专利名称：人参皂草苷代谢物的制备方法
技术领域：
本发明涉及从下列操作中收集原人参二醇(protopanaxadio1)皂草苷的代谢物的制备方法，在本发明的技术方案中，将普雷沃氏菌属种(Prevotella sp.)S-1菌株(拟杆菌科(Bacteroidaceae)，(KFCC-10923，相当按布达佩斯条约的保藏号KCCM-10103)在补充人参皂草苷的培养基上培养，这时含于培养基中的原人参二醇皂草苷得以生成和积聚。
长期来高丽人参由于具各种治疗作用，被认为是治疗一些内科疾病的万能药。但是，当人参用于治疗各种疾病时，其缺点在于a)皂草苷，这一种治疗组份，被肠道菌所代谢，b)由于肠道菌群易受到人体的身体结构和其进食的生活方式的影响，皂草苷代谢会有个体差异，这样在长期的应用中会影响治疗效果。根据此情况，发明人对人参皂草苷代谢物在体内的治疗作用作了广泛的研究，现了解到被肠道菌代谢的皂草苷是从肠道吸收的物质，这样它显示出包括对肿瘤血管化和癌细胞外渗的抑制作用的免疫增强作用。在这样的思想指导下，发明人开发人参皂草苷作为皂草苷被吸收的物质用作新颖的抗癌剂，它不受个体肠道菌群的差异所影响(参见韩国专利申请4217号，1996提交)。
业已报道通过使用一些衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)(粪便菌株，大鼠和人体的粪便)的肠道菌产生的一些酶制备上述人参皂草苷代谢物，即，20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(s)-原人参二醇，即化合物K和20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人参二醇，即化合物Y[参见Yoshioka，I.化学药学通报(Chem.Pharm.Bull.)，20，2418(1972)，Kamida等药理学杂志(Pharmacology Journal)95，246(1975)。Takino等药用人参1989(PublicPublications Go.，Ltd.)，267(1989)，Kaneoka等日本植物药杂志，11.241(1994)]。另外，发明者也报道了用衍生自人体粪便的肠道菌制备20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(arabinopuranosyl)(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人参二醇，即人参苷(ginsenoside)Mc的另一种制备方法(参见韩国专利4217，1996提交)。
用粪便菌株方法产生化合物K需要多于2周的培养。此外，在用黑曲霉产生的粗制的橙皮苷酶(Hesperidinase)的酶处理方法中，它是一种β-葡糖苷酶，会产生化合物K，因为人参皂草苷的代谢途径中的肠道菌会产生不同的酶，但由于生成了人参苷F2而几乎不产生化合物Y和人参苷Mc。
此外，用衍生自人体粪便的肠道菌处理的方法可生成的代谢物范围扩大了，从化合物Y和人参苷Mc到化合物K，因而它们的选择性很低。这样，常规的制备方法被认为有这样的不足a)生产效率很低，b)由于除β-葡糖苷酶外另外还有糖的裂解酶形成，故选择性生成的活性很低级。在这样的情况下，以前的技术不能有效地制备本发明的代谢物，化合物K、化合物Y和人参苷Mc。
为了克服上述现有技术的缺点并以保证其高效率和选择性生成的方式来制备人参皂草苷的代谢物，本发明者广泛地研究了酶诱导方法，通过该方法，衍生自人体粪便的肠道菌群在含人参苷Rb1的培养基中连续继代培养，促使产生β-葡糖苷酶的细菌生长，结果，成功地分离了菌株S-1(1996，11，8提交韩国微生物保藏中心保藏；其保藏号KFCC-10923，并在1997，7，11转换为按布达佩斯条约的国际保藏机构的保藏号KCCM-10103)，次代培养的细菌产生β-葡糖苷酶的活性更大。通过对菌株S-1的形态和生化外观进行仔细的研究，其性质与文献中所述的性质进行了比较(Holdeman，L.V.