新型肿瘤抗原蛋白sart－3及其肿瘤抗原肽的制作方法

专利名称：新型肿瘤抗原蛋白sart－3及其肿瘤抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型肿瘤抗原蛋白及其肿瘤抗原肽。更具体地说，本发明涉及新型肿瘤抗原蛋白及其基因、衍生自该肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽和这些物质的衍生物、以及体内或体外利用这种肿瘤抗原蛋白、基因、肿瘤抗原肽或它们的衍生物治疗、预防或诊断肿瘤。
虽然长期以来人们不了解攻击自身肿瘤细胞的CTL的靶分子，但是免疫学和分子生物学的最新进展已经逐渐揭示了这类靶分子。准确地说，已经发现CTL利用T细胞受体(TCR)识别称为肿瘤抗原肽的肽和主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原(Ⅰ类MHC抗原，在人类称为HLA抗原)之间的复合物，由此攻击自身肿瘤细胞。
肿瘤抗原肽产生自肿瘤抗原蛋白(即肿瘤特异性蛋白)在具有蛋白酶体的细胞中的降解，所述肿瘤抗原蛋白在细胞内合成。由此产生的肿瘤抗原肽结合至在内质网中的MHCⅠ类抗原(HLA抗原)上，形成复合物，而且该复合物被转运到细胞表面作为抗原提呈。肿瘤特异性CTL识别作为抗原提呈的该复合物，并通过其细胞毒性作用或产生淋巴因子呈现其抗肿瘤效应。因为这一系列作用的阐明，通过使用肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽作为所谓的癌症疫苗增强肿瘤患者体内的肿瘤特异性CTL来治疗肿瘤已成为可能。
作为肿瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次由人黑素瘤细胞鉴定了命名为MAGE的蛋白(Science,254:1643,1991)。此后主要从黑素瘤细胞鉴定了数种其它肿瘤抗原蛋白。已鉴定的黑素瘤抗原的实例是黑色素体蛋白，例如黑素细胞组织特异性蛋白、gp 100(J.Exp.Med.,179:1005,1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515,1994)和酪氨酸酶(J.Exp.Med.,178:489,1993)；不仅在黑素瘤细胞而且在各种癌症细胞和正常睾丸细胞上表达的MEGE-相关蛋白(J.Exp.Med,179:921,1994)；具有肿瘤特异性氨基酸突变的β-连环蛋白(J.Exp.Med.,183:1185,1996)和CDK4(Sience,269:1281,1995)。还鉴定了不是得自黑素瘤的肿瘤抗原蛋白，包括癌基因产物，例如HER2-neu(J.Exp.Med.,181:2109,1995)和p53(变异体)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:14704,1996)、肿瘤标记物例如CEA(J.Natl.CancerInst.,87:982,1995)和PSA(J.Natl.CancerInst.,89:293,1997)，以及病毒蛋白例如HPV(J.Immunol.,154:5934,1995)和EBV(Int.Immunol.,7:653,1995)。关于这些物质的详细描述可见公开出版的综述(例如Immunol.Today,18:267,1997；J.Exp.Med.,183:725,1996；和Curr.Opin.Immunol.,8:628,1996)。
应用肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽治疗或诊断肿瘤时，重要的是鉴定可广泛用于比黑素瘤发病率高得多的鳞状细胞癌例如食管癌和肺癌的肿瘤抗原。与此相关的是，本发明人对编码得自食管癌鳞状癌细胞的新肿瘤抗原蛋白的基因进行了克隆，以及首次从非黑素瘤肿瘤细胞鉴定了几种结合并提呈在HLA型为HLA-A24或HLA-A26的HLA抗原上的肿瘤抗原肽(J.Exp.Med,187:277,1998；国际专利公开WO97/46676)。
当将这些肿瘤抗原肽在临床实际应用时，最好使用两种或多种不同肿瘤抗原肽而不是仅使用单一肽。也就是说，鉴于这样的事实所有癌症细胞并不是表达共有的相同肿瘤抗原以及在单一癌细胞上存在两种或多种不同肿瘤抗原肽，所以认为采用两种或多种不同肿瘤抗原肽治疗更有效。实际上，对于黑素瘤已经尝试研制包含两种或多种肽的混合制剂，因为衍生自肿瘤抗原的单一肽不能产生足够的作用(Int.J.Cancer,66:162,1996；和Int.J.Cancer,67:54,1996)。在这样的情况下，需要鉴定能够广泛用于发病率较高的鳞状细胞癌的新的肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。
为了获得新型肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽，本发明人进行了以下努力。
首先，本发明人从食管癌细胞系KE-4(FERM BP-5955)制备了cDNA文库，并用该文库的重组质粒和含HLA-A2402(一种HLA-A24)cDNA的重组质粒双重转染成纤维细胞系VA-13(RIKEN CELLBANK,The Institute of Physical and Chemical Research)。用针对KE-4的KE-4CTL(FERM BP-5954)处理获得的转染子，测量产生的IFN-γ量以确定是否激活KE-4CTL。重复进行这种广泛的筛选，尽管本发明人不能保证这种筛选就能够获得新的有用的肿瘤抗原蛋白，但是我们最终成功克隆了一个编码肿瘤抗原蛋白的基因。本发明人将该基因编码的肿瘤抗原蛋白称为“SART-3”。比较SART-3与已知序列的碱基序列表明，SART-3的所述碱基序列是一种新的碱基序列，有一个碱基不同于在GenBank数据库以登录号D63879登记的KIAA0156基因，其作用仍不清楚。
此外，本发明人在SART-3的氨基酸序列中鉴定了结合并提呈在HLA-A24和HLA-A2上的肿瘤抗原肽部分，并证实这类肽具有肿瘤抗原肽活性。
本发明人根据上述发现完成了本发明。
因此，本发明涉及(1)编码以下蛋白的DNA:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的蛋白或在SEQ ID NO:1中替代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成的蛋白变异体，前提是所述蛋白和蛋白变异体可产生能够结合HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；(2)SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的DNA或在严格条件下与所述DNA杂交的DNA变异体，前提是所述DNA或DNA变异体产生和表达的蛋白可产生能够结合HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；(3)含有上述(1)或(2)的DNA的表达质粒；(4)用上述(3)的表达质粒转化的转化体；(5)产生重组蛋白的方法，它包括培养上述(4)的转化体，回收表达的重组蛋白；(6)上述(1)或(2)的DNA编码的肿瘤抗原蛋白，或者通过上述(5)的方法产生的肿瘤抗原蛋白；
