一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，采用以下步骤：1）将鱼肌肉溶于10mMTris-Hcl溶液中，组织捣碎后，离心取上清液；2）将上清液于沸水浴中加热，4℃离心取上清液；3）往上清液中加入10mMCacl2及100mMPMSF，4℃离心两次，取上清液；4）往上清液中缓慢加入TCA溶液；5）将溶液在4℃缓慢搅拌，加NaOH溶液调PH；6）将溶液在4℃缓慢搅拌，上清液离心，得沉淀物；7）重复步骤4-6得纯化后的小清蛋白。本发明采用沸水浴加热，两次TCA提取方法纯化鱼类的小清蛋白，纯化工艺简单、过程快速、设备要求较低、易操作，可得较纯的小清蛋白，可操作性强，便于推广应用。
【专利说明】一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法。【背景技术】 [0002]小清蛋白(parvalbumin)是一种常见的鱼类过敏蛋白。免疫学及分子生物学研究发现，PV广泛存在于各种鱼类中，小清蛋白的分子量为10~14kD，等电点为3.9~5.5，主要存在于鱼肉的肌浆蛋白部分。鱼类是最容易引起过敏的食物之一。鱼类过敏可导致患者出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏性症状，严重时还伴随着虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量。国外关于食物过敏及食物过敏原的研究报道较多，但是，我国的食物过敏问题没有得到足够重视，尤其是作为世界上最大的水产品生产国和人口大国，迫切需要系统研究水产品过敏及水产品过敏原，从而为研发低致敏或无致敏的水产品提供技术依据。以往纯化过敏蛋白的方法较繁琐复杂，本方法则较为简单，容易操作，得到的小清蛋白较纯。在对鱼类过敏原的研究日益重视的今天，快速纯化过敏蛋白无疑是将鱼类过敏蛋白的研究迈上了新的台阶。无论对制备高特异性的单克隆抗体还是对进一步的小清蛋白的检测以及诊断方法都提供了更为有利的保障。
【发明内容】
[0003]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法。
[0004]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于采用以下步骤:
1)将鱼肌肉溶于lOmMTris-Hcl溶液中，组织捣碎后，4°C离心取上清液；该步骤为组织匀浆，将肌肉中的蛋白质溶解，弃去杂质，便于后续操作；
2)将所得的上清液于沸水浴中加热15min，4°C离心后取上清液；沸水浴煮沸可除去杂蛋白质，以便制得纯度更闻的小清蛋白；
3)往步骤2)所得的上清液中加入10mMCacl2& lOOmM PMSF，4°C离心两次，取上清液；加Cacl2能使促进蛋白溶解，加PMSF可保持蛋白活性；
4)往步骤3)制得的上清液中缓慢加入TCA溶液，得TCA混合溶液；加入TCA可使上清液中的蛋白沉淀；
5)将步骤4)制得的TCA混合溶液在4°C缓慢搅拌，边搅拌边加入NaOH溶液调节PH=5.2 ;该步骤可使溶液的PH值维持在蛋白质的等电点附近，有利于蛋白质的沉淀；TCA是极酸物质，残留会对后续电泳分析造成影响，本步骤也可以调节PH在适宜范围；
6)将步骤5)制得的溶液在4°C缓慢搅拌，得到的上清液于4°C离心，弃去上清液，得小清蛋白沉淀物；
7)将小清蛋白沉淀物加少量蒸馏水完全溶解后，往蒸馏水溶液中缓慢添加TCA溶液混匀得TCA混合溶液，然后在4°C缓慢搅拌lOmin，边搅拌边加入NaOH溶液调节PH=5.2，得混合溶液，在温度不变的条件下搅拌混合溶液lh后离心，在转速为8000r/min离心20min,弃去上清液，将得到的沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，可知是纯度较高的小清蛋白。
[0005]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤I)中所述鱼肉和Tris-HCL溶液质量体积比为1:5。
[0006]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤I)离心转速为8000r/min,时间为 15min。
[0007]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤I)所述Tris-HCL 溶液的 PH 为 7.5。
[0008]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤2)中离心的转速为 12000r/min，时间为 20min。
[0009]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤3)离心转速为10000r/min,时间为 20min。
[0010]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤4)和步骤7)所述TCA溶液浓度为100%，TCA混合溶液中TCA浓度为3%。
[0011]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤5)和步骤7)中搅拌时间为lOmin，NaOH的浓度为6mol/L。
[0012]所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤6)中搅拌时间为Ih,离心转 速为8000r/min,时间为20min。
[0013]本发明的有益效果是:
本发明一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，采用沸水浴加热，并两次TCA提取的方法纯化鱼类的小清蛋白，纯化工艺简单、纯化过程快速、设备要求较低、易于操作，可得到较纯的小清蛋白，可操作性强，便于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为鲤鱼小清蛋白纯化后的电泳条带。
【具体实施方式】
[0015]本发明下面结合实施例予以进一步详述。
[0016]实施例1
一种快速纯化鲤鱼小清蛋白的方法，依次包括以下步骤:
取2g鲤鱼的白色肌肉溶于10ml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，组织捣碎后，在4°C，离心机转速8000r/min的条件下离心15min，取上清液；将上清液于沸水浴加热20min后，在离心机转速12000r/min，在4°C温度条件下离心20min，取上清液；将上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,离心两次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌Ih,得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min,弃去上清液,得小清蛋白沉淀物；将小清蛋白沉淀物用少量蒸馏水全部溶解后，往蒸馏水溶液中缓慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量为最后制得的溶液中含有3%的TCA，将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌lh，得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，最后将得到的沉淀进行SDS-PAGE分析，可知得到的是纯度较高的小
