液50 μ L/孔，室温避光放置15 20分钟,弃去孔内液体,洗板；(6)终止:最后加入50 μ L2mol/L的H2SO4终止反应，在450nm波长处用酶标仪测其OD值，每孔重复三次求平均值；(7)结果判定:求样品孔OD45tl值(P)与阴性对照孔OD45tl值(N)的比值，当P/N彡2.1时，判判为阳性，所对应的抗体最大稀释倍数即为该抗体效价。结果显示，抗FFA-1gY在初免2周后，开始产生抗体，在第一次加强免疫后，即第3周，抗体滴度达到1:1280， 第四次加强免疫后(14周)，达到最大值1:160，000，之后，抗体滴度维持在1: 160，000以上。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
权利要求
1.一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成； (2)制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4°C保存； (3)提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述IgY。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备免疫蛋方法如下:向16周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300 u g,初次免疫后21天进行二次免疫,免疫剂量为250 ii g, 二次免疫后42天进行三次免疫,免疫剂量为250 ii g,三次免疫后63天进行四次免疫，免疫剂量为250 u g,四次免疫后84天进行五次免疫,免疫剂量为250 u g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取IgY的方法如下； (1)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS(pH7.4)按照1:2进行稀释； (2)向稀释液加入质量体积比为3.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟； (3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟； (4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物； (5)将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋进行透析，使用PBS透析3次，获得的IgY，并保存在-20度备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PBS的pH值为7.4。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述禽类为鸡。
全文摘要
本发明公开了一种抗氟苯尼考胺IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤(1)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4℃保存；(3)提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述IgY。根据所述方法制备的抗氟苯尼考胺IgY为实际中快速检测氟苯尼考胺提供了一种抗体检测方法。
文档编号C07K16/44GK103242450SQ20131021009
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月30日 优先权日2013年5月30日
发明者张小莺, 刘小爽, 何金鑫 申请人:西北农林科技大学