(7)包含作为活性成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白的药用组合物；(8)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白；(9)为衍生自上述(6)的蛋白的部分肽、而且能够结合HLA抗原并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽，或其具有相同功能特性的衍生物；(10)上述(9)的肿瘤抗原肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2或其具有相同功能特性的衍生物；(11)上述(10)的肿瘤抗原肽或其具有相同功能特性的衍生物，所述肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID NO:3-52中任一个所示全部或部分氨基酸序列的序列；(12)上述(11)的肿瘤抗原肽或其具有相同功能特性的衍生物，所述肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID NO:3-9和25-29中任一个所示全部或部分氨基酸序列的序列；(13)上述(11)的肿瘤抗原肽衍生物，它包含选自在SEQ ID NO:3-52中任何一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(14)上述(13)的肿瘤抗原肽衍生物，它包含选自在SEQ ID NO:3-9或25-29中任一个所示的氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(15)上述(13)的肿瘤抗原肽衍生物，它包含选自在SEQ ID NO:3-24中的任何一个所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(16)上述(13)的肿瘤抗原肽衍生物，它包含选自在SEQ ID NO:25-52中的任何一个所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(17)上述(14)的肿瘤抗原肽衍生物，它包含选自SEQ ID NO:53-64中的任何一个所示的全部或部分氨基酸序列的序列；(18)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的至少一种选自按照上述(9)-(17)中的任一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质；(19)包含至少一种编码按照上述(9)-(17)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA的重组DNA；(20)可通过表达上述(19)的重组DNA获得的重组多肽；(21)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它含有作为活性成分的上述(19)的重组DNA或上述(20)的重组多肽；(22)特异性结合上述(6)中的任何一种肿瘤抗原蛋白以及按照上述(9)-(17)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体；(23)其中HLA抗原和按照上述(9)-(17)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞表面的抗原提呈细胞；(24)HLA抗原和肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞可如下制得使从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞与上述(1)或(2)的DNA、上述(6)的肿瘤抗原蛋白、上述(19)的重组DNA或上述(20)的重组多肽结合；(25)用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的上述(23)或(24)的抗原提呈细胞；(26)特异性识别HLA抗原和按照上述(9)-(17)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞；(27)特异性识别HLA抗原和肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞，所述复合物提呈在上述(23)或(24)的抗原提呈细胞上；
(28)用于治疗肿瘤的药用组合物，它含有作为活性成分的上述(26)或(27)的细胞毒性T淋巴细胞；(29)肿瘤诊断试剂，它包括按照上述(9)-(17)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物、上述(6)的蛋白或上述(20)的重组多肽；(30)其保藏号为FERM BP-6818的细胞毒性T淋巴细胞OK-CTL；(31)鉴定肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽的方法，它包括采用上述(30)的OK-CTL。
本发明的DNA编码新型肿瘤抗原蛋白，而具体DNA实例包括编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的SART-3蛋白的DNA、或编码在SART-3的氨基酸序列中替代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成的蛋白变异体的DNA，前提是所述蛋白和蛋白变异体可产生能够结合HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的的肿瘤抗原肽；SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的SART-3的DNA或在严格条件下与SART-3 DNA杂交的DNA变异体，前提是所述DNA和DNA变异体表达和产生的蛋白可产生能够结合HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。按照以上顺序在下文详细描述本发明的DNA。1)编码SART-3的DNA上述DNA中的“编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA”和“SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的DNA”是指编码本发明的肿瘤抗原蛋白SART-3的DNA。可按照以下实施例所述的方法克隆该DNA。此外，通过例如用GenBank登记号D63879公开的合适部分的碱基序列或本发明SEQ ID NO:2所示的合适部分的碱基序列作为杂交探针或PCR引物，筛选从细胞系如食管癌细胞系KE-4(FERM BP-5955)获得的cDNA文库，也可以进行所述DNA的克隆。本领域技术人员随对可以例如按照Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)完成这样的克隆。2)编码SART-3修饰蛋白或其等位基因变异体的DNA在上述DNA中“编码SART-3氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成的蛋白变异体的DNA”是指编码人工制备的所谓修饰蛋白或编码诸如在活体存在的等位基因变异体的蛋白的DNA。可用各种方法例如在Molecular Cloning:ALaboratory Manual第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)中描述的定点诱变和PCR技术制备编码这种蛋白变异体的DNA。取代、缺失和/或添加的氨基酸残基数范围是按照周知的方法例如上述的定点诱变可取代、缺失和/或添加的氨基酸残基数范围。3)在严格条件下与SART-3 DNA杂交的DNA在上述DNA中“在严格条件下与SART-3 DNA杂交的DNA变异体”是指在严格条件下与SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的人SART-3 cDNA杂交的DNA，包括得自所有脊椎动物如大鼠和小鼠的SART-3 DNA和编码SART-3部分蛋白的DNA。
