源自血浆的免疫球蛋白的级分i-iv-1沉淀的制作方法

源自血浆的免疫球蛋白的级分i-iv-1沉淀的制作方法
【专利摘要】在其它方面，本发明提供用于从混合血浆中生产血液蛋白质组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供允许从起始血浆样品中纯化的血液蛋白质的产率显著增加的醇分级分离方案。在具体的实施方案中，提供使混合血浆分级分离的方法，所述方法包括初始低pH、高醇沉淀步骤。本发明还提供治疗性血液蛋白质的药物组合物。
【专利说明】源自血浆的免疫球蛋白的级分卜丨VH沉淀
[0001]申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年2月23日提交的美国临时专利申请序列号61/602, 488的优 先权，所述申请的公开内容出于所有目的在此通过引用整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 在1952年，源自人血浆的免疫球蛋白产品首次用于治疗免疫缺陷。最初，所选方 法为肌内或皮下施用分离自血浆的免疫球蛋白同种型G(IgG)。然而，这些方法不允许施用 有效治疗各种疾病所必需的大量IgG。因此，研发可静脉内施用的IgG产品。通常，静脉内 免疫球蛋白（IVIG)含有源自超过一千个血液供体的血浆的混合免疫球蛋白G(IgG)免疫球 蛋白。制剂通常含有超过95%的具有完整Fc依赖性效应器功能的未修饰的IgG和仅痕量 的免疫球蛋白A (IgA)和免疫球蛋白M (IgM)。通常，IVIG是无菌过滤的并且生产过程包含 灭活和/或除去病毒的步骤。这些纯化的IgG产品主要用于治疗以下三大类医学病状：（1) 免疫缺陷：X连锁丙种球蛋白缺乏血症、低丙种球蛋白血症（原发性免疫缺陷）和特征为低 抗体水平的获得性免疫低下病状（继发性免疫缺陷）；(2)炎性和自身免疫疾病；和（3)急 性感染。
[0005] 具体地，患有原发性免疫缺陷病症的许多人缺乏抵抗感染所需的抗体。在某些情 况下，这些缺陷可通过通常通过静脉内施用输注纯化的IgG(SMVIG治疗）来弥补。通常 以以下形式治疗几种原发性免疫缺陷病症，包括X连锁丙种球蛋白缺乏血症（XLA)、普通可 变性免疫缺陷（CVID)、高IgM综合症（HIM)、重症联合免疫缺陷（SCID)和一些IgG亚类缺 陷（Blaese 和 Winkelstein，J.Patient&Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson，MD: Immune Deficiency Foundation ;2007)〇
[0006] 尽管IgG治疗可极为有效地管控原发性免疫缺陷病症，但此治疗仅临时性替代体 内未产生的抗体，而不能治愈该疾病。因此，患者依赖于IgG治疗的反复给药，通常大约每 月一次，至死方休。此治疗非常需要连续生产IgG组合物。然而，与通过重组DNA载体的体 外表达产生的其它生物制剂不同，IgG是从人血液和血浆供体中分级分离得到。因此，可商 购的IgG的水平受到血液和血浆供体可资供应量的限制。
[0007]若干个因素促进对IgG的需求，包括对IgG治疗的认可、对IgG治疗有效的其它 适应症的鉴定以及患者诊断和IgG处方的增加。值得注意的是，在1990年和2009年之 间全球对IgG的需求已增长四倍以上，并且以每年约7%至10%的速率继续增加 （Robert P.，Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2〇〇9)359-367)。例如，澳大利亚国家血液管理局 报道，澳大利亚在2008-2009财年对IgG的需求增加10. 6% (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009)。
[0008] 部分由于全球需求的增加和免疫球蛋白产品可资供应量的波动，若干个国家（包 括澳大利亚和英国）已开始实施需求管理程序，从而在产品短缺期间保护这些产品对需求 最商的患者的供应。
[0009] 在2〇〇7年已报道，对两千六百五十万升血浆进行分级分离，产生75. 2公吨IgG，平 均产率为2_ 8克/升（Robert P·，如前所述）。据同一报道评估，到2012年预期全球IgG产 率将增加至约3· 43克/升。然而，由于全球对IgG的需求持续增长（预期从现在起至2015 年每年增长约7%至13% )，因此需要进一步提高IgG总体产率来满足全球需求。
[0010] WG产品的市场供应商使用多种IgG制备方法。现行IgG生产方法的常见问题是 在纯化过程期间IgG大量损失，据估算至少为起始材料中总IgG含量的30%至35%。一个 挑战在于维持病毒灭活的质量和除去可导致不良反应的杂质，同时提高增加 IgG产率的过 程效率。在IgG的当前生产水平下，即便产率的较小增加实际上也是极有意义的。例如在 2007年的生产水平下，效率增加 2% (等于增加56毫克/升）将多产生1. 5公吨IgG。 [0011] 在一系列关于血清和血浆蛋白质的制备和特性的已出版学术论文的第四期中， Cohn等人，（J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3) :459-475)首次描述血浆蛋白质的醇分级分离方 法（方法6)，其使得可分离来自人血浆的富含igG的级分。若干年后，〇ncley等人，（J. Am. Chem. Soc.，1949, 71 (2) :541-550)基于Cohn的方法进行了扩展，其公开了使得可分离更纯 净的IgG制剂的方法（方法9)。
[0012] 尽管这些方法为源自血浆的血液蛋白质的整个工业奠定了基础，但这些方法 不能提供具有足够高纯度的IgG制剂来治疗若干种免疫相关的疾病，包括川崎综合症 (Kawasaki syndrome)、免疫性血小板减少性紫癜和原发性免疫缺陷。因此，研发出采 用诸如离子交换色谱的各种技术的其它方法来提供较高纯度的IgG制剂。Hoppe等人， (Munch Med Wochenschr 1967(34) :1749-1752)、Falksveden(瑞典专利号 348942)以及 Falksveden 和 Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)首先采用离 子交换色谱来实现此目的。
[0013] 用于纯化源自血浆的免疫球蛋白的多种现代方法采用与柱色谱偶联的沉淀步骤， 诸如辛酸盐沉淀（Lebing 等人，Vox Sang 2003(84):193-201)和 Cohn 级分（1+)11+111 乙 醇沉淀（Tanaka 等人，Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30)。最近，Teschner 等人（Vox Sang, 2007(92) :42-55)描述生产10% IgG产品的方法，其中首先从混合血浆中除去冷冻沉 淀物，然后进行经过修改的Cohn-Oncley冷乙醇分级分离，之后对中间体进行S/D处理，进 行离子交换色谱，纳米过滤，并且任选地进行超滤/渗滤。
