制备表面活性肽的方法
【专利摘要】基于SP-C肽和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白的异源表达制备表面活性蛋白C肽(SP-C肽)的方法；该方法中使用的基因构建体，载体和宿主细胞。
【专利说明】制备表面活性肽的方法
[0001] 本发明提供基于重组DNA技术制备表面活性物质-蛋白C肽（SP-C肽）的方法。 本发明还提供用于该方法的基因构建体、载体和宿主细胞。
[0002] 发明背景
[0003] 肺表面活性物质减少肺泡内侧的气液交界面上的表面张力，防止肺在呼气结束时 塌缩。
[0004] 表面活性物质缺乏是早产儿的一种病症，引起呼吸窘迫综合征（RDS)，可以 用从动物肺提取的天然表面活性物质对这种病症进行有效治疗（参见Fujiwara，T. 和 Robertson Β· (1992)于：Robertson, B·，van Golde，L_ M. G.和 Batenburg，B. (编著）Pulmonary Surfactant:From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, pp. 561-592) 〇
[0005] 这些表面活性物质制剂的主要成分是磷脂如1，2-二棕榈酰-Sn-甘油-3-磷酸胆 碱（DPPC)、磷脂酰甘油（PG)和疏水表面活性蛋白B和C(SP_B和SP-C)。
[0006] 蛋白SP-B和SP-C仅构成表面活性物质质量的大约1-2%，但是与纯的脂 类制剂相比，仍然能极大地改善表面活性（参见Curstedt, T. et al. (1987)Eur· J. Biochem. 168, 255-262 ;)。
[0007] SP-C是脂蛋白，由35个氨基酸残基组成，在残基9-34之间具有a -螺旋域（参见 Johansson，J.et al. (1994)Biochemistry 33, 6015-6023)。
[0008] 该螺旋主要由缬氨酰-残基组成，镶嵌在脂双层中，其方向与脂酰链平行（参见 Vandenbussche, et al. (1992) Eur. J. Biochem. 203, 201-209) 〇
[0009] 两个棕榈酰基团与该肽的N-末端部分的位置5和6的半胱氨酸残基共价连接（参 见 Curstedt, T· et al. (1990) Proc. Natl· Acad· Sci. U. S. A. 87, 2985-2989)。
[0010] 位置11和12上的两个保守的带正电荷残基，可能与脂膜的带负电荷的头部基团 相互作用，从而增加其刚性。
[0011] 趋向C-末端，脂-肽相互作用的刚性减少，因为它仅含有小的疏水性残基，使得这 部分在磷脂双层中可能更具有柔性。
[0012] 由于从动物组织中获得的表面活性物质制剂可能表现出某些缺点，如它们获得的 量有限以及它们可能含有致病原以及诱导免疫反应，已经尝试创造通常由合成脂类和合成 的SP-C和/或SP-B蛋白类似物组成的人工表面活性物质。
[0013] 但是，对于合成的SP-C蛋白而言，先前的工作已证明它可能不能像天然肽那样 折叠成最佳表面活性所需要的 α-螺旋构象（参见Johansson, J.et al. (1995)Biochem. J. 307, 535-541)，因此可能不能与表面活性脂类正确地相互作用。
[0014] 为了避免这个问题，已进行了几种尝试来改变序列，例如将天然SP-C中所有的 螺旋Val残基替换成Leu，Leu强烈地有助于形成α -螺旋构象。相应的跨膜类似物， SP-C(Leu)当与适当的磷脂混合物组合时，在气-液交界面上表现出良好的延展。
[0015] W0 2008/044109公开了 SP-C蛋白的肽类似物，被称为SP-C33(Leu)，其具有下述 的单字母氨基酸序列
[0016] IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ ID N0:l)〇