术语“严格条件”是指这样的条件在含有6×SSC(20×SSC表示333mM柠檬酸钠、333mM NaCl)、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃进行杂交，然后用0.1×SSC、0.5％SDS的溶液于68℃洗涤杂交产物；或者是指在Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated.第二卷，“Idenshi-Kaiseki-NO-Kiso(基因分析的基础)”，第148-151页，Shujunsha,1995中描述的条件。
用各种方法例如与SEQ ID NO:2所示DNA杂交克隆所述DNA变异体。所述方法中的具体步骤是本领域周知的，例如产生cDNA文库、杂交、选择阳性集落以及测定碱基序列，并可以参考上述Molecular Cloning进行。可用于杂交的探针包括含有SEQ ID NO:2所示碱基序列的DNA。
在上述1)-3)的DNA中，具有产生能够结合HLA抗原而且被CTL识别的肿瘤抗原肽的能力、而且所述肿瘤抗原肽通过细胞内降解所述DNA表达产生的蛋白而产生的DNA就是编码本发明的肿瘤抗原蛋白的DNA，即本发明的DNA。具体来说，本发明的DNA是可产生所述DNA表达产生的蛋白的一部分氨基酸序列组成的部分肽的肽片段的DNA，所述肽能够结合HLA抗原而且诱导CTL产生细胞毒性作用和细胞因子，所述CTL对所述肽和所述HLA抗原之间的复合物是特异性的并且与提呈在所述细胞表面的所述复合物结合。
例如用以下方法可确定候选DNA是否是编码肿瘤抗原蛋白的DNA。
将一种含有候选DNA的表达质粒和一种含有编码HLA抗原的DNA的表达质粒双重转染入成纤维细胞VA-13(RIKEN CELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research)或得自非洲绿猴肾脏的COS-7(ATCC CRL1651)。例如通过采用脂质转染胺试剂(GIBCO BRL)的脂质转染法可以实现所述转染。接着加入限于所用的特定HLA抗原的肿瘤效应性CTL作用于转染子，然后例如可用ELISA检测所述CTL在应答所述转染子时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)量，以确定所述候选DNA是否是本发明的DNA。在这种情况下，因为SART-3含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽部分，所以HLA-A24cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252(1995)；Genbank登记号M64740)和HLA-A2 cDNA(Genbank登记号M84379)可用作编码所述HLA抗原的上述DNA，而从人外周血淋巴细胞制得的CTL以及HLA-A24-限制性CTL如KE-4CTL (FERM BP-5954)或HLA-A2-限制性CTL如OK-CTL(FERM BP-6818)可用作上述CTL。
上述的本发明DNA可用作药物或药用组合物中的活性成分。按照含有作为活性成分的本发明DNA的“药用组合物”，给予肿瘤患者本发明的DNA可治疗或预防肿瘤。
按照下述方法给予肿瘤患者掺入表达载体的本发明DNA，所述肿瘤抗原蛋白在抗原提呈细胞中的表达量高。然后在细胞内降解产生的肿瘤抗原肽结合HLA抗原形成复合物，而该复合物密集存在于所述抗原提呈细胞表面上。因此，肿瘤特异性CTL在机体内有效增殖并破坏肿瘤细胞。这样达到治疗或预防肿瘤。
可用病毒载体或按照任何一种其它方法(Nikkei-Science,1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji,36(1),23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan,12(15),1994以及其中引用的参考文献)将本发明的DNA给予并导入细胞中。
采用病毒载体的方法实例包括这样的方法其中将本发明DNA导入DNA或RNA病毒如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或Sindbis病毒中，并将其引入细胞中。在这些方法中，特别优选采用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或痘苗病毒的方法。
其它方法包括其中表达质粒直接肌内注射(DNA疫苗接种)的方法、脂质体法、脂质转染法、微量注射法、磷酸钙方法和电穿孔，特别优选DNA疫苗接种和脂质体法。
为了使本发明的DNA真正用作药物，人们可以采用以下方法其中DNA直接引入机体的体内法，和其中从人体取出一定的细胞，在体外将DNA导入所述细胞中后，再将所述细胞导入所述机体的体外法(Nikkei-Sciecnce,1994年4月，第20-45页；Gekkan-yakuji,36(1),23-48(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan,12(15),1994；以及其中引用的参考文献)。更优选体内法。
体内法时，根据需要治疗的疾病和症状以及其它因素可以采用任何合适的途径给予所述DNA。例如可以通过静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内途径等给予。体内法时，所述组合物可以以各种剂型如溶液剂给予，而且通常配制为例如含有作为活性成分的本发明DNA的注射剂形式，必要时也可加入常规载体。如果本发明DNA包含于脂质体或膜融合的脂质体(例如仙台病毒(HVJ)脂质体)中，则所述组合物可以为脂质体制剂形式，例如悬浮剂、冷冻药物、离心浓缩的冷冻药物等。
虽然在这类制剂中的本发明DNA量可以根据需要治疗的疾病、患者的年龄和体重等而不同，但是通常每隔数天或数月给予本发明的DNA0.0001-100mg、优选0.001-10mg。
在本发明中术语“蛋白”是指上述的本发明各种DNA编码的蛋白，它作为肿瘤抗原蛋白能够通过细胞内降解产生能够结合HLA抗原而且被CTL识别的肿瘤抗原肽。所述蛋白的具体实例包括含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的SART-3。本发明的蛋白可用上述本发明的DNA大量生产。
按照许多公开出版物和文献例如上述的“Molecular Cloning”可通过表达本发明的DNA产生肿瘤抗原蛋白。具体来说，通过将本发明的DNA导入合适的表达载体(例如pSV-SPORT1,pCR3)构建可在宿主细胞中复制和起作用的表达质粒。然后将表达质粒导入合适宿主细胞获得转化体。宿主细胞实例包括原核生物宿主细胞例如大肠杆菌、单细胞真核生物如酵母和从多细胞真核生物如昆虫或动物获得的细胞。用常规方法如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法、脂质转染法等可以将基因转入宿主细胞中。在合适培养基中培养的转化体产生目的蛋白。可按照标准生化方法分离和纯化如此获得的肿瘤抗原蛋白。
如上所述，通过在细胞内表达本发明的DNA可产生本发明的蛋白，并确定通过细胞内降解所述蛋白产生的所述肽片段是否具有肿瘤抗原肽活性，从而可证实本发明的肿瘤抗原蛋白是否具有一定活性。如果采用肿瘤抗原蛋白本身，可如下测定所述活性使所述蛋白导入吞噬细胞如巨噬细胞以在细胞内产生肽片段，然后使CTL接触所述肽片段和HLA抗原之间的复合物，再后测定所述CTL在应答所述复合物时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。
上述的本发明蛋白也可用作药物或药用组合物中的活性成分。按照含有作为活性成分的本发明蛋白的“药用组合物”，例如给予本发明的蛋白可治疗或预防肿瘤。当给予肿瘤患者时，本发明的蛋白导入抗原提呈细胞中。然后在细胞内降解产生的肿瘤抗原肽结合HLA抗原形成复合物，而该复合物提呈在所述抗原提呈细胞表面上。所述复合物特异性CTL在机体内有效增殖并破坏肿瘤细胞。这样达到治疗或预防肿瘤。