[0014] 尽管这些IgG分离方法提供了纯度、安全性和产率，但仍可提高从血浆回收的IgG 的产率。例如，Teschner等人报道，其方法使IgG产率提高65% (Teschner等人，如前所 述）。根据各种血浆产品会议期间的报道，大规模制备IgG(诸如Baxter、CSL Behring、 Upfront Technology、Cangene、Prometric BioTherapeutics 和 Finnish Red Cross)的平 均产率在最终容器中在约61 %至约65%的范围内。虽然优于前面采用的方法，但此IgG回 收的量仍表示在分离过程中存在于混合血衆级分中的1亦损失至少约三分之一。
[0015] 由于用于生产血浆衍生的产品的可用的血浆供应有限，因此通过将纯化并入单一 框架可实现从常见起始血浆库分离若干血液蛋白质。例如，通常通过形成Cohn级分II+III 沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀物A来富集IgG，然后将沉淀物相应的上清液用于生产 α-卜抗胰蛋白酶（A1PI)和白蛋白。类似地，已经描述了用于从生产IgG免疫球蛋白期间 形成的副产物中生产因子Η的几种方法，包括 W02008/113589和W0 2011/011753。
[0016] 因此，需要生产治疗性IgG产品的改进的和更有效的方法。此外，这些方法也应允 许从单一血浆源中生产其它血浆衍生的产品。本发明通过提供产率为高于当前可获得的产 率大约20%至25%的IgG分离方法以及从该方法中提供的IgG组合物来满足这些及其它 需求。有利地，本文提供的方法允许共分离其它重要的治疗性血浆衍生蛋白，包括α-l-抗 胰蛋白酶（Α1ΡΙ)、因子Η、间-α -抑制剂蛋白质（Ialp)、凝血酶原复合物、因子VII (FVII)、 因子VIII (FVIII)、抗凝血酶III (ATIII)、纤维蛋白原、丁酰胆碱酯酶等。
[0017] 发明概述
[0018] 生产IVIG和α-l-抗胰蛋白酶（A1PI)的现行方法依赖于多个蛋白质沉淀步 骤以从人血浆中发现的其它成分中分离免疫球蛋白IgG和Α1ΡΙ。例如，许多生产商使用 Cohn-Oncley方法6的变量，其中采用三个初始醇沉淀步骤。第一沉淀步骤（称为级分I沉 淀）在高pH(7. 2)和低乙醇浓度（8-10% v/v)下进行以从IgG和A1PI中沉淀诸如纤维蛋 白原和因子ΠΙΙ的蛋白质，而IgG和A1PI保留在上清液中。然后在第二沉淀反应中使IgG 从级分I上清液中沉淀，称为级分II+III沉淀，其在温和pH(6. 8)和高乙醇浓度（20-25% ) 下进行。大部分A1PI保留在级分II+III沉淀反应的上清液中，如随后从第三初始沉淀反 应的白蛋白中分离，称为级分I-IV-1沉淀，其在低pH(5. 2)和中等乙醇浓度（18%)下进 行。
[0019] 不幸的是，由于上述Cohn-Oncley方法以及采用四个初始沉淀以使IgG和A1PI分 级分离、在一系列复杂的沉淀反应中分离单一成分的可比较的Kistler-Nitschmann过程， 分级分离是不充分的。在这些初始沉淀步骤中IgG和A1PI产率的显著降低可归因于部分 沉淀成非目标级分以及目标级分的不完全沉淀。例如，IgG在某种程度上与级分I沉淀物 中的纤维蛋白原和因子XIII共沉淀并且一些IgG未被级分II+III沉淀所沉淀。溶解的级 分II+III沉淀物澄清后，IgG产率通常为存在于起始Cohn池的IgG的75%和85%之间。 因此，在这两个分级分离步骤后，损失起始材料的总IgG含量的15%至25%。
[0020] 通过不再需要多个初始沉淀步骤，本公开改进从混合血浆中对IgG和A1PI的 回收。相反，本文所述方法依赖于单一初始沉淀步骤，该步骤捕获在级分I、级分Π+ΙΙΙ 和级分IV-1沉淀物组合中通常沉淀的所有蛋白质。本文中此单一沉淀步骤称为"级分 I+II+III+IV-1沉淀"、"级分I-IV-1沉淀"或"初始低pH、高醇沉淀"。有利地，发现可以从 级分I-IV-1沉淀物中有效提取IgG和A1PI而不使用随后的蛋白质沉淀。此外，发现级分 I-IV-1沉淀物含有原料血浆的几乎所有IgG和A1PI含量，而白蛋白保留在上清液中。总 之，这些优点导致这些重要的商业产品的总回收量显著增加。
[0021 ] 如实施例所示，在从冷冻贫乏的血菜（cryo-poor plasma)纯化IgG中使用 低PH、高醇沉淀步骤（级分Ι-IV-l沉淀）作为初始步骤，允许生产药用级IgG组合物， 具有4.3-4. 7g IgG/L原料血浆的前所未有的产率。这些产率代表与最先进的生产过 程相比产率大约增加20%至25%，所述最先进的过程诸如用于从相同血浆类型中生产 GAMMAGARD LIQUID? 的那些过程（Baxter International ;Deerfield，IL)。
[0022] 因此，在其它方面，本发明提供新的血浆分级分离过程，该过程在初始步骤将血浆 或冷冻贫乏的血浆分离成级分Ι-IV-l沉淀和级分i-iv-i上清液。级分I-IV-1沉淀物含 有几乎所有免疫球蛋白（例如，IgG、IgA和IgM)和α 1弹性蛋白酶抑制剂（A1PI)，而上清 液主要含有白蛋白。
[0023] 一方面，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所 述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中从冷冻贫乏的血浆中共沉淀免疫球蛋白和 α_1-抗胰蛋白酶（A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；(b)使第一沉淀物中的免疫球 溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含剋"的不溶性部分的第一悬 ; (C)从第一悬浮液的不溶性部分中分离第一悬浮液的可溶性部分；和（d)回收第一悬 浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。
[0024]在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤是醇沉淀步骤。
[0025]在上述方法的一个实施方案中，醇沉淀步骤包括在pH为5至6时将乙醇加至冷 冻-贫乏的血浆中以得到20%至30%乙醇（v/v)的终浓度。
[0026]在上述方法的一个实施方案中，在第一沉淀步骤中乙醇的终浓度为25±4%。在上 述方法的了个实施方案中，乙醇的终浓度为25±3%。在上述方法的一个实施方案中，乙醇 的终浓度为 25±2%。在上述方法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为25±1%。在上述方 法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为 25%。
[0017]、在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤的PH为5·5±0· 4。在上述方法的一 个实施方J中，pH为5.5±〇·3。在上述方法的一个实施方案中，邱为 5.5土〇·2。在上述方 法的一"^头施方案中，PH为5. 5±0. 1。在上述方法的一个实施方案中，邱为5. 5。