清蛋白；
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98
IOOmM PMSF溶液的配置:用异丙醇溶解PMSF成17.4mg/ml (100mmol/L),分装成小份贮存于-20°C。
[0017]实施例2
一种快速纯化鳕鱼小清蛋白的方法，依次包括以下步骤:
取2g鳕鱼的白色肌肉溶于IOml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，组织捣碎后，在4°C，离心机转速8000r/min的条件下离心15min，取上清液；将上清液于沸水浴加热20min后，在离心机转速12000r/min，温度4°C条件下离心20min，取上清液；将上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,离心两次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌Ih,得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min,弃去上清液,得小清蛋白沉淀物；将小清蛋白沉淀物用少量蒸馏水全部溶解后，往蒸馏水溶液中缓慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量为最后制得的溶液中含有3%的TCA，将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌lh，得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，最后将得到的沉淀进行SDS-PAGE分析，可知得到的是纯度较高的小清蛋白；`
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98
IOOmM PMSF溶液的配置同实施例1。
[0018]实施例3
一种快速纯化鲫鱼小清蛋白的方法，依次包括以下步骤:
取2g鲫鱼的白色肌肉溶于10ml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，组织捣碎后，在4°C，离心机转速8000r/min的条件下离心15min，取上清液；将上清液于沸水浴加热20min后，在离心机转速12000r/min，温度4°C条件下离心20min，取上清液；将上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,离心两次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌Ih,得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min,弃去上清液,得小清蛋白沉淀物；将小清蛋白沉淀物用少量蒸馏水全部溶解后，往蒸馏水溶液中缓慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量为最后制得的溶液中含有3%的TCA，将得到的TCA混合溶液在4°C温度条件下，缓慢搅拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH调节溶液PH至5.2，最后将PH=5.2的溶液于4°C温度条件下缓慢搅拌lh，得到的上清液在8000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，最后将得到的沉淀进行SDS-PAGE分析，可知得到的是纯度较高的小清蛋白；
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98lOOmM PMSF溶液的配置同实施例1。
[0019]以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是 本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于采用以下步骤: 1)将鱼肌肉加入IOmMTriS-Hcl溶液中，组织捣碎后，4°C离心取上清液； 2)将所得的上清液于沸水浴中加热15min，4°C离心后取上清液； 3)往步骤2)所得的上清液中加入IOmMCacl2及IOOmM PMSF，4°C离心两次，取上清液； 4)往步骤3)制得的上清液中缓慢加入TCA溶液，得TCA混合溶液； 5)将步骤4)制得的TCA混合溶液在4°C缓慢搅拌，边搅拌边加入NaOH溶液调节PH=5.2 ； 6)将步骤5)制得的溶液在4°C缓慢搅拌，得到的上清液于4°C离心，弃去上清液，得小清蛋白沉淀物； 7)将小清蛋白沉淀物加少量蒸馏水完全溶解后，往蒸馏水溶液中缓慢添加TCA溶液混匀得TCA混合溶液，然后在4°C缓慢搅拌lOmin，边搅拌边加入NaOH溶液调节PH=5.2，得混合溶液，在温度不变的条件下搅拌混合溶液Ih后离心，在转速为8000r/min离心20min,弃去上清液，将得到的沉淀经真空干燥机干燥后于_80°C冷冻，得到纯化的小清蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤O中所述鱼肉和Tris-HCL溶液质量体积比为1:5。
3.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤I)离心转速为8000r/min,时间为15min。
4.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤1)所述Tris-HCL溶液的PH为7.5。
5.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤2)中离心的转速为12000r/min，时间为20min。
6.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤3)离心转速为10000r/min，时间为20min。
7.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤4)和步骤7)所述TCA溶液浓度为100%，TCA混合溶液中TCA浓度为3%。
8.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤5)和步骤7)中搅拌时间为lOmin，NaOH的浓度为6mol/L。
9.根据权利要求1所述的一种鱼类过敏原小清蛋白的快速纯化方法，其特征在于步骤6)中揽拌时间为Ih,离心转速为8000r/min,时间为20min。
【文档编号】C07K14/46GK103694331SQ201310677468
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】于滢, 关荣发 申请人:中国计量学院