包含本发明肿瘤抗原蛋白的药用组合物可以和佐剂一起给予，以便有效建立所述细胞免疫，或者可以以颗粒剂型给予。为此，可应用描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中的佐剂。另外，也可以应用脂质体制剂、其中所述成分结合到直径数μm的微珠上的颗粒剂或其中所述成分结合到脂质的制剂。例如可以皮内、皮下或静脉内注射给药。虽然所述制剂中的本发明肿瘤抗原蛋白量可因为需要治疗的疾病、患者的年龄和体重等而不同，但是通常每隔数天或数月给予本发明肿瘤抗原蛋白0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-1000mg，更优选0.01mg-10mg。
在本发明中，术语“肿瘤抗原肽”是指本发明的肿瘤抗原蛋白的一部分组成的而且能够结合至HLA抗原并被CTL识别的部分肽。因此，任何肽均属于本发明的肿瘤抗原肽范围，无论其长度或其在本发明蛋白氨基酸序列的部位，只要所述肽由本发明蛋白的一部分氨基酸序列构成而且所述肽和HLA抗原之间的复合物能够被CTL识别。鉴定本发明的这种肿瘤抗原肽可通过合成包含本发明肿瘤抗原蛋白的一部分的候选肽，并进行分析以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合物是否被CTL识别，换句话说，所述候选肽是否具有肿瘤抗原肽活性。
关于此，可按照在肽化学中通常使用的方法合成肽。这类已知方法的实例描述于文献中，包括“肽合成”，Interscience，纽约，1966；“蛋白质”，第二卷，Academic Press Inc.,纽约，1976；“Pepuchido-Gosei”,Maruzen Co.Ltd.,1975；“Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn”,Maruzen Co.Ltd.,1985；和“Iyakuhin-no-Kaihatu,Zoku,第14卷，Peputido-Gosei”,Hirokawa Shoten,1991。
鉴定本发明肿瘤抗原肽的方法在下文详细描述。
已知结合至并提呈在以下HLA型上的抗原肽的相应的序列规律(基元)HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602(参见例如，Immunogenetics,41:178,1995)。例如关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，和C末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenettcs,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同样，已知HLA-A2的下表1中所示的基元(Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4749,1995)。表1

(所述肽长度为8-11个氨基酸)此外，可用NIH BIMAS软件在互联网上检索预期能够结合HLA抗原的任何肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)。
通过分析与各种HLA分子结合的抗原肽，已经证实所述肽长度通常为8-14个氨基酸长，但是也在HLA-DR、-DP和-DQ观察到14个或更多氨基酸长度的抗原肽(Immunogenetics,41:178,1995)。
容易从本发明蛋白的氨基酸序列选择包含在这类基元中的肽部分。包含在上述基元结构中的所述肽部分可容易地通过检查肿瘤抗原蛋白SART-3(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列来选择。此外，如上所述通过在互联网上检索容易选择预期能够结合HLA抗原的任何序列。可通过合成按照上述方法如此选择的候选肽，并进行分析以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合物是否被CTL识别，换句话说，所述候选肽是否具有肿瘤抗原肽活性，从而鉴定本发明肿瘤抗原肽。
鉴定本发明肿瘤抗原肽方法的具体实例为描述于，Immunol.,154:2257,1995中的方法。具体地说，从预期提呈所述候选肽的HLA抗原型阳性的人分离外周血淋巴细胞，并加入所述候选肽体外刺激所述淋巴细胞。如果所述候选肽诱导特异性识别用所述候选肽施以脉冲的HLA抗原提呈细胞的CTL，则说明所述具体候选肽可以用作肿瘤抗原肽。关于此，可检测CTL诱导存在与否，例如采用ELISA检测法检测CTL在应答抗原肽提呈细胞时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。或者，也可以将检测CTL对51Cr标记的抗原肽提呈细胞的细胞毒性的方法(51Cr释放测定，Int.,Cancer,58:317,1994)用于这种检测。
此外，也可以如下完成上述检测。通过将表达预期提呈所述候选肽的HLA抗原型cDNA的表达质粒引入例如COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK,The Institute ofPhysical and Chemical Research)中，用所述候选肽对所获得的细胞施以脉冲处理。然后将所述细胞与预期提呈上述候选肽的HLA抗原型限制性CTL反应，并检测所述CTL产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量(J.Exp.Med,187:277,1998)。
SART-3含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽部分。为了鉴定HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽，可以使用HLA-A24 cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252,1995,GenBank登记号M64740)作为编码所述HLA抗原的cDNA，而CTL例如KE-4CTL(FERM BP-5954)以及用肽刺激的人外周血淋巴细胞制备的CTL可用作上述CTL。同样对于HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽，用HLA-A2 cDNA (GenBank登记号M84379)和用这些CTL如OK-CTL(FERM BP-6818)以及用肽刺激的人外周血淋巴细胞制备的CTL作为上述CTL，可鉴定这类肿瘤抗原肽。
上述各种测定的具体实例在下文的实施例4、6和8中进行说明。
在其中相关肽基元像HLA-A26一样没有被阐明的情况下，可以例如按照WO97/46676中所述方法鉴定本发明肿瘤抗原肽，该方法不同于其中所述序列规律(基元)已阐明的上述情况，前提是可获得识别HLA-A26和肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL细胞系。
如上所述鉴定肿瘤抗原肽的方法在下文中统称为“肿瘤抗原肽分析方法”。
如上所述，已知结合并提呈在HLA-A24上的肿瘤抗原肽序列遵循一定规律(基元)，具体来说，所述基元是在8-11个氨基酸组成的肽序列中，在位置2的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同样，相似的规律(基元)可见于结合并提呈在HLA-A2上的肿瘤抗原肽序列，具体来说已知上述表1所示的基元(Immunogenetics,41,178,1995；J.Immunol.,155:4749,1995)。如上所述，可用NIH BIMAS软件在互联网上进一步检索预期能够结合HLA抗原的肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)。