[0028]在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤的持续时间保持ρΗ。
[0029]在上述方法的一个实施方案中，第一个醇沉淀步骤包括通过喷雾加入醇。 =〇3〇^在^方法的一个实施方案中，第一个醇沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入 酉^二在,头施方案中，在多于一个位点将醇引入到该溶液。在一个实施方案中，在多个 弓溶液。在具体的实施方案中，加人醇的多个位点位于或接近叶轮或其 =个实施方案中，通过包括多个开口的^^散器端口将醇引入到该溶液。在 施z木中，扩散器端口的多个开口中的-个或多个各自的开口位于或靠近叶轮或 其它分散兀件。 法的了个实施方案中，在温度为-扣至-抓下进行第-沉淀步骤。在 述f法^二头施方案中，在温度为-5Γ至-9°C下进行第-沉淀步骤。 2述$的了个实施方案中，用礼至60L缓冲液/kg沉淀物悬浮第-沉淀物。 万H: ?施方案中，用8LM15L缓冲液/kg沉淀物悬浮第-沉淀物。 的入山ft的-个实施方案中，第一悬浮液具有的PH为4.0至5· 4。在上述方法 的-个头施万案中：第-悬浮液具有的PH为4. 7至5. !。 f的-个实施方案中，第一悬浮液具有白勺电导率为0mS/cm S 4mS/cm。在 女^头施方案中，第一悬浮液具有的电导率为 0· 5mS/cm 至 2mS/cm。 冲液中。述万法的一个实施方案中，第一沉淀物悬浮于包含乙酸盐和/或磷酸盐的缓 =悬实施方案中，通过离心或过滤从第一悬浮液的不溶性部分中分 嫌雜巾，鮮-辦細稍性部分巾分麟-悬浮液的 )使细碎二氧化桂（Si〇2)与第-悬浮液混合；和⑶从悬浮液 个实施方案中，细碎二氧化娃（_具有的平均比表面积为 _9] *上述方法的-个实施方案中，在版心第-沉淀物至8喊g第一沉淀物的终 浓度下将细碎二氧化硅（Si〇2)加至第一悬浮液中。
[0040]在上述方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中在 pH为5. ^和5_ 7之间并且温度在-6。<：和-8?之间用24%和26%之间的醇从冷冻贫乏的血 菜中沉淀免疫球蛋白以形成第一沉淀物和第一上清液； (b)将第一沉淀物悬浮以形成第一 液；(j ^细碎二氧化硅（Si〇2)处理第一悬浮液；(d)从第一悬浮液的不溶性级分中分 离第一悬浮液的可溶性级分；和（e)回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫 球蛋白组合物。
[0041]在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于C〇hn池中 用于步骤（a)的IgG的至少90%的免疫球蛋白含量。
[0042]在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于Cohn池中 用于步骤（a)的IgG的至少95%的免疫球蛋白含量。
[0043]在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(f)在第二沉淀步骤中 从第:悬浮?夜的可溶性级分中沉淀免疫球蛋白以得到第二沉淀物和第二上清液；(g)将第 二沉淀物悬浮以形成第二悬浮液；和（ h)回收第二悬浮液的可溶性级分，从而形成进一步 富集的免疫球蛋白组合物。
[0044]在上述方法的一个实施方案中，第二沉淀步骤是醇沉淀步骤。
[0045]在上述$法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括在pH为6. 5和7. 5之间将 乙醇加至第一悬浮液的可溶性级分中以得到22%和28%乙醇之间的终浓度。
[0046]在上述方法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括通过喷雾加入醇。
[0047]在上^方法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入 醇。在力一个头施方案中，在多于一个位点将醇引入到该溶液。在一个实施方案中，在多个 小端口将醇引入到该溶液。在具体的实施方案中，加入醇的多个位点位于或接近叶轮或其 它分散元件。在另一个实施方案中，通过包括多个开口的扩散器端口将醇引入到该溶液。在 具体的实施方案中，扩散器端口的多个开口中的一个或多个各自的开口位于或靠近叶轮或 其它分散元件。
[0048]在上述方法的一个实施方案中，第二沉淀步骤在-3Γ和-?ο?之间的温度下进 行。
[0049]在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于冷冻贫乏的 血浆中用于步骤（a)的至少卯^的〗^含量。
[0050]在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于冷冻贫乏的 血浆中用于步骤（a)的至少95%的IgG含量。
[0051]在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括阴离子交换色谱富集步骤。
[0052]在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括阳离子交换色谱富集步骤。
[0053]在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括病毒灭活或除去步骤。
[0054]在上述方法的一个实施方案中，该方法包括溶剂/去污剂（S/D)病毒灭活步骤。 [0055]在上述方法的一个实施方案中，该方法包括纳米过滤步骤。
[0056]在上述方法的一个实施方案中，该方法包括在pH为4. 0至5. 0并且温度为20?至 40°C下将组合物孵育至少-周的步骤。
[0057]在上述方法的一·>实施方案中，最终富集的IgG组合物包含至少98% IgG。 冻-贫乏的血浆 头施万案中，该万法广生至少4g IgG/L用于步骤（a)的冷 細-她方純繼产生至少 4.25g IgG/L用于步骤（a)的冷 rkSf法的-个实施方案中，该方法产生至少4· 5g IgG/L用于步骤（a)的冷 H抗方案巾，从第―悬浮賴不雜级分巾进-步纯化 =〇二3]在上述方法的个实施方案巾，从第―尉糧的不溶_分巾进-步纯化纤维蛋 臼原。 ?'? f ft施的-个实施方案中，从第-悬浮液的不游fe级分中进-频化因子H。 5 6 5 B m =法的-个实施方案中，从第-悬浮_不溶性级分中进-步纯化 间_α-胰蛋白酶抑制剂蛋白（ΙαΙρ)。
[0066]在上述方法的一个实施方案中，用细碎二氧化硅（Si〇2)处理第一悬浮液的不溶性 级分。 _7] #上述方法的一个实施方案中，从第一上清液中进一步纯化白蛋白。
[0068] 一方面，本发明提供通过根据权利要求1至63中任一项所述的方法制备的富集的 免疫球蛋白组合物。
[0069]- -方面，本发明提供治疗有此需要的个体的免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫性疾病 或急性感染的方法，该方法包括给所述受试者施用根据权利要求64所述的富集的免疫球 蛋白组合物。