[0017] 该肽可以通过合成方法来制备。传统的合成方法在例如Schroeder et al·，'The peptides'，vol.l，Academic Press，1965 ;Bodanszky et al.，'Peptide synthesis'，Interscience Publisher, 1996 ;Baramy&Merrifield，'The peptides ;Analys is, Synthesis, Biology，，vol. 2, chapter 1，Academic Press, 1980 中描述。
[0018] 所述技术包括在固相中、溶液中进行肽合成，有机化学合成方法，或它们的任何组 合。
[0019] 通过传统技术进行的合成肽如肽SP-C33(Leu)的产生受到它们的高疏水特性的 影响，从而限制了它们的水溶性。
[0020] 所述缺点通过本发明的方法被克服。
[0021] 定义
[0022] 术语"SP-C肽"指天然表面活性蛋白SP-C的结构类似物肽，包括具有与天然蛋白 相比，一个或多个氨基酸被取代和/或缺失的氨基酸序列的肽，只要所述肽在和脂类载体 的混合物中表现出类似的肺表面活性。
[0023] 发明描述
[0024] 本发明的目的是用于SP-C肽生物合成的重组方法，其克服了传统技术的缺陷，并 能够以令人满意的产率获得高纯产物。本发明的方法基于融合蛋白的表达，其中SP-C肽通 过携带蛋白酶切割位点的接头的插入，与麦芽糖结合蛋白（MBP)融合。
[0025] 在一个实施方案中，本发明提供含有编码SP-C肽、MBP蛋白和携带蛋白酶切割位 点的位于SP-C肽和MBP蛋白之间的接头肽的多核苷酸序列的表达盒，所述编码多核苷酸序 列与适合于在原核细胞中表达的启动子序列可操作连接。
[0026] 在一个实施方案中，SP-C肽是SP-C33(Leu) (SEQ ID N0:1)，编码序列是SEQ ID N0:3。在另一个实施方案中，MBP确定为SEQ ID N0:2,其编码序列是SEQ ID N0:4。与野 生型MBP(wt MBP)-即由大肠杆菌天然产生的-MBP相比，麦芽糖结合蛋白SEQ ID N0:2具 有使与直链淀粉的亲和力提高以及使SPC肽更好地折叠的突变。提高的直链淀粉-亲和力 对于由细菌细胞产生的融合蛋白的纯化来说很重要，如下面所讨论的。
[0027] MBP-和SP-C-编码序列优选分别位于表达盒的N-和C-末端。发现这样有利于融 合SP-C肽的正确折叠。
[0028] 在另一个实施方案中，接头肽为10-50个、优选20-40个氨基酸长，并且含有被肠 激酶识别的蛋白水解位点。后者是特异性丝氨酸蛋白酶，在赖氨酸后的特定切割位点进行 切割。此外，接头的编码序列可以含有适合于基因构建体的克隆和处理的一个或多个内切 酶-限制性位点。在优选的实施方案中，接头肽和其编码序列分别被确定为SEQ ID N0:5 和6。
[0029] 根据本发明，可以使用任何适合于在原核细胞中调节异源蛋白表达的启动子。优 选使用诱导型启动子，特别是tac启动子，其被异丙基β-D-1-硫代半麦芽糖苷（IPTG)激 活。
[0030] 表达盒可以进一步包括调节重组蛋白表达的组分，如转录增强子，终止子、起始子 和其它基因控制元件或给重组蛋白赋予结合亲和力或抗原性的元件。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述表达盒的表达载体。优选载体是质粒， 更优选是基于pBR32的质粒，其可以另外含有选择标记例如抗生素抗性编码序列，将重组 蛋白导向分泌途径的分泌信号和允许插入异源序列的合适的限制性位点。
[0032] 在又一个实施方案中，本发明提供SP-C肽的制备方法，其包括下述步骤：
[0033] i)提供携带表达盒的载体，其中所述表达盒含有编码融合蛋白的多核苷酸序列， 所述融合蛋白由SP-C肽、MBP和位于其间并携带蛋白酶切割位点的接头肽组成，如上述所 定义的；
[0034] ii)将所述载体引入到原核细胞中，并在允许表达融合蛋白的条件下维持所述细 胞； 。
[0035] iii)纯化融合蛋白；
[0036] iv)用适当的蛋白酶切割融合蛋白并分离SPC蛋白。
[0037] 细菌细胞特别是大肠杆菌细胞被方便地用于SPC肽的表达。特别优选含有通过表 型选择从而耐受毒性蛋白的基因突变的大肠杆菌株。