因此，在本发明肿瘤抗原肽中，HLA-A24-和HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽的典型实例为包含在所述基元结构中或包含在SEQ ID NO:1所示的SART-3氨基酸序列中预期能够结合所述HLA的结构中的部分肽而且能够结合至相应的HLA抗原并被CTL识别的这类肿瘤抗原肽。
上述HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽的具体实例包括包含SEQ IDNO:3-24中任一个所示的全部或部分氨基酸序列而且能够结合HEA-A24抗原并被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。同样，HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽的具体实例包括包含SEQ ID NO:25-52中任一个所示的全部或部分氨基酸序列而且能够结合HLA-A2抗原并被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。
具体地说，本发明肿瘤抗原肽的实例包括1)SEQ ID NO:3-52中任一个所示氨基酸序列组成的肽；和2)包含SEQ ID NO:3-52中任一个所示全长氨基酸序列或连续的部分氨基酸序列而且与所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延长的肽，或由SEQ ID NO:3-52中任一种所示的连续部分氨基酸序列组成的肽；所述肽能够结合至相应的HLA抗原并被CTL识别。鉴于上述2)中的所述肽与相应的HLA抗原结合并提呈的事实，所述肽可能约8-11个氨基酸长度。
本发明HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽的合适实例包括包含SEQID NO:3-9中任何一个所示全部或部分氨基酸序列而且能够结合HLA-A24抗原并被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。具体地说，实例有1)SEQ ID NO:3-9中任何一个所示氨基酸序列组成的肽；和2)包含SEQ ID NO:3-9中任何一个所示的全长氨基酸序列或连续的部分氨基酸序列而且与所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延长的肽，或SEQ ID NO:3-9中任何一个所示的连续的部分氨基酸序列组成的肽；所述肽能够结合至HLA-A24抗原并被CTL识别。鉴于上述2)中的肽结合并提呈在HLA-A24抗原上的事实，所述肽可能为约8-11个氨基酸长度。
本发明HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽的合适实例包括包含SEQ IDNO:25-29中任何一个所示全部或部分氨基酸序列而且能够结合HLA-A2抗原并被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。具体地说，实例有1)SEQ ID NO:25-29中任何一个所示氨基酸序列组成的肽；和2)包含SEQ ID NO:25-29中任何一个所示的全长氨基酸序列或连续的部分氨基酸序列而且与所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延长的肽，或SEQ ID NO:25-29中任何一个所示的连续的部分氨基酸序列组成的肽；所述肽能够结合至HLA-A2抗原并被CTL识别。鉴于上述2)中的肽结合并提呈在HLA-A2抗原上的事实，所述肽可能为约8-11个氨基酸长度。
在本发明中，术语“具有与肿瘤抗原肽相同功能特性的衍生物”(下文可简称为肿瘤抗原肽衍生物)是指其氨基酸序列是在本发明肿瘤抗原肽氨基酸序列中包含一个或多个、优选1个至数个改变的氨基酸残基而且具有肿瘤抗原肽特性(能够结合至HLA抗原并被CTL识别)的改变的肽。因此，所有改变的肽均属于本发明肿瘤抗原肽范围，只要它们在本发明肿瘤抗原肽氨基酸序列中含有一个或多个改变氨基酸残基而且具有肿瘤抗原肽特性(即能够结合至HLA抗原并被CTL识别)。
在这种情况下，氨基酸残基“改变”是指取代、缺失和/或添加(包括在所述肽的N末端和/或C末端添加氨基酸)氨基酸残基，优选取代氨基酸残基。对于包含氨基酸残基取代的改变，尽管只要保持肿瘤抗原肽活性可任意确定被取代的氨基酸残基的数目和位置，但是优选一个至数个残基被取代，因为如上所述肿瘤抗原肽通常为约8-14个氨基酸长度。
在上述肿瘤抗原肽的情况下，尽管HLA-DR、-DP和-DQ的衍生物也可能具有14或更长氨基酸长度，但是本发明肿瘤抗原肽衍生物的优选长度为约8-14个氨基酸。
可根据上述肽制备方法合成包含本发明肿瘤抗原肽的改变部分的改变的肽，并对肿瘤抗原肽进行上述分析，从而鉴定本发明的这类肿瘤抗原肽衍生物。
如上所述，已经阐明结合至并提呈在HLA型例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602上的肽的序列规律(基元)。如上所述，可在互联网上进一步检索预期能够结合HLA抗原的肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/mo1bio/hla bind/)。所以，可以根据这类基元制备在本发明肿瘤抗原肽中含有改变的氨基酸的肿瘤抗原肽衍生物。
例如关于结合至并提呈在HLA-A24上的抗原肽基元，如上所述，已知在8-11个氨基酸组成的肽的序列中，位置2的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同样，已知HLA-A2的上表1所示的基元。此外，在互联网(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)上公开了预期能够结合HLA抗原的肽序列，具有类似于符合所述基元的氨基酸的性质的氨基酸残基也是可以的。所以，本发明肿瘤抗原肽衍生物的实例包括包含其中根据所述基元在允许取代的任何位置(对于HLA-24和HLA-A2而言为位置2和C末端)的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸(优选根据上述互联网预期能够结合所述抗原的氨基酸残基)取代的本发明肿瘤抗原肽的全部或部分氨基酸序列的那些肽衍生物，而且这类肽衍生物具有结合至HLA抗原并被CTL识别的活性。优选实例为包含其中将取代的氨基酸残基选自按照上述基元的所述位置的氨基酸残基的全部或部分氨基酸序列的这些肿瘤抗原肽衍生物，而且这类衍生物具有上述活性。“完整或部分”氨基酸序列的优选长度为约8-14个氨基酸，尽管HLA-DR、-DP和-DQ可以为14或更多氨基酸长度。
HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽衍生物实例包括包含下述完整或部分氨基酸序列的肽衍生物在所述氨基酸序列中，在衍生自具有HLA-A24或HLA-A2的结合基元的SART-3氨基酸序列的肽中，根据上述基元在允许取代的位置、具体地说是位置2和/或C末端的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基(优选为预期能够结合按照上述互联网的抗原的氨基酸)取代，并且这类衍生物具有上述活性。优选实例为这样的肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在位置2和/或C末端的氨基酸残基被按照上述基元涉及的氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。在这些HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽衍生物中，“完整或部分”的所述氨基酸序列的优选长度为约8-11个氨基酸。