[0070] 附图简述
[0071] 图L根据本文所述的一个实施方案的血浆分级分离方案图。
[0072] 发明详述
[0073] I.引言
[0074]在其它方面，本发明提供用于从混合血浆中分离治疗性蛋白质的更有效的方法。 本文提供的用于混合血浆分级分离的方法提供多个重要的治疗性血浆衍生的包括免疫球 蛋白和ct-1-抗胰蛋白酶（A1PI)的血液蛋白的更高产率。在特别重要的方面，本发明提 供与用于生产治疗性IgG组合物的最先进的方法相比，显著增加从血浆分离的免疫球蛋白 G(IgG)产率的方法。在一个实施方案中，通过在低PH、高醇条件下从起始血浆样品（这里 称为"Cohn池"）中沉淀免疫球蛋白和AIP1而得到这些提高的产率。低pH、高醇沉淀步骤 导致大规模捕获起始Cohn池的免疫球蛋白组合物。与最先进的免疫球蛋白生产过程相比， 本文提供的方法显著减少在血浆的上游分级分离期间损失的免疫球蛋白的量。
[0075] 本发明的方法减少在用于治疗性施用的足够高的纯度下从人血浆中分离蛋白质 所需的蛋白质沉淀步骤的数量，然而同时增加重要的治疗性血液蛋白质诸如免疫球蛋白 G(IgG)的回收率。具体地，该方法不需要用于来源于Cohn-〇ncley、Kistler-Nitschmann 和Deutsch分级分离方案的生产过程的初始高pH、低醇沉淀步骤（通常称为级分I沉淀）。 相反，本文提供的方法采用分配沉淀物中大部分血浆IgG、〗g A、〗讲和α_1_抗胰蛋白酶 (A1PI)含量和上清液中大部分白蛋白的初始低PH、高醇沉淀步骤（本文称为级分I-IV-1 沉淀）。然后通过各种方法从IgA、IgM和A1PI中分离IgG，得到高产率IgG组合物。与采 用级分I沉淀步骤的方法相比，在初始级分I-IV-1沉淀步骤中大规模捕获IgG增加生产过 程的终产率为至少10%至25%。
[0076] 在1946年，E. J. Cohn首先建立使用乙醇而不是盐用于血浆分级分离的方法。从 此，乙醇沉淀已成为大规模生产血浆衍生的产品（诸如IgG和A1PI)的所选方法。通常，这 些生产过程采用一系列乙醇分级分离步骤，提供各种血浆衍生的血液蛋白质的粗级分，其 通过各种不同的下游方法/技术进一步富集。
[0077] 最初开发Cohn方法以通过用醇分级沉淀获得相对高（95% )纯度的白蛋白。然 而，通过Oncley等人、Deutsch等人以及Kistler和Nitschmann可以快速实现：来自Cohn 方法6号的特定蛋白沉淀物（级分Π +ΙΙΙ)可被用作起始材料用于高度富集的免疫球蛋白 组合物的纯化。为了获得静脉内施用IgG组合物所需的更高纯度和安全性，在醇分级分离 步骤后几种纯化和精制（polishing)步骤（例如一般吸附或所有不同的色谱技术、交叉流 过滤等）被加至IgG生产过程。
[0078] 通常，IgG生产依赖于Cohn方法6级分II+III沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀 物A作为起始材料用于下游处理。通过两步过程形成两种级分，其中：i.)通过在高ρΗ(7· 2) 与低乙醇浓度（8-10% ν/ν)下进行的初始沉淀步骤（级分I沉淀）除去诸如纤维蛋白原 和因子XIII的蛋白；和ii.)在pH 6. 8和20-25% (ν/ν)乙醇（级分Π+ΙΙΙ)或在ρΗ5· 85 和19%乙醇（ν/ν)乙醇（沉淀物Α)下从级分I上清液中沉淀IgG，而白蛋白和大部分Α1ΡΙ 保留在上清液中。然而，使用级分Π+ΙΙΙ沉淀物或沉淀物A作为用于生产IgG组合物的起 始材料导致在如上所述过程的几个步骤损失IgG。
[0079] 为了克服这些问题，本发明人已开发使免疫球蛋白和A1PI共沉淀的初始纯化步 骤，以提供含有原料血浆的几乎所有IgG和A1PI含量的起始材料，而白蛋白保留在上清液 中。此分级分离步骤基本上将如Oncley等人（同上）所述的分级沉淀步骤I、II+III和 IV-1合并为单一沉淀反应，本文称为级分I+II+III+IV-1 (或级分I-IV-1)沉淀。
[0080] -方面，本发明提供使用级分I-IV-1沉淀物作为起始材料用于生产用于静脉内、 皮下或肌内施用的高产率免疫球蛋白组合物的过程。在各种实施方案中，该方法还包括将 α-1-抗胰蛋白酶（A1PI)分离成从级分I-IV-1沉淀物中提取免疫球蛋白期间形成的悬浮 液的不溶性级分。然后分离的不溶性级分可被用作生产血浆衍生的Α1ΡΙ组合物的起始材 料。
[0081] 在一个实施方案中，本发明提供生产从混合血浆分离的蛋白质的治疗性组合物的 方法。在一些实施方案中，这些生产方法包括与传统方法相比，增加各种血液蛋白质回收的 初始低pH、高醇（例如，乙醇）沉淀步骤。在一些实施方案中，该方法用于生产含有分离自 人血液、血浆的免疫球蛋白（例如，IgG)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶（A1PI)、丁酰胆碱酯酶、 因子Η或间-α-胰蛋白酶抑制剂（ Ια I)蛋白或其衍生物的一种或多种治疗性组合物。
[0082] II.定义
[0083] 如本文所用，术语"IgG治疗"通常是指给患者静脉内、皮下或肌内施用IgG免疫 球蛋白组合物用于治疗多种病状（诸如免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病）的治疗方法。 IgG免疫球蛋白通常混合并由血浆制备。可以使用完整抗体或片段。IgG免疫球蛋白可被 配制成更高浓度（例如，大于10%)用于皮下施用，或配制用于肌内施用。这对于制备成对 特异性抗原（例如，Rho D因子、百日咳毒素、破伤风毒素、肉毒中毒毒素、狂犬病等）具有 高于平均滴度的特定IgG制剂特别常见。
[0084] 如本文所用，"冷冻-贫乏的血浆"是指除去在接近冷冻的温度下（例如，在温度低 于约10°c，优选温度不高于约6°C )通过使血浆或混合血浆解冻而形成的冷冻沉淀物之后 生成的上清液。在本发明的上下文中，血浆可以互换地指回收的血浆（即，已经从来自体内 的全血分离的血浆）或原料血浆（即，通过血浆取出法收集的血浆）。虽然也可以使用新鲜 血浆，但冷冻沉淀通常是例如通过使先前冷冻的混合血浆解冻来进行，该血浆已被测定安 全和质量考虑因素。在低温下使冷冻的血浆完全解冻后，在冷却下（例如，< 6°C )通过离 心或过滤从液体上清液中分离固体冷冻沉淀物。
[0085] 如本文所用，"Cohn池"是指用于分级分离血浆样品或混合血浆样品的起始材料。 Cohn池可以包括一个或多个全血浆、冷冻-贫乏的血浆和已经历预处理步骤的冷冻贫乏的 血浆。在某些实施方案中，Cohn池是在预处理步骤中，例如，通过吸附到固相（例如，氢氧 化铝、细碎二氧化硅等）或色谱步骤（例如，离子交换或肝素亲和色谱）已从中除去一个或 多个血液因子的冷冻贫乏的血浆样品。各种血液蛋白，包括但不限于因子VIII抑制剂旁路 活性（Factor Eight Inhibitor Bypass Activity) (FEIBA)、因子 IX-复合物、因子 VII、凝 血酶原复合物和/或抗凝血酶III，可以在分级分离之前从冷冻贫乏的血浆样品中分离。