，Bergey的系统细菌学手册(Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology)，Williams和Wilkins，第1卷，616-617(1984)Shar，H.N.，Int.J.Syst.Bateriol.40，205-208(1990))。这样，现已注意到，属于拟杆菌科的普雷沃氏菌属种的菌株S-1类似于普雷沃氏菌(Prevotellaoris)。进一步的是，对S-1菌株(KFCC-10923，按布达佩斯条约的保藏号为KCCM-10103)和普雷沃氏菌标准菌株JCN 8540(由日本理化研究所微生物保藏机构转让)生成与人参皂草苷有关的代谢物进行研究的结果显示标准菌株不显示任何代谢活性，但S-1菌株能有效地代谢得到原人参二醇皂草苷，结果可以确保高效、选择性生成的方式生成化合物K、化合物Y和人参苷Mc。既然用S-1菌株的方法被证明在制备本发明代谢物中相当有用，那么本发明便得以完成。
本发明的一个目的是提供用普雷沃氏菌属种菌株(KFCC-10923，其布达佩斯保藏号为KCCM-10103)制备化合物K、化合物Y和人参苷Mc的方法，其特征在于1)菌株是专性的、无孢子的革兰氏阴性杆菌。
2)菌株没有还原乙酸和生成吲哚活性的部分。
3)菌株主要从葡萄糖产生琥珀酸，但不产气。
4)菌株的生长在含20％胆汁的蛋白胨-酵母培养基中受到抑制。
5)菌株在血琼脂培养基中培养时不产生任何色素。
6)菌株水解淀粉和七叶苷。
7)菌株由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉中产生某些酸，但从海藻糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、肌醇和L-鼠李糖不产生某些酸。
8)菌株水解人参苷Rb1和Rd，它主要生成化合物K。进一步的是，人参苷Rb2和Rc水解的主要产物分别是化合物Y和人参苷Mc。但是人参苷Rc和Rg1几乎不降解。
进一步的是，本发明也包括通过酶诱导方法制备代谢人参苷Rb1的细菌的另一种方法；即衍生自人粪的肠道菌群用补充约0.1％人参苷Rb1的培养基中进行连续继代培养，这样能增加β-葡糖苷酶的产生，β-葡糖苷酶可选择性地水解糖链末端的葡萄糖。用诸如庆大霉素、新霉素、卡那霉素等的氨基糖苷抗生素处理次代培养的菌群后，在代谢人参苷Rb1的细菌对这些抗生素产生耐药性的基础上可分离出普雷沃氏菌属种S-1菌株。进一步的是，从存在于一些动物(大鼠、小鼠等)的肠道细菌中可分离出该菌株。
本发明的新的普雷沃氏菌属种S-1菌株于1996，11，8保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，其保藏号为KFCC-10923，它按布达佩斯条约由国际保藏机构KCCM转换为保藏号KCCM-10103。
进一步的是，本发明的人参皂草苷代谢物如下制备将普雷沃氏菌属种S-1菌株(KFCC-10923，按布达佩斯条约它苯转换为保藏号KCCM-10103)加人补充原人参二醇皂草苷[通过公知的方法从高丽人参(Panaxginseng C.A.Meyer)的地上茎和地下茎得到]和它的组织培养物的液体培养基。然后，反应混合物在约37℃厌氧培养2-4天，在与每一皂草苷的3-位和20-位上的羟基相连的糖中，其末端葡萄糖可通过酶水解选择性地除去。所得的经培养的溶液用以水饱和的正丁醇萃取两次，正丁醇部分用水洗涤后，萃取液用活性炭处理脱色和脱臭，减压浓缩。残留物溶于乙酸乙酯，用硅胶柱层析纯化(如，Merck Co.Ltd.制备的硅胶，60-230目；洗脱溶剂∶乙酸乙酯/氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇(60∶30∶10，下层)，和Merck Co.Ltd.制备的硅胶RP-8；洗脱溶剂80-85％甲醇)得到化合物K、化合物Y和人参苷Mc。
