一种新的肽,其制备方法,含有它的药物组合物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了从东亚钳蝎中提取的新的肽，该肽的氨基酸序列为VRDAYIAKPENCVYECGITQDCNKLCTENGAESGYCQWGGKYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCQ，这种肽的制备方法，含有其的药物组合物，及其在制备镇痛药物中的应用。本发明的肽具有镇痛活性高，毒性低的优点，并且该肽在蝎毒中的含量高，分离纯化过程简单。
【专利说明】一种新的肽，其制备方法，含有它的药物组合物和应用
【技术领域】[0001]本发明涉及从东亚钳蝎中提取的活性肽，其制备方法，含有其的药组合物，及其作为镇痛药物的用途。该肽的氨基酸序列为VRDAYIAKPENCVYECGITQDCNKLCTENGAESGYCQWGGKYGNACWCIKLPDSVPIRVP GKCQ。
【背景技术】
[0002]东亚全蝎是是中国分布最为广泛的蝎种，作为药用已经有一千多年的历史。具有息风镇痉，攻毒散结、通络，止痛的功效。中医用于治疗小儿惊风、抽搐惊挛、中风口眼歪斜，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头疼，疮疡，瘰疬等症。
[0003]近代研究表明，蝎尾的药理活性比蝎身强4-5倍，说明蝎毒(位于蝎尾)起主要作用，但是蝎毒成分复杂，许多成分所起的作用甚至相反，有效成分往往含量很低，而且多种蝎毒毒素对哺乳动物具有很大的毒性，这些都无疑限制了蝎毒作为分必要。中科院上海生化所和中科院生物物理所从东亚全蝎蝎毒中发现了两个具有镇痛活性的蝎毒毒素，BmKIT-AP 和 BmK AngPl (Guan, R.J., Wang, M., Wang, D.and Wang D.C.J.peptide Res2001 ；58:27-35 ；Xiong YM, Lan ZD, Wang M, Liu B, Liu XQ, Fei H, Xu LG, Xia QC, Wang CG.，WangDC, ChiCff.Toxiconl999 ；37:1165-1180)。其中 BmKAngPl 只鉴定了部分结构，且活性较 BmKIT-AP至少弱10倍。而BmK IT-AP在蝎毒中的含量较低，约0.5%，分离难度大。
[0004]现在已有厂家开始生产蝎毒注射液，用于临床镇痛，但由于所用为粗毒组分，因此，不可避免地存在一些问题，质量控制问题，毒性问题。最近，中国专利01128235.5报道了一种蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及其获得方法，但其纯化方法比较繁琐。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的不足，本发明提供一种新的序列所示的肽。本发明的另一个目的在于提供这种肽的制备方法。本发明的又一目的在于提供含有本发明活性肽的药物组合物。本发明的再一目的在于提供本发明肽在制备镇痛药物中的应用。
[0006]具体讲，本发明的氨基酸序列为VRDAYIAKPENCVYECGITQDCNKLCTEYNGAENNGAESGCQWGGKYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCQo
[0007]本发明活性肽，其特征是，该活性肽的等电点为5.8，分子量为7040.5Da0
[0008]根据本发明还包括制备这种肽的方法，它包括如下步骤:
[0009](a)蝎粗毒溶于蒸馏水中，每Ig蝎粗毒溶于20_40ml蒸馏水，8000_12000g离心10-15分钟，弃去沉淀，收集上清液，冷冻干燥。本发明的蝎粗毒可以使用电刺激东亚钳蝎而获得，获得的粗毒冻干后使用。
[0010](b)将上清液上样于凝胶柱分离，洗脱，使用紫外280nm波段检测，收集主峰，即为镇痛组分，冷冻干燥。优选的凝胶柱是Sephadex G_50 (也可以用Sephadex G-75,Bio-GelP-10, Bio-Gel P-30, Bio-Gel P-60等凝胶介质)。优选的洗脱剂是水。
[0011](c)将b获得的镇痛组分冻干后的溶于0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH6.8)，上样于预先平衡好的阳离子交换柱，优选的阳离子交换柱是CM-Sephadex C_50离子交换柱，(也可以用CM-S印hadex C_25，CM52，CM92等弱阳离子交换剂)先用平衡缓冲液洗脱至没有蛋白峰出现。再用0.02mOl/L NaCl和0.01mol/L PBS混合液洗脱，收集洗脱液，透析，冻干。
[0012](d)将c中冻干粉溶于0.1%三氟乙酸水溶液，用反相柱高压液相制备，进行梯度洗脱，洗脱液A:0.1 %三氟乙酸水溶液，洗脱液B:0.085%三氟乙酸70%乙腈-水溶液。梯度为在5分钟内维持85% A-15% B不变，再在40分钟内由15% B线性上升至55% B。紫外220nm波段检测，收集其主要洗脱峰，即为本发明的活性肽。
[0013]将冻干粉溶于0.1 %三氟乙酸水溶液，用反相HPLC制备，用乙腈进行梯度洗脱。洗脱液A:0.1 %三氟乙酸水溶液，洗脱液B:0.085%三氟乙酸70%水溶液。梯度为在5分钟维持15% B不变，再在40分钟内由15% B线性上升至55% B。收集其主要洗脱峰，即为本发明的活性肽。