[0086] 如本文所用，术语"富集的组合物"是指从血浆样品中分离的蛋白质组合物，其中 所述蛋白质的纯度高于起始血浆样品中的蛋白质纯度。在一个实施方案中，富集的组合物 中的蛋白质比起始血浆样品中的蛋白质纯至少25%。在其它实施方案中，富集的组合物比 起始血浆样品纯至少50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或 更多。例如，与起始血浆样品（其中10%的总蛋白为IgG)相比，富集的IgG组合物（其中 70%的总蛋白为IgG)为7倍富集。
[0087] 如本文所用，术语"扩散加入"是指以离域形式向液体体系中加入物质的方法。例 如，通过喷雾或使液体（例如，醇、pH调节剂、溶剂、去污剂或其它液体）雾化到液体系统 (例如，血浆级分）、在多个位点将液体引入系统、使用扩散器端口将液体引入系统、位于或 靠近叶轮或其它分散元件将液体引入或将以固态存在的化学物质分散在液体系统的扩展 区域，可以实现扩散加入。
[0088] 如本文所用，术语"喷雾"是指例如，在醇沉淀步骤（诸如级分I-IV-1沉淀步骤） 期间，以液体物质的细液滴或雾形式将液体物质递送至系统的方法。喷雾可以通过任何加 压装置来实现，诸如具有喷头或喷嘴并且手动或自动操作以产生液体的细雾的容器（例 如，喷雾瓶）。通常，进行喷雾的同时将接收液体物质的系统连续搅拌或混合以确保液体在 系统内快速和均匀分布。
[0089] 如本文所用，术语"溶剂"包括能够溶解或分散一种或多种其它物质的任何液体物 质。溶剂在性质上可以是无机的，诸如水，或者它可以是有机液体，诸如乙醇、丙酮、乙酸甲 酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如在术语"溶剂去污剂处理"中所用，溶剂表示有机溶剂（例 如，三-N-磷酸丁酯），其为用于使溶液中脂质包膜的病毒灭活的溶剂去污剂混合物的一部 分。
[0090] 如本文所用，在本申请中术语"去污剂"与术语"表面活性剂"或"表面活性剂"互 换使用。表面活性剂通常为两亲性，即，含有疏水性基团（"尾部"）和亲水性基团（"头 部"）的有机化合物，这使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水中。通过其头部形式上带电基 团的存在可以将表面活性剂分类。非离子型表面活性剂在其头部不具有带电基团，而离子 型表面活性剂在其头部带有净电荷。两性离子型表面活性剂含有具有两个相反的带电基团 的头部。常见表面活性剂的一些实例包括：阴离子型（基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离 子）：全氟辛酸盐（PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐（PFOS)、十二烷基硫酸钠（SDS)、十二烷 基硫酸铵和其它烷基硫酸盐、十二烷基醚硫酸钠（也称为月桂基醚硫酸钠或SLES)、烷基苯 磺酸盐；阳离子型（基于季铵阳离子）：溴化十六烷基三甲铵（CTAB)即十六烷基三甲基铵 溴化物和其它烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡啶（CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺（POEA)、 苯扎氯铵（BAC)、苄索氯铵（ΒΠ );长链脂肪酸及其盐：包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐、己酸、庚 酸、壬酸（nanoic acid)、癸酸等；两性离子型（两性的）：十二烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜 菜碱、可可两性甘氨酸盐；非离子型：烷基聚（环氧乙烷）、聚烷基酚（环氧乙烷）、聚（环 氧乙烷）和聚（环氧丙烷）的共聚物（商业上称为泊洛沙姆（Poloxamers)或泊洛沙胺 (Poloxamines))、烷基聚葡萄糖苷（包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷）、脂肪醇（例如，鲸蜡 醇和油醇）、椰油醜胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酷（Tween 2〇、Tween 8〇等）、Triton去 污剂和十二烷基二甲基氧化胺。
[0091] 通过"治疗有效量或剂量"或"足够/有效量或剂量"意指产生施用效果 的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并且本领域技术人员将使用已知技术（参 见，例如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第 1-3 卷，1992) ;Lloyd，The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ；Pickar, Dosage Calculations(1999);和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版，2 003, Gennaro, Ed.，Lippincott, Williams&Wilkins)来确定。
[0092] 如本文所用，术语"初始低PH、高醇沉淀"和"级分I-IV-1沉淀"可互换地指在最 终醇浓度（通常为乙醇）为20%至30% (v/v)且pH为5· 0至6· 0时从Cohn池沉淀蛋白 质。通常，所得的级分I-IV-1沉淀含有起始Cohn池的至少90%的免疫球蛋白含量，优选起 始Cohn池的至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%的免疫球蛋白含量。在优选的实 施方案中，免疫球蛋白包括IgG免疫球蛋白。在另一个优选的实施方案中，在级分I-IV-1 沉淀中α-l-抗胰蛋白酶（A1PI)与免疫球蛋白共沉淀。
[0093] III.血浆分级分离
[0094] 一方面，本发明提供采用初始沉淀步骤从混合血浆中分级分离治疗性蛋白质的方 法，其中起始血浆的大部分免疫球蛋白和α-l-抗胰蛋白酶（Α1ΡΙ)含量沉淀并且起始血浆 的大部分白蛋白含量保留在上清液中。起始于这种初始沉淀步骤，许多重要的治疗性血液 蛋白质可以以高回收率生产。
[0095] 在一个实施方案中，本发明提供将血浆样品中的血液蛋白质分级分离的方法，所 述方法包括在低ΡΗ、高醇条件下从起始血浆中沉淀免疫球蛋白和Α1ΡΙ。这种低pH、高醇沉 淀步骤导致形成沉淀物（本文称为级分I-iv-i沉淀物）和上清液（本文称为级分ι-ιν-1 上清液）。
[0096] 级分I-IV-1上清液将含有起始血浆的至少70%、优选至少80%、最优选至少90% 的白蛋白含量。因此，此上清液可被用作用于生产药物白蛋白组合物的起始材料。
[0097] 级分I-IV-1沉淀物将含有起始血浆的至少90 %、优选至少95 %、更优选至少 98%、最优选至少99%的免疫球蛋白含量。在具体的实施方案中，级分I-IV-1沉淀物含有 起始血浆的至少9S%、优选 99%的IgG含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物免疫球 蛋白组合物的起始材料。在一个实施方案中，级分I-IV-1沉淀物被用作用于生产药物IgG 组合物的起始材料。在又一个实施方案中，级分I-IV-1沉淀物被用作用于生产含有超过一 种免疫球蛋白亚型的药物免疫球蛋白组合物的起始材料。