[0038] 表达融合蛋白后，使细胞破裂并离心细胞裂解物以分离包含融合蛋白的细胞级 分。
[0039] 融合蛋白的纯化优选使用MBP配体-结合树脂通过亲和层析的方式进行。优选地， 粗细胞提取物被加载到含有用直链淀粉衍生化的琼脂糖树脂的柱上，并用含有合适量麦芽 糖的缓冲液洗脱以从树脂上移除融合蛋白。
[0040] 对融合蛋白的最后切割释放SP-C肽，其随后用传统技术分离。优选使用肠激酶蛋 白酶切割融合蛋白的接头区域，如果存在合适的蛋白酶切割位点的话。
[0041] 与类似的重组系统中测试的其它蛋白标签不同，MBP证明用于表达和后续纯化与 之融合的SP-C肽是特别有效的。
[0042] 实验部分
[0043] MBP融合蛋白的克隆策略
[0044] SP-C33 (Leu)在细菌中以与麦芽糖结合蛋白（MBP)的融合蛋白的形式表达。表达 载体pMALc5e (New England Biolabs)编码MBP并为编码SpC33Leu的DNA片段的框内克 隆提供（5,）AvaI和（3'）BamHI切割位点。表达载体含有氨苄青霉素抗性基因并衍生自 PBR322。MBP和SpC33Leu通过肽接头被连接在一起，所述肽接头含有被肠激酶识别的蛋白 水解位点，所述肠激酶是一种在赖氨酸后特定切割位点（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys丨）进行切 割的特异性丝氨酸蛋白酶。市售的MBP-接头序列由前面加上甲硫氨酸并且最后4个氨基 酸被由pMAL-c5e多接头编码的21个残基加上C-末端甘氨酸取代的来自大肠杆菌的麦芽 糖结合蛋白组成。
[0045] 原始的商业多接头被改造以包含几个新的内切酶限制性位点（SEQ ID N0:5和6)。
[0046] sp-C33(Leu)核苷酸序列在GeneArt?.基因合成服务提供的合适的穿梭载体 中被合成和克隆。由OeneArt?基因合成服务按照大肠杆菌密码子使用频率优化核 苷酸序列。密码子优化仅仅改变核酸序列而不改变编码的氨基酸序列。基因设计和优化 策略使用专有的 GeneOptimizer⑩软件（wo-A-〇4/〇59556 和 wo-A-〇6/oi3i〇3) [Raab D_，Graf M.，Notka F·，Schbdl.T·和Wagner R."The GeneOptimizer Algorithm:using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multi-parameter DNA sequence optimization" Syst Synth Biol· 2010;4:215 - 225 ;Maertens B. ,Spriestersbach A. , von Groll U., Roth U.,Kubicek J. ,Gerrits M. , Graf M., Liss M.，Daubert D·，Wagner R.，和Schafer F."Gene optimization mechanisms:A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli"Protein Science 2010;19:1312-1326]。优化参数包括密码子使用， DNA基序如核糖体进入位点，GC含量和（反向）重复的避免。序列编码用于后续亚克隆的 i) Aval-特异性5'，ii)BamHI-特异性3'末端，iii) SpC33Leu序列之前的肠激酶切割位点， 并提供TAA终止密码子以终止核糖体翻译。Aval和BamHI是限制性内切酶。Aval识别双 链核苷酸序列CYCGRG(其中Y = T/C，且R = A/G)并在C-1之后进行切割。BamHI识别序 列GGATCC，并在G-1之后进行切割。两种酶都产生粘性末端。优化的基因然后由合成寡核 苷酸组装（从头基因合成），并使用Sfil和Sfil克隆位点克隆到pMA-T载体中。最终的构建 体通过测序验证。
