呋喃西林偶联抗原的制备方法及其偶联抗原与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种呋喃西林偶联抗原的制备方法及其偶联抗原与应用，其中抗原制备方法包括以下步骤：将呋喃西林溶解于甲醇中，再加入甲醛溶液，呋喃西林与甲醛的摩尔比为1：1~2.5，制成溶液A；将载体蛋白溶解在pH为6.0~7.5的缓冲溶液中，制成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，混合均匀后在4~43℃下反应，反应时间为0.5~3d，收集反应液，分离纯化后，得到呋喃西林偶联抗原，其中，呋喃西林与载体蛋白的摩尔比20-120:1。本发明所制得的呋喃西林偶联抗原的偶联比可达到15以上，以此呋喃西林偶联抗原免疫小鼠，可产生抗呋喃西林的特异性抗体，此抗体可用于快速检测呋喃西林的含量。
【专利说明】呋喃西林偶联抗原的制备方法及其偶联抗原与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种呋喃西林偶联抗原的制备方法及其偶联抗原与应用，属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002]呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)，分子式C6H6N404，化学名为5_硝基_2_呋喃甲醛缩氨基脲，其化学结构如图1所示。
[0003]呋喃西林为亮黄色结晶性粉末，日光下色渐变深黄色。呋喃西林在水中的溶解度低，易溶于极性较大的有机溶剂。在5%的甲醇溶液中，呋喃西林的紫外最大吸收波长为260nm 和 376.5 nm。
[0004]呋喃西林是一种人工合成的抗菌药，作为兽药得到广泛的应用。呋喃西林具有较高的电子亲和力，对细胞染色体损伤作用较强，5-硝基促进了呋喃环的稳定性，并促进了呋喃西林与DNA结合，导致DNA发生变异，并且，5-硝基作为亲电子基团，易结合谷胱甘肽(GSH)，发生毒性反应。呋喃西林不仅自身具有毒性作用、致癌致畸作用，而且其代谢产物与体内蛋白紧密结合，形成稳定残留物，无法快速有效的降解，对人类的健康也构成了极大的危害。因此，世界上各个国家和地区对呋喃西林的使用严加监管，美国1993年禁止呋喃西林作为兽药使用。欧盟在1995年禁止使用呋喃西林。2002年4月，我国农业部第193号公告(食品动物禁用的兽药及其它化合物清单)将硝基呋喃类药物列为禁止使用的药物。2003年开始，我国将硝基呋喃纳入残留监控计划中。但是，由于呋喃西林具有杀菌能力强、抗菌谱广、不易产生耐药性、价格低廉、疗效好等性质，仍有一些国家和地区使用此类药物。因此，对呋喃西林的检测显的尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种呋喃西林偶联抗原的制备方法及其偶联抗原与应用，采用甲醛加成法制备呋喃西林偶联抗原可得到较高的偶联率，并且，在采用甲醛加成法制备呋喃西林偶联抗原的过程中，pH值的选择非常关键，所制得的呋喃西林偶联抗原的偶联比达到15以上，且可得到具有良好特异性的抗体。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，包括以下步骤:
(1)将呋喃西林溶解于甲醇中，再加入甲醛溶液，呋喃西林与甲醛的摩尔比为1:f 2.5，制成溶液A ; (2)将载体蛋白溶解在pH为6.0-7.5的缓冲溶液中，制成溶液B ；
(3)将步骤(1)的溶液A加入到步骤(2)的溶液B中，混合均匀后在4~43°C下反应，反应时间为0.5~3d，收集反应液，分离纯化后，得到呋喃西林偶联抗原，其中，呋喃西林与载体蛋白的摩尔比20-120:1。
[0007]步骤(2)中的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)等，最优选为BSA。[0008]步骤(2)中呋喃西林与载体蛋白的摩尔比优选为20-30:1，可在保证制得的呋喃西林偶联抗原具有较高偶联比(偶联比> 15)的前提下，大大提高呋喃西林的利用率，避免呋喃西林的浪费，节约成本。
[0009]步骤(3)中反应温度为25~38°C。
[0010]步骤(3)的反应时间为0.8~ld，节约时间。
[0011]所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法制备所得到的呋喃西林偶联抗原。
[0012]所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法制备所得到的呋喃西林偶联抗原在检测呋喃西林中的应用。
[0013]本发明所制得的呋喃西林偶联抗原的偶联比可达到15.53^33.42，即呋喃西林偶联抗原中每个载体蛋白分子上连接15~34个呋喃西林分子，以此呋喃西林偶联抗原免疫小鼠，可产生抗呋喃西林的特异性抗体。
[0014]根据上述呋喃西林偶联抗原的制备方法所制得的呋喃西林偶联抗原属于本发明的保护范围。