[0098] 同样，级分I-IV-1沉淀物将含有起始血浆的至少9〇%、优选至少95%、更优选至 少97%、最优选至少98%的A1PI含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物A1PI组合 物的起始材料。
[0099] 级分I-IV-1沉淀物还将含有起始血浆的至少70 %、优选至少SO %、更优选至少 90%、最优选至少的因子Η含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物因子Η组合物 的起始材料。
[0100] 级分I-IV-1沉淀物还将含有起始血浆的至少70%、优选至少80%、更优选至少 9〇%、最优选至少95%的间-α-抑制剂（Ialp)含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药 物Ialp组合物的起始材料。
[0101] 一方面，本发明提供用于从在级分I-IV-1沉淀物中发现的A1PI中分离免疫球蛋 白的方法。在一个实施方案中，该方法包括将免疫球蛋白溶解于级分I-IV-1沉淀物的悬浮 液中，同时将A1PI保留在悬浮液的不溶性部分中，并且然后分离可溶性和不溶性部分，例 如通过过滤或离心。在一个实施方案中，该分离是借助于在分离可溶性和不溶性部分之前 用细碎二氧化硅处理级分I-IV-丨悬浮液。不受理论的约束，二氧化硅可结合与免疫球蛋白 共溶解的A1PI，提高分配到悬浮液的不溶性部分的A1PI的量。
[0102] 此外，已知在某些条件下因子Η和Ialp结合颗粒二氧化硅（参见， W0/2011/011753、PCT/US2011/45099 和 PCT/US2011/038247 ;其公开内容出于所有目的据 此以引用的方式整体特别并入本文）。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于从发现于 级分I-IV-1沉淀物中的A1PI、因子Η和Ialp中分离免疫球蛋白的方法，所述方法包括将级 分I-IV-1沉淀物悬浮于足以溶解免疫球蛋白的水或低电导率缓冲液中；用二氧化硅处理 该悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离可溶性部分，其中可溶性部分含有免疫球蛋白 并且不溶性部分含有A1PI、因子Η和Ialp。
[0103] 在以上提供的方法的一个实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的可溶性部分 含有起始血浆样品的至少80%的IgG含量。在优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的 分离的可溶性部分含有起始血浆样品的至少90%的IgG含量。在更优选的实施方案中，级 分I-IV-1悬浮液的分离的可溶性部分含有起始血浆样品的至少95%的IgG含量。在其它 实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的可溶性部分含有起始血浆样品的至少80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更多的IgG含量。
[0104] 在以上提供的方法的一个实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分 含有起始血浆样品的至少70%的A1PI含量。在优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的 分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少80%的A1PI含量。在更优选的实施方案中， 级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少90%的A1PI含量。在 更优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少 95%的A1PI含量。在其它实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血 浆样品的至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的 A1PI 含量。
[0105] 使用初始大规模沉淀步骤（例如，级分I-IV-1沉淀）分级分离的血液蛋白质可以 被例如，沉淀（例如，醇分级分离或聚乙二醇分级分离）、色谱法（离子交换色谱、亲和色谱、 免疫亲和色谱等）、过滤（超滤/渗滤、纳米过滤）、超离心、电泳制备等的适当方法进一步 富集。
[0106] A.冷冻-贫乏的血浆的制备
[0107] 用于制备浓缩的IgG组合物的起始材料通常由回收的血浆（即，己经从来自体内 的全血分离的血浆）或原料血浆（即，通过血浆取出法收集的血浆）组成。纯化过程通常 是以使预先冷冻的混合血浆解冻开始，该血浆已被测定安全和质量考虑因素。通常在温度 不高于6°C进行解冻。在低温下使冷冻的血浆完全解冻后，在冷却下（例如，<6°C)进行 离心以从液体上清液中分离固体冷冻沉淀物。或者，通过过滤而不是离心可以进行分离步 骤。然后将液体上清液（在通过离心从新鲜的解冻血浆中除去冷的不溶性蛋白质之后，也 称为"冷冻-贫乏的血浆"）在下一步骤进行处理。可在此时进行各种附加步骤用于分离因 子VIII抑制剂旁路活性（FEIBA)、因子IX-复合物、因子VII、抗凝血酶III、凝血酶原复合 物等。
[0108] B.第一沉淀事件-级分I-IV-1沉淀
[0109]在一个实施方案中，本发明提供将血浆样品中的血液蛋白质分级分离的方法，所 述方法包括在第一沉淀步骤中在低pH、高醇条件下使起始血浆中的免疫球蛋白和A1PI沉 淀。这种低pH、高醇沉淀步骤导致形成沉淀物（级分i-iv-i沉淀物）和上清液（级分 I-IV-1上清液）。
[0110] 在一个实施方案中，通过在pH 5· 0和6. 0之间将乙醇与起始血浆池（Cohn池）混 合至终浓度为2〇%至3〇% (v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn 池混合至终浓度为25±3% (v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与C〇hn池混合至终浓度 为25±2% (v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1% (v/v)。 在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25% (v/v)。同样，在一个实施方 案中，第一沉淀步骤在pH为5. 5±0_ 5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在PH 为5. 5±0_ 4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在ρΗ*5. 5土〇·3下进行。在另 一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为δ. 5±〇· 2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀 步骤在pH为5· 5±0· 1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5. 5下进行。 在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166,如表1、表 1、表1、表1、表1、表1和表1所示。