[0014]本发明肽具有镇痛作用强，毒性低的药理优点；其在东亚钳蝎的粗毒中含量较高，分离方法简单。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为粗毒样品在Sephadex_G50上的层析行为。
[0016]图2为 本发明活性肽的ESI/MS图。
[0017]图3为本发明的活性肽的超薄等电聚焦电泳图。图中a，b，c，d为标准蛋白，f为本发明的活性肽。
[0018]图4为东亚钳蝎低毒，镇痛活性肽一级结构测定图。其中，
[0019](a)本发明活性肽的氨基酸序列。
[0020](b)本发明活性肽从N-端开始的30个氨基酸序列。
[0021](c)本发明活性肽经V8蛋白酶降解后，再经HPLC分离后的第六片段的氨基酸序列。
[0022](d)本发明活性肽经胰蛋白酶降解后，再经HPLC分离后的第六片段的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明有任何限制。实施例I本发明活性肽分离纯化
[0024]东亚钳蝎粗毒溶于蒸馏水中(Ig溶于30ml蒸馏水)，10000r/min离心10分钟，弃去沉淀，上清液冷冻干燥。将冻干后的上清液500mg重新溶于IOml水中，Sephadex G-50分离，用水洗脱，柱长(2.6 X 100cm)，收集镇痛组分(约350mg)，将镇痛组分冷干后溶于0.01mol/L PBS (pH6.8)，上样于预先平衡好的CM-S印hadex C-50离子交换柱(2.6 X 50cm)，先用平衡缓冲液洗脱至没有蛋白峰出现，再用0.02mol/L NaCL+0.01mol/L PBS洗脱。收集洗脱液，透析，冻干。将冻干粉溶于0.1 %三氟乙酸水溶液，用反相HPLC制备，用乙腈进行梯度洗脱。洗脱液A:0.1 %三氟乙酸水溶液，洗脱液B:0.085%三氟乙酸70%水溶液。梯度为在5分钟维持15% B不变，再在40分钟内由15% B线性上升至55% B。收集其主要洗脱峰，即为东亚钳蝎低毒，镇痛活性肽。
[0025]结构确证:
[0026](1)分子量确定:
[0027]将样品溶于含1%甲酸的乙腈/水(50/50)溶液。用AgilentllOOLC/MSD质谱仪测定本发明的活性肽的分子量，通过质谱图中的多电荷峰的计算，得出其分子量为7040.5Da0见图1。
[0028](2)等电点测定:
[0029]将标准品(Amyloglucosidase(3.6), b-lactoglobulin(5.1), Myoglobin(tWobands:6.8and7.2), Trypsinogen (9.3))和本发明的活性肽溶于蒸懼水中，用超薄等电聚焦电泳测定其分子量。结果如图2。经计算得出本发明的活性肽的等电点为5.8。
[0030](3)氨基酸组成分析:
[0031]将本发明的活性肽溶于6mol/L的HCl (含1%的苯酚)，氮气保护，在110°C水解20小时，水解液减压蒸干，然后上样于HITACHI L-8500氨基酸组成分析仪。结果如下:
[0032]
【权利要求】
1.一种活性肽，氨基酸序列为 VRDAYIAKPENCVYECGITQDCNKLCTENGAESGYCQWGGKYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCQ。
2.权利要求1的活性碳的制备方法，它包括如下步骤: (a)蝎毒用蒸馏水溶解，离心去除沉淀； (b)上清液用Sephadex_G50分离； (C)将镇痛组分用CM-Sephadex C-50离子交换柱进行分离； (d)最后用RP C18进行进一步纯化。 具体而言 (a)粗毒(来源东亚钳蝎用电刺激获得粗毒，冻干)溶于蒸馏水中(Ig溶于30-50ml蒸馏水)，8000-1 2000g离心7-13分钟，弃去沉淀，收集上清液； (b)将上清液上样于凝胶柱分离，用水洗脱，收集5号峰，为镇痛组分，冷冻干燥。将冷干后的上清液500mg重新溶于IOml水中，用Sephadex G-50分离，用水洗脱，柱长(2.6 X 100cm)，收集镇痛组分(约350mg)； (c)将b获得的镇痛组分冻干后的溶于0.01mol/LPBS(pH6.8)，上样于预先平衡好的阳离子交换柱(CM-S印hadexC-50离子交换柱(2.6x50cm))，先用平衡缓冲液洗脱至没有蛋白峰出现。再用0.02mol/LNaCL和0.01mol/LPBS混合液洗脱，收集洗脱液，透析，冻干； (d)将(c)中冻干粉溶于0.1%三氟乙酸水溶液，用反相柱高压液相制备，进行梯度洗脱，洗脱液A:0.1 %三氟乙酸水溶液，洗脱液B:0.085%三氟乙酸70%乙氰水溶液。梯度为在5分钟内维持15% B不变，再在40分钟内由15% B线性上升至55% B。收集其主要洗脱峰，即为本发明的活性肽。
3.—种药物组合物，包括权利要求1所述的活性肽和任何药学上可用的载体。
4.权利要求1所述的活性肽在制备镇痛药物中的应用。
【文档编号】C07K1/18GK103923203SQ201410195797
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】曹征宇, 张剑 申请人:曹征宇