通过上述方法，也可从人参属植物，如Panax pseudo-ginseng Wall，Panaxnotoginseng Burk.，西洋参(Panax quinquefolium L.)，Panax japonicus C.A.Meyer，Panax pseudo-ginseng Wall.subsp.Himalaicus或Panax vietnamensis Ha etGurshv.中得到人参皂草苷代谢物。也可从含具有20(s)-原人参二醇皂草苷主结构的相似糖苷的皂草苷的其它植物[如，葫芦科中的Amachazuru(绞股兰属Gynostemma pentaphyllum Makino和其接近相关植物)]得到它们。
将通过下列实施例对根据本发明，用普雷沃氏菌属种S-1菌株(KFCC-10923/KCCM-10103)制备人参皂草苷代谢物的方法作更详尽的阐述，但本发明不为这些实施例所限定。
参照实施例将从健康成年男性收集的1克粪便悬浮在普通的厌氧培养基中(如，GAM液体培养基，30毫升)，在约37℃厌氧培养过夜。衍生自人体粪便的肠道菌每隔2天或3天的加到含人参苷Rb1(0.1％)的GAM液体培养基中进行连续继代培养。10个月后，稀释的次代培养液被加到补充庆大霉素(100微克/毫升)的GAM琼脂培养基上，并在37℃厌氧培养2天。所有生长的细菌集落用接种环按形态类型进行收集，从中分离出由普雷沃氏菌属种S-1菌株(1996，11，8保藏于KCCM，其保藏号为KFCC-10023，并按布达佩斯条约转换为保藏号KCCM-10103)代谢的人参苷Rb1。
实施例1将预先在GAM液体培养基(100毫升)中培养过夜的普雷沃氏菌属种S-1菌株溶液加到补充人参苷Rb1(0.2％)的Mueller-Hinton液体培养基(3升)中，然后在氮气氛下于约37℃厌氧培养2天。这样培养的溶液用以水饱和的正丁醇(1升)萃取两次，正丁醇部分用水(1升)洗涤后，萃取液用活性炭处理进行脱色和脱臭，并减压浓缩。残留物溶于乙酸乙酯(500毫升)在硅胶(Merck Co.；60-230目，150克)柱层析纯化。所得的残留物用乙酸乙酯(1升)洗涤，用洗脱溶剂(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下层)洗脱。减压除去溶剂得到粗制的代谢物(2.1克)。粗制的代谢物经反相硅胶柱层析[250克硅胶RP-8，Merck Co.制备；洗脱溶剂(85％甲醇)]分离成纯净物形式，得到化合物K(1.6克)。
实施例2将预先在GAM液体培养基(100毫升)中培养过夜的普雷沃氏菌属种S-1菌株溶液加到补充人参苷Rb2(0.2％)的Mueller-Hinton液体培养基(3升中)，然后在氮气氛下于约37℃厌氧培养2天。这样培养的溶液用以水饱和的正丁醇(1升)萃取两次，正丁醇部分用水(1升)洗涤后，萃取液用活性炭处理进行脱色和脱臭，并减压浓缩。残留物溶于乙酸乙酯(500毫升)并在硅胶(Merck Co.；60-230目，150克)柱层析纯化。所得的残留物用乙酸乙酯(1升)洗涤，用洗脱溶剂(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下层)洗脱。减压除去溶剂得到粗制的代谢物(3.6克)。粗制的代谢物经反相硅胶柱层析[250克硅胶RP-8，Merck Co.制备；洗脱溶剂(85％甲醇)]分离成纯净物形式得到化合物Y(3.1克)。
实施例3将预先在GAM液体培养基(100毫升)中培养过夜的普雷沃氏菌属种S-1菌株溶液加到补充人参苷Rc(0.2％)供给的Mueller-Hinton液体培养基(3升)中，然后在氮气氛下于约37℃厌氧培养2天。这样培养的溶液用以水饱和的正丁醇(1升)萃取两次，正丁醇部分用水(1升)洗涤后，萃取液用活性炭处理进行脱色和脱臭，并减压浓缩。残留物溶于乙酸乙酯(500毫升)并在硅胶(Merck Co.；60-230目，150克)柱层析上纯化。所得的残留物用乙酸乙酯(1升)洗涤，用洗脱溶剂(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下层)洗脱。减压除去溶剂得到粗制的代谢物(3.6克)。粗制的代谢物经反相硅胶柱层析[250克硅胶RP-8，Merck Co.制备；洗脱溶剂(85％甲醇)]分离成纯净物形式，得到化合物Mc(3.6克)。