[0047] 表达SpCMLeu的质粒的制备、DNA扩增、质粒分离、纯化和在电转化感受态大肠 杆菌细胞中的转化，使用通常在 Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSHL Press 2001中所讨论的重组DNA技术的传统方法进行。
[0048] 对于亚克隆，用Aval和BamHI消化SpC33Leu序列以产生突出的单链末端。在载体 的Aval/BamHI消化、去磷酸化、通过琼脂糖凝胶电泳纯化所需载体DNA片段、以及SpC33Leu 片段和载体片段通过粘性末端杂交之后，发生向载体中的整合。随后通过使用T4DNA连接 酶（New England Biolab)连接，将两个片段共价连接，然后转化到细菌宿主细胞中。含质 粒细胞的选择通过接种到含氨苄青霉素的LB琼脂平板上来进行。从获得的Amp-抗性菌落 中分离质粒DNA并用合适的限制性酶分析。选择具有所期望的DNA限制性片段模式的菌 落。由BMR Genomics (Padua大学）对质粒序列进行的完整测序证实SpC33Leu序列的正确 插入。
[0049] 生产菌株
[0050] 用于表达SP-C33(leu)的生产菌株大肠杆菌C41(DE3)和C43(DE3),衍生自大肠 杆菌BL21(DE3)并可以从Lucigen购买。这些菌株据报道能有效过表达病毒、真细菌、古细 菌、植物、酵母、果蝇或哺乳动物来源的毒性和膜蛋白，因为这些菌株具有至少一个未表征 的（uncharacterized)突变，阻止了与多个重组毒性蛋白表达相关的细胞死亡。
[0051] 蛋白表达
[0052] 重组质粒允许在tac启动子的控制下表达融合蛋白MBP-SpC33Leu。在用异丙基 β-D-l-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导后，重组融合蛋白在宿主细胞中以可溶形式产生。
[0053] 用接种在LB平板上的甘油培养物接种1ml预培养物或起子培养物 (Luria-Bertani培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，和10g/l NaCl，在存在lOraM葡 萄糖的条件下），并在强氨苄青霉素选择压力下在37°C温育，摇动过夜。使用该培养物接种 5mL培养物。使细菌继续生长，直至其达到600nm处约0. 6的光密度。然后通过加入IPTG 诱导培养物。诱导之后继续生长4-5个小时，直至在4°C离心收获细胞。将湿生物质重悬于 20福丽411〇) 3缓冲液，？117.5中。在冰上通过超声使细胞悬液破裂。细菌裂解后，在12% Laemmli还原的SDS-PAGE凝胶上检查表达混合物，以评价总蛋白含量。将新条带做为融合 蛋白的鉴别使用兔抗-MBP抗血清（NEB)进行免疫印迹来证实。在半干装置中在硝酸纤维素 膜上进行印迹，在10V进行40分钟。含有3%脱脂牛奶的pH8· OTris缓冲液被用作封闭缓 冲液。在封闭缓冲液中按1: 1〇, 〇〇〇稀释初级抗体并在室温温育1小时。抗-兔1过氧 化物酶缀合物被用作二级抗体与辣根过氧化物酶底物，3,3<，5,5< -四甲基联苯胺（TMB) 结合，以进行检测（所有免疫印迹试剂购自Sigma Aldrich)。诱导之后，通过SDS-PAGE和 免疫印迹检测到具有融合蛋白的正确分子量的新的主要条带，所述融合蛋白相应于MBP和 SpC33Leu片段的组合。
[0054] 融合蛋白的纯化
[0055] 使用MBP亲和层析帮助融合蛋白从表达混合物分离。粗细胞提取物被加载到含有 用直链淀粉衍生化的琼脂糖树脂的柱（PMAL蛋白融合和表达系统，New England Biolabs) 上。融合蛋白由于MBP与直链淀粉的亲和力而与柱结合，并用含有10mM麦芽糖的20mM NH 4HC03缓冲液，pH 7. 5洗脱。含有感兴趣的融合蛋白的洗脱液在12% Laemmli还原的 SDS-PAGE凝胶上进行分析，并用抗-MBP血清通过免疫印迹进行鉴别。
[0056] MBP-SpC33Leu融合蛋白的产量是每升培养物50-80mg。
[0057] 后续的用肠激酶分离MBP和SP-C33(Leu)的切割发生在MBP-SpC33Leu的Lys-393 和Ile-394之间。Ile-394相应于SP-C33(Leu)肽的第一个氨基酸。