具体来说，实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQID NO:3-52中任一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基(如上所述优选预期能够结合互联网上的所述抗原的氨基酸)取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。优选实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQID NO:3-52中任一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被按照上述基元涉及的氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。准确地说，HLA-A24-限制性肿瘤抗原衍生物的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQID NO:3-24中任一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。同样，HLA-A2-限制性肿瘤抗原衍生物的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQ ID NO:25-52中任一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。
本发明HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽衍生物的合适实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQ ID NO:3-9中任何一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。更优选的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQ ID NO:3-9中任何一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。这类肿瘤抗原肽衍生物的合适实例见SEQ ID NO:53-59。
本发明HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽衍生物的合适实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQ ID NO:25-29中任何一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。更优选的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物它们包含其中在SEQ ID NO:25-29中任何一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且这类衍生物具有上述活性。这类肿瘤抗原肽衍生物的合适实例见SEQ ID NO:60-64。
本发明肿瘤抗原肽或其衍生物可以单独或与另一种或多种本发明肿瘤抗原肽或其衍生物作为药用组合物用于治疗或预防肿瘤。即本发明提供用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的所述肿瘤抗原肽或其衍生物。当将用于治疗或预防肿瘤的包含作为活性成分的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的组合物给予SART-3阳性患者时，所述肿瘤抗原肽或其衍生物与抗原提呈细胞的HLA抗原一起被提呈，所以，提呈的HLA抗原复合物特异性的CTL增殖并破坏所述肿瘤细胞。因此，可以治疗所述患者的肿瘤，或者可以防止所述肿瘤的增殖或转移。SART-3广泛存在于鳞状细胞癌如食管癌上，因而按照本发明用于治疗或预防肿瘤的组合物在广泛适用性方面具有优势。鳞状细胞癌通常对化疗和放疗具有耐药性，所以本发明用于治疗肿瘤的组合物也可通过其联合应用增强治疗效果。
包含作为活性成分的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的用于治疗或预防肿瘤的药用组合物可以和佐剂一起给予，以便有效建立所述细胞免疫，或者可以以颗粒剂型给予。为此，可应用文献(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中描述的佐剂。另外，也可以应用脂质体制剂、其中所述成分结合到直径数μm的微珠上的颗粒剂或其中所述成分结合到脂质的制剂。例如可以皮内、皮下或静脉内注射给药。虽然在要给予的制剂中的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的量可以根据例如需要治疗的疾病、患者的年龄和体重调适，但是通常每隔数天或数月给予0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-100mg，更优选0.01mg-10mg。
此外，按照本发明用于治疗或预防肿瘤的组合物也可以含有作为活性成分的重组DNA或重组多肽，该重组DNA含有至少一种编码本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA，所述重组多肽可通过表达所述重组DNA获得，详见下文。
关于此，术语“重组DNA”是指编码一部分本发明肿瘤抗原蛋白组成的部分多肽、部分肽、其衍生物、其中组合这类肽的多位(polytope)等的任何DNA。所有的DNA，只要它们含有至少一种编码本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA，就均属于本发明重组DNA范畴。这种重组DNA可掺入合适表达载体中以产生用于治疗或预防肿瘤的药用组合物含有的活性成分。
术语“多位”是指多种CTL表位的组合肽，而且最近已经应用编码这种多位的DNA进行DNA疫苗接种。参见例如J.of Immunology,160，第1717页，1998。可通过将编码本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的一种或多种DNA相互连接制备编码本发明多位的DNA，需要的话，还可连接入编码其它肿瘤抗原肽的DNA。
按照常规DNA合成和基因工程技术，例如按照标准讲义如“Molecular Cloning”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)所述，可容易地制备本发明的重组DNA。也可以按照标准讲义等将所述重组DNA掺入表达载体。
按照例如测定本发明DNA活性的上述方法可测定以上制备的本发明重组DNA是否可以产生能够结合HLA抗原并被CTL识别的肿瘤抗原肽。同样，本发明的重组DNA用作治疗药物或预防药物的方法与本发明DNA的方法相同。
如上所述，通过表达本发明重组DNA可获得的“重组多肽”也可用于治疗或预防肿瘤的药用组合物。
可用与上述本发明蛋白相似的方法制备本发明的重组多肽。同样，可按照与本发明蛋白相似的方法测定以上制备的本发明重组多肽是否具有一定活性。此外，本发明重组多肽用作治疗药物或预防药物的方法与本发明蛋白或肽的方法相同。
本发明还提供特异性结合本发明肿瘤抗原蛋白、本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体。例如按照“Antibodies:A Laboratory Manual”,Lane,H.D.等编辑，C1od Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中描述的方法容易制得这类抗体。准确地说，采用所述肿瘤抗原肽或其衍生物以常规方法适当免疫动物，可容易地制得识别本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体和进一步中和其活性的抗体。这类抗体可以用于亲和层析、免疫诊断等。免疫诊断可根据需要选择免疫印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等。