[0111] 表丨·用于C〇hn池的低PH、高醇沉淀的PH和最终乙醇浓度的组合。
[0112]
【权利要求】
1. 一种用于从Cohn池生产富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 在第一沉淀步骤中通过在pH为5. 0至6. 0以20%至30% (v/v)的终浓度向所述 Cohn池中加入乙醇，从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-l-抗胰蛋白酶（A1PI)，以形成第 一沉淀物和第一上清液； (b) 使所述第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部 分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液； (c) 从所述第一悬浮液的所述不溶性部分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性部分； 和 (d) 回收所述第一悬浮液的所述可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±4%。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±3%。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±2%。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±1%。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中乙醇的终浓度为25%。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述pH为5. 5±0. 4。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述pH为5. 5±0. 3。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述pH为5. 5±0. 2。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述pH为5. 5±0. 1。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中所述pH为5. 5。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤的持续时间保 持所述pH。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括通过扩散加 入来加入所述醇。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述扩散加入包括喷雾。
15. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括在邻近叶轮 的位点加入所述醇。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤在-3°C 至-l〇°C的温度下进行。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述第一沉淀步骤在-5°C至-9°C的温度下进 行。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀物用4L至60L缓冲 液/kg沉淀物来悬浮。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述第一沉淀物用8L至15L缓冲液/kg沉淀物 来悬浮。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的pH为4. 0 至 5. 4。
21. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的pH为4. 7 至 5. 1。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的电导率为 OmS/cm 至 4mS/cm〇
23. 根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的电导率为 0· 5mS/cm 至 2mS/cm〇
24. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀物悬浮于包含乙酸 盐和/或磷酸盐的缓冲液中。
25. 根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中通过离心或过滤从所述第一悬浮 液的所述不溶性部分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性部分。
26. 根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的所述不溶性 部分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性部分的所述步骤包括： (i) 使细碎二氧化硅（Si02)与所述第一悬浮液混合；和 (ii) 从所述悬浮液中分离所述Si02。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细碎二氧化硅（Si02)具有的平均比表面积 为 350m2/g 至 410m2/g。
28. 根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中以15g/kg第一沉淀物至80g/kg 第一沉淀物的终浓度下将所述细碎二氧化硅（Si02)加至所述第一悬浮液中。