[0015]本发明的优点在于:目前为止，国内外尚未见到关于呋喃西林偶联抗原偶联制备方法的相关报道。呋喃西林偶联抗原的结构式中带有氨基，对于本领域一般技术人员来说，对于带有氨基的半抗原来说，常用的抗原偶联方法为重氮化法和戊二醛法。但是，本 申请人:在研究呋喃西林偶联抗原的制备方法时，发现采用此两种常用的偶联方法来制备呋喃西林偶联抗原，得到的呋喃西林偶联抗原中呋喃西林与载体蛋白的偶联比极低(为5以下)，即每个载体蛋白分子上连接的呋喃西林的数量不超过5个，偶联比低直接影响偶联抗原的免疫原性。本 申请人:在经过无数次尝试和试验后，发现采用甲醛加成法制备呋喃西林偶联抗原可得到较高的偶联率，并且，在采用甲醛加成法制备呋喃西林偶联抗原的过程中，pH值的选择非常关键，在已报道的采用甲醛加成法合成其他药物抗原的报道中，大多数采用的pH值为4.2，但是，本 申请人:突破常规思维，在呋喃西林偶联抗原制备过程中采用pH值为
6.0-7.5，得到了未预料到的技术效果，所制得的呋喃西林偶联抗原的偶联比达到15以上，且可得到具有良好特异性的抗体。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明的呋喃西林的分子结构图。
[0017]图2为本发明的呋喃西林偶联抗原的紫外光谱图；其中a为lmg/ml BSA溶液的紫外扫描图，b为lmg/ml呋喃西林溶液的紫外扫描图，c为实施例1的呋喃西林偶联蛋白(NFZ-BSA)的紫外扫描图。
[0018]图3为本发明的呋喃西林偶联抗原的液相色谱图；其中A为lmg/ml实施例1的呋喃西林偶联蛋白(NFZ-BSA)在376.5 nm光谱下的液相色谱图，B为lmg/ml实施例1的呋喃西林偶联蛋白(NFZ-BSA)在278nm光谱下的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
(一)呋喃西林偶联抗原的制备方法的具体步骤为:
(1)将4.8mg呋喃西林溶解于甲醇中，再加入12ml质量分数为37%的甲醛，即呋喃西林与甲醛的摩尔比为:1:1.8，制成溶液八；
(2)将13.5mg BSA溶解在pH为6.0的乙酸钠溶液中，制成溶液B ；
(3)将步骤(1)的溶液A加入到步骤(2)的溶液B中，混合均匀后在35°C下反应ld，收集反应液。其中，呋喃西林与BSA的摩尔比为120:1。
[0020]呋喃西林偶联抗原(即NFZ-BSA)的分离纯化:将上述反应液经过Sephadex G_25葡聚糖凝胶柱层析上样吸附，冲洗层析柱，洗脱去除过量的反应溶剂和反应物，洗脱液为
0.01 mol/L PBS(pH= 7.4)缓冲液，流速为1.0 mL/min ;最后，采用分部收集器收集，进行紫外检测。当然，呋喃西林偶联抗原的分离纯化也可采用透析法进行，透析法的具体步骤为:使用PBS对反应液进行透析，采用的透析袋孔径为2.5nm,每2h换液一次，换液2~3d后得到袋中溶液即为呋喃西林偶联抗原溶液，进行紫外检测。但是，采用Sephadex G_25葡聚糖凝胶柱层析进行分离纯化得到的呋喃西林偶联抗原溶液中呋喃西林偶联抗原的纯度更高，计算所得的偶联比也更可靠。
[0021](二)NF偶联抗原的鉴定
(1)紫外检测:采用UV-1800紫外分光光度仪，分别对呋喃西林和BSA标准品溶液进行全波长扫描(190nm~800nm)，确定其特征吸收波长，其中，呋喃西林的特征吸收峰波长为260 11111和376.5 nm ;BSA的特征吸收峰波长为278nm。对经G-25凝胶层析柱分离纯化后的偶联产物(即NFZ-BSA偶联产物)进行检测，检测偶联物在该波长附近范围的特征吸收峰情况(NFZ-BSA偶联产物的紫外全波长扫描图见图2)。
[0022]偶联比的计算方式为:根据所测定的NFZ-BSA在波长278 nm和376.5 nm的吸光度，以及NFZ和BSA在这两种波长下的摩尔吸光系数，偶联物的偶联比可按下列公式计算。
[0023]
【权利要求】
1.一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，包括以下步骤:(1)将呋喃西林溶解于甲醇中，再加入甲醛溶液，呋喃西林与甲醛的摩尔比为1:f 2.5，制成溶液A ;(2)将载体蛋白溶解在pH为6.0-7.5的缓冲溶液中，制成溶液B ；(3)将步骤(1)的溶液A加入到步骤(2)的溶液B中，混合均匀后在4~43°C下反应，反应时间为0.5~3d，收集反应液，分离纯化后，得到呋喃西林偶联抗原，其中，呋喃西林与载体蛋白的摩尔比20-120:1。
2.根据权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，其特征在于:步骤(2)中的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，其特征在于:步骤(2)中呋喃西林与载体蛋白的摩尔比为20-30:1。
4.根据权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，其特征在于:步骤(3)中反应温度为25~38°C。
5.根据权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法，其特征在于:步骤(3)的反应时间为0.8~Id。
6.一种如权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法制备所得到的呋喃西林偶联抗原。
7.—种如权利要求1所述的一种呋喃西林偶联抗原的制备方法制备所得到的呋喃西林偶联抗原在检测呋喃西林中的应用。
【文档编号】C07K1/107GK103641909SQ201310681540
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】石贤爱, 郑友世 申请人:福州大学