本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白、其基因、或本发明的重组DNA或重组多肽也可以如下体外用于治疗肿瘤患者。
应用肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或它们的基因治疗肿瘤时，重要的是建立能够在患者体内有效诱导特异性CTL的给药方法。因此一种方法是，本发明提供其中HLA抗原和本发明肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞表面上的抗原提呈细胞，而且本发明还提供包含作为活性成分的所述抗原提呈细胞的治疗肿瘤的药用组合物。
在这方面，“具有抗原提呈能力的细胞”不限于具体细胞，前提是它是在其细胞表面上表达能够提呈本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的HLA抗原的细胞，优选树突细胞，据报道其提呈抗原的能力特别高。
需要加入以由上述具有抗原提呈能力的细胞制备本发明的抗原提呈细胞的物质可以是本发明肿瘤抗原肽或其衍生物以及本发明的DNA、蛋白质、重组DNA或重组多肽。当使用蛋白或DNA形式时，必须将其导入细胞中。
为了制备本发明的抗原提呈细胞，从肿瘤患者分离具有抗原提呈能力的细胞，并用本发明肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或重组多肽体外进行脉冲处理，以提呈HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998；J.Immunol.158:1796,1997；Cancer Res.,59:1184,1999)。当使用树突细胞时，例如可用以下步骤制备本发明抗原提呈细胞采用Ficoll法从肿瘤患者外周血分离淋巴细胞，去除非粘附细胞，在GM-CSF和IL-4存在下培养粘附细胞，以诱导树突细胞，用本发明肿瘤抗原肽或肿瘤抗原蛋白等培养并脉冲处理所述树突细胞。
当通过将本发明的DNA或重组DNA导入上述具有抗原提呈能力的细胞中制备本发明抗原提呈细胞时，所述基因可以是DNA或RNA形式。具体而言，可参阅例如Cancer Res,56:5672,1996或J.Immunol.,161:5607,1998使用DNA，而可通过参阅例如J.Exp.Med.,184:465,1996使用RNA。
用于治疗肿瘤包含作为活性成分的上述抗原提呈细胞的药用组合物最好含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等，以便稳定维持所述抗原提呈细胞。例如可以静脉内、皮下或皮内给予药用组合物。通过将这样的包含作为活性成分的抗原提呈细胞的治疗肿瘤的组合物再导入所述患者体内，在所述SART-3阳性患者体内有效诱导特异性CTL，以实现肿瘤治疗。确定无疑的是，所述患者和所用的肽之间的HLA类型需要匹配，因此HLA-A24限制性肿瘤抗原肽或其衍生物必须用于HLA-A24阳性肿瘤患者。
此外，在以下过继免疫疗法中体外应用按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白、其DNA、重组DNA或重组多肽为其另一应用实例。
在黑素瘤已经观测到过继免疫疗法获得的治疗效应，其中体外大量培养从所述患者自身取出的肿瘤侵润T细胞，然后再回输给所述患者(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。同样，在小鼠黑素瘤通过用肿瘤抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，因此增殖所述肿瘤抗原肽特异性CTL，然后将所述CTL给予移植黑素瘤的小鼠，观测到对所述小鼠黑素瘤转移的抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。获得这样的结果是因为特异性识别抗原提呈细胞的HLA抗原和所述肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL体外增殖所致。所以，认为治疗肿瘤的方法是有效的，所述方法包括利用按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或它们的DNA体外刺激患者的外周血淋巴细胞，以增殖肿瘤特异性CTL，然后将所述CTL返回所述患者体内。
因此，本发明提供特异性识别所述HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的CTL，而且还提供包含作为活性成分的所述CTL的用于治疗肿瘤的药用组合物。这种组合物优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等以稳定保持CTL。例如可以静脉内、皮下或皮内给予所述药用组合物。通过将包含作为活性成分的CTL的用于治疗肿瘤的组合物再导入所述患者体内，CTL针对所述肿瘤细胞的毒性作用在SART-3阳性患者中得到加强，而因此破坏所述肿瘤细胞，达到治疗所述肿瘤。
按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或其重组多肽也可以用作诊断肿瘤的诊断试剂活性成分。准确地说，通过将按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物本身用作检测得自怀疑患有肿瘤的患者的标本(例如血液或肿瘤组织)中存在的抗体的诊断试剂，可以早期检测到肿瘤并可诊断肿瘤的复发和转移。相同的方法也可用于选择适用包含作为活性成分的例如本发明的肿瘤抗原肽的药物的肿瘤患者。具体来说，可应用免疫印迹、RIA、ELISA或荧光或发光测定进行这样的诊断。
此外，近年来，已经建立了利用所述抗原肽和HLA抗原之间的复合物检测抗原特异性CTL的新型检测方法(Science,274:94,1996)。通过将按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物和HLA抗原之间的复合物用于上述检测法，因此检测肿瘤抗原特异性CTL，从而可以早期检测肿瘤并诊断肿瘤的复发或转移。相同的方法也可用于选择适用包含作为活性成分的例如本发明的肿瘤抗原肽的药物的肿瘤患者；或者用于确定所述药物的治疗作用。因此，本发明还提供包含按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的肿瘤诊断试剂。
具体来说，可以如下进行这样的诊断制备按照文献(Science,274:94,1996)所述方法荧光标记的HLA抗原和肿瘤抗原肽之间的复合物的四聚体，用其利用流式细胞仪定量检测怀疑患有肿瘤的患者的外周血淋巴细胞中的所述抗原肽特异性CTL。
本发明还提供由得自结肠癌的肿瘤侵润淋巴细胞建立的CTL的OK-CTL(保藏号FERM BP-6818)。已证实OK-CTL是HLA-A2-限制性的。所以，利用OK-CTL可发现新的肿瘤抗原蛋白和HLA-A2限制性肿瘤抗原肽。详见下文的实施例8。