实施例4将预先在GAM液体培养基(30毫升)中培养过夜的普雷沃氏菌属种S-1菌株溶液加到补充原人参二醇皂草苷(0.3％)的Mueller-Hinton液体培养基(1升)中，然后在氮气氛下于约37℃厌氧培养2天。这样培养的溶液用以水饱和的正丁醇(1升)萃取两次，正丁醇部分用水(300毫升)洗涤后，萃取液用活性炭处理进行脱色和脱臭，并减压浓缩。残留物溶于乙酸乙酯(200毫升)在硅胶(Merck Co.；60-230目，50克)柱层析上纯化。所得的残留物用乙酸乙酯(300毫升)洗涤，用洗脱溶剂(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下层)洗脱。减压除去溶剂得粗制的代谢物(1.1克)。粗制的代谢物经反相硅胶柱层析[250克硅胶RP-8，MerckCo.制备；洗脱溶剂(80-85％甲醇)]分离成纯净物形式，按顺序得到化合物K(0.6克)、化合物Y(0.1克)和人参苷Mc(0.2克)。
如上述实施例所述，用普雷沃氏菌属种S-1菌株(KFCC-10923/KCCM-10103)制备人参皂草苷代谢物的方法被证明是相当有效的，原人参二醇皂草苷代谢物-化合物K、化合物Y和人参苷Mc-可用这类方法制备以确保其高效地选择性地生成。
权利要求
1.一种新颖的微生物KFCC-10923(它相当于按布达佩斯条约的保藏号KCCM-10103)，普雷沃氏菌属种(Prevotella sp.)S-1菌株。
2.一种制备原人参二醇皂草苷代谢物的方法，其中普雷沃氏菌属种S-1菌株(拟杆菌科，KFCC-10923/KCCM-10103)在补充人参皂草苷的培养基上培养，这时含于培养基中的原人参二醇皂草苷代谢物，即20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(s)原人参二醇、20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人参二醇和20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(arabinopuranosyl)(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人参二醇得以生成和积聚。
3.根据权利要求2所述的制备原人参二醇皂草苷代谢物的方法，其中它们的含人参皂草苷的源植物选自人参(Panax ginseng C.A.Meyer)，Panax pseudo-ginseng Wall，Panax notoginseng Burk.，西洋参(Panax quinquefolium L.)，Panaxjaponicus C.A.Meyer，Panax pseudo-ginseng Wall.subsp.Himalaicus或Panaxvietnamensis Ha et Gurshv.，或葫芦科中的Amachazuru皂草苷。
全文摘要
根据本发明,普雷沃氏菌属种(Prevotella sp.)S－1菌株(拟杆菌科,KFCC－10923,其按布达佩斯条约下的保藏号为KCCM－10103)在补充人参皂草苷的培养基中培养,收集培养基中产生和积聚的皂草苷的代谢物,这样能确保高效、选择性地生成代谢物。本发明涉及制备原人参二醇皂草苷代谢物的方法,其中普雷沃氏菌属种在上述培养基上培养,然后含于培养基中的原人参二醇皂草苷代谢物得以生成和积聚。
文档编号C07J17/00GK1184851SQ9712260
公开日1998年6月17日 申请日期1997年11月28日 优先权日1996年11月29日
发明者成钟焕, 许才斗, 长谷用秀夫, 松宫智之, 内山雅守 申请人:株式会社一和, 株式会社快乐世界