29. 根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤： (a) 在第一沉淀步骤中在pH为5. 3和5. 7之间并且温度在-6°C和_8°C之间用24%和 26%之间的醇从Cohn池中沉淀免疫球蛋白以形成第一沉淀物和第一上清液； (b) 使所述第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液； (c) 用细碎二氧化硅（Si02)处理所述第一悬浮液； (d) 从所述第一悬浮液的所述不溶性级分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性级分； 和 (e) 回收所述第一悬浮液的所述可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。
30. 根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含 有存在于所述Cohn池用于步骤（a)的至少一种免疫球蛋白类型的至少90%的所述免疫球 蛋白含量。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述 Cohn池用于步骤（a)的至少一种免疫球蛋白类型的至少95%的所述免疫球蛋白含量。
32. 根据权利要求30或31所述的方法，其中所述免疫球蛋白类型是IgG。
33. 根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤： (f) 在第二沉淀步骤中从所述第一悬浮液的所述可溶性级分中沉淀免疫球蛋白以得到 第二沉淀物和第二上清液； (g) 使所述第二沉淀物悬浮以形成第二悬浮液；和 (h) 回收所述第二悬浮液的所述可溶性级分，从而形成进一步富集的免疫球蛋白组合 物。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述第二沉淀步骤是醇沉淀步骤。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括在pH为6. 5和7. 5之间将 乙醇加至所述第一悬浮液的所述可溶性级分中以得到22%和28%乙醇之间的终浓度。
36. 根据权利要求34或35所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括通过扩散加入来加入 所述醇。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述扩散加入包括喷雾。
38. 根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括在邻近叶轮 的位点加入所述醇。
39. 根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述第二沉淀步骤在-3°C 和-10°C之间的温度下进行。
40. 根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含 有存在于所述Cohn池用于步骤（a)的至少90%的所述免疫球蛋白G含量。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述 Cohn池用于步骤（a)的至少95%的所述免疫球蛋白G含量。
42. 根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括阳离子交换 色谱富集步骤。
43. 根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括阴离子交换 色谱富集步骤。
44. 根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括病毒灭活和 /或除去步骤。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述方法包括溶剂/去污剂（S/D)病毒灭活步 骤。
46. 根据权利要求44或45所述的方法，其中所述方法包括纳米过滤步骤。
47. 根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述方法包括在pH为4. 0至5. 0 并且温度为20°C至40°C下将所述组合物孵育至少一周的步骤。
48. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述最终富集的IgG组合物包含 至少 98% IgG。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述最终富集的IgG组合物包含至少99% IgG。
50. 根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述方法产生用于步骤（a)的至 少 4g IgG/L Cohn 池。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述方法产生用于步骤（a)的至少4. 25g IgG/ L Cohn 池。
52. 根据权利要求50所述的方法，其中所述方法产生用于步骤（a)的至少4. 5g IgG/L Cohn 池。
53. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的不溶性级分 中进一步纯化α -1-抗胰蛋白酶（A1PI)。
54. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的不溶性级分 中进一步纯化纤维蛋白原。
55. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的不溶性级分 中进一步纯化因子Η。
56. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的不溶性级分 中进一步纯化间-ct -胰蛋白酶抑制剂蛋白质（I α Ip)。
57. 根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中用细碎二氧化娃（Si02)处理所 述第一悬浮液的所述不溶性级分。
58. 根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中从所述第一上清液中进一步纯化 白蛋白。
59. 根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述Cohn池是冷冻-贫乏的血 浆。
60. -种通过根据权利要求1至59中任一项所述的方法制备的富集的免疫球蛋白组合 物。
61. -种治疗有此需要的个体的免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫性疾病或急性感染的方 法，所述方法包括给所述受试者施用根据权利要求60所述的富集的免疫球蛋白组合物。
【文档编号】C07K1/30GK104245730SQ201380020621
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2012年2月23日
【发明者】L·布鲁克施威格, T·贡丁格, J·尼恩贝格尔, W·特施纳, H-P·施瓦茨 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司