采用如下的脂质转染法，用KE-4 cDNA的重组质粒和HLA-A2402 cDNA的重组质粒双重转染成纤维细胞系VA-13细胞(RIKENCELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research；Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.,44:242-254,1966)。将7000个VA-13细胞加入96孔平底微量培养板的各孔中，在含有10％FCS的100μl RPMI 1640培养基中培养2天。采用脂质转染试剂(GIBCO BRL)，从70μl混合物中取30μl加入到VA-13细胞中，并使它们被双重转染，所述混合物组成为25μl相当于约100个转化体的KE-4 cDNA重组质粒、10μl(200ng)参考2所述HLA-A2402 cDNA的重组质粒和35μl约稀释35倍的脂质转染试剂。复份制备转染子。5小时后，将200μl含有10％FCS的培养基加入到所述转染子中，再于37℃培养72小时。去除所述培养基后，每孔加入10,000个KE-4CTL细胞，在100μl含有10％FCS和25U/mlIL-2的培养基中于37℃培养24小时。回收所述培养基，如下所述用ELISA检测所述培养物中的IFN-γ量。
具体地说，使抗人IFN-γ小鼠单克隆抗体吸附于96孔微量培养板的各孔上，用作固相抗体，用牛血清白蛋白封闭非特异性结合后，使所述抗体与上述样品中的IFN-γ结合。然后使用作检测抗体的抗人IFN-γ兔多克隆抗体与其结合，在与碱性磷酸酶标记的抗兔免疫球蛋白山羊抗体结合后，使用作显色底物的磷酸对硝基苯酯反应。加入等体积1N NaOH猝灭该反应后，于405nm检测吸光度。比较该吸光度与用标准IFN-γ获得的吸光度，以确定所述样品中的IFN-γ量。
关于其中观察到高产量IFN-γ的各个组，将约100个含有KE-4cDNA重组质粒的转化体的相应冷冻保藏合并物用于以下筛选。将所述转化体合并物平板接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上以获得菌落。如上所述，培养每组的200个菌落使得每孔含有单一种类的转化体，由此制备KE-4 cDNA的重组质粒DNA。然后，用KE-4 cDNA的重组质粒和HLA-A2402 cDNA的重组质粒双重转染VA-13细胞，然后与KE-4CTL共培养，如上所述定量检测因KE-4CTL反应产生的IFN-γ，以便选择阳性质粒。这样，选择了一个KE-4cDNA重组质粒克隆并命名为克隆13。另外的分析提示克隆13掺入约1.2kb cDNA。此外，用克隆13重复相似的步骤以按照上述相同方法检测KE-4CTL产生的IFN-γ量。结果示于以下表2。表2靶细胞 KE-4CTL产生的IFN-γ量(pg/ml)VA-13细胞+HLA-A2402326VA-13细胞+HLA-A2402+克隆13 775与只用HLA-A2402转染的VA-13细胞相比，KG-4CTL与用HLA-A2402和克隆13双重转染的VA13细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明克隆13编码的蛋白是肿瘤抗原蛋白。
首先，采用RNAzol B(TEL-TEST,Inc.)从食管癌细胞系KE-4制备RNA。使5μg RNA在甲酰胺和甲醛存在下变性，在琼脂糖上电泳，然后转移并固定在Hybond-N+尼龙膜上(Amersham)。采用Multiprime DNA标记系统(Amersham)，用32P标记克隆13的插入序列区以制备DNA探针。按照已知方法(Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated，第二卷，“Idenshi-Kaiseki-No-Kiso(基因分析的基础)”，第148-151页，Shuiunsha,1995)，使该探针杂交到所述膜上的RNA，并进行放射性自显影以检测掺入克隆13的cDNA的mRNA，提示所述mRNA全长约3.8kb。然后克隆以上制备的克隆13中含有的所述全长cDNA克隆。将上述参考3所述的KE-4衍生的cDNA文库平板接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上获得菌落。然后按照生产商的方案将菌落转移并固定于Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上。在上述相同条件下，应用其中用32p标记克隆13的插入序列的DNA探针进行杂交和放射性自显影，以便选择为阳性转化体的菌落。然后从选定的许多菌落回收重组质粒，用限制酶NotⅠ和SAlⅠ处理，再后在琼脂糖上电泳以确定掺入cDNA的长度。选择掺入约3.8kb cDNA的重组质粒并命名为克隆K。用上述掺入所述肿瘤抗原蛋白基因cDNA的重组质粒克隆K和另一种含有HLA-A-2402cDNA的重组质粒双重转染VA-13细胞，将所述细胞用作靶细胞。按照上述方法测定KE-4CTL反应产生的IFN-γ量。结果见表3。表3靶细胞 KE-4CTL产生的IFN-γ量(pg/ml)VA-13细胞+HLA-A2403 342VA-13细胞+HLA-A2402+克隆K627与只用HLA-A2402转染的VA-13细胞相比，KE-4CTL与用HLA-A2402和克隆K双重转染的VA13细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明克隆K编码的蛋白是肿瘤抗原蛋白。克隆K编码的肿瘤抗原蛋白称为SART-3(T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-3)。
然后按照文献(J.Exp.Med.,187:277,1998)，用HLA-A2402 cDNA的重组质粒通过脂质转染法转染1.8×104VA-13细胞，以表达HLA-A2402。在2小时内以10μM向这些细胞中分别加入先前合成的具有HLA-A24结合基元的各种肽，以对所述细胞施以脉冲。然后将所述细胞与2×104KE-4CTL培养18小时，用ELISA法测定在培养物上清液中KE-4CTL产生的IFN-γ量。对肿瘤抗原蛋白SART-3的氨基酸序列中的7种肽进行的测定的结果见表4，所述7种肽是包括位置109-位置118的序列的肽“109-118”(SEQ ID NO:3)、包括位置172-位置181的序列的肽“172-181”(SEQ ID NO:4)、包括位置284-位置292的序列的肽“284-292”(SEQ ID NO:5)、包括位置315-位置323的序列的肽“315-323”(SEQ ID NO:6)、包括位置416-位置425的序列的肽“416-425”(SEQ ID NO:7)、包括位置426-位置434的序列的肽“426-434”(SEQ ID NO:8)和包括位置448-位置456的序列的肽“448-456”(SEQ ID NO:9)表4肽上清液IFN-γ(pg/ml)“109-118”928“172-181”830“284-292”794“315-323”880“416-425”731“426-434”833“448-456”754无 677与没有用肽脉冲处理的细胞相比，KE-4CTL与用所述肽脉冲处理的细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明所述7种肽起肿瘤抗原肽的作用。
在该树脂中加入2ml试剂K(5％苯酚，5％苯硫基甲烷，5％H2O和2.5％乙二硫酚的TFA溶液)，使该混合物在室温下反应2.5小时。用冰冷却的同时，向该反应物中加入10ml乙醚，搅拌该混合物10分钟，过滤，用10ml乙醚洗涤。向该滤饼中加入10ml醋酸水溶液，搅拌该混合物30分钟。然后过滤该树脂，用4mL醋酸水溶液洗涤。冻干滤液和洗涤液后，将获得粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在180分钟内将乙腈浓度升高至25％的同时，以7ml/min的流速进行洗脱。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得31.0mgVal-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu。
用含0.1％TFA的16-46％乙腈线性浓度梯度洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)分析，所获得的肽Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu的保留时间为19