[0058] 融合蛋白的切割
[0059] 为了在Lys-393连接氨基酸处进行融合蛋白的切割，向溶液中加入每mg融合蛋白 0. 02单位的肠激酶。向切割溶液中加入1% (v/w)Triton X-100以保持被切割的消化疏水 性产物SpC33Leu的溶解性。溶液在室温温和搅拌16小时。
[0060] 蛋白产物SpC33Leu的质谱表征
[0061] 应用两种不同的程序以表征MBP-SpC33Leu融合蛋白的消化产物。MALDI-MS高分 辨率方法的目的在于确定产物的单一同位素分子量并评价正确序列的表达盒肠激酶对融 合蛋白的正确切割。选择HPLC-ESMS作为初步评价重组产物相对于参考标准的杂质分布， 以及评价批次的重复性的方法。
[0062] 附图描述
[0063] 图1. MALDI光谱分析揭示SP_C33(Leu)存在于消化后的溶液中。计算的单一同 位素质量为3594. 52Da，其相对于由氨基酸序列计算得到的理论单一同位素质量差异在 22ppm以内。
[0064] 图2· MBP-接头（MW平均?43206Da)的存在通过低分辨率MALDI-MS方法测定。没 有观察到可检测量的MBP-接头-SP-C33 (Leu)，表明所应用的蛋白水解反应条件导致定量 过程。
[0065]图3.对杂质的初步评价也通过MALDI-MS和HPLC-ESIMS在两个独立获得的批次 (标记为批次1和批次2)之间进行。它们显示出相当的纯度水平。通过LC-MS进行的产 品SP-C33 (Leu)的定量是相对于SP-C33 (Leu)参考标准进行的。独立获得的两个批次被测 定，并且蛋白产量被测定（表）。
[0066] 表
[0067]
【权利要求】
1. 一种表达盒，其包含编码SP-C肽、MBP蛋白和位于其间并携带蛋白酶切割位点的接 头肽的多核苷酸序列，所述编码多核苷酸序列与适合于在原核细胞中表达的启动子序列可 操作连接。
2. 根据权利要求1的表达盒，其中所述SP-C肽是SEQ ID N0:1所示的SP-C33(Leu)。
3. 根据权利要求1-2的表达盒，其中所述MBP蛋白如SEQ ID NO: 2所示。
4. 根据权利要求1-2的表达盒，其中所述编码SPC肽的多核苷酸序列是SEQ ID NO: 3。
5. 根据权利要求1和3的表达盒，其中所述编码MBP的多核苷酸序列是SEQ ID NO: 4。
6. 根据权利要求1-5的表达盒，其中所述携带蛋白酶切割位点的接头肽及其编码序列 分别如SEQ ID N0:5和6所示。
7. 根据权利要求1-6的表达盒，其中所述编码MBP的序列和编码SP-C的序列分别位于 N_和C_末端。
8. 根据权利要求1的表达盒，其中所述启动子是诱导型tac启动子。
9. 含有根据权利要求1-8的表达盒的表达载体。
10. 根据权利要求9的表达载体，其是质粒。
11. 根据权利要求10的表达载体，其是基于PBR32的质粒。
12. -种制备SPC肽的方法，其包括以下步骤： i) 提供携带编码融合蛋白的表达盒的载体，所述表达盒如权利要求1-8所定义； ii) 将所述载体导入到原核细胞中，并在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细 胞； iii) 纯化所述融合蛋白； iv) 用适当的蛋白酶切割所述融合蛋白并分离所述SP-C肽。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细菌细胞。
14. 根据权利要求12-13的方法，其中所述融合蛋白的纯化使用MBP配体-连接树脂通 过亲和层析进行。
15. 根据权利要求12-14的方法，其中肠激酶蛋白酶被用于所述融合蛋白的切割。
【文档编号】C07K14/785GK104245727SQ201380020491
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月16日 优先权日:2012年4月17日
【发明者】A·莫扎拉利, S·拉博尼, B·皮奥塞利 申请人:奇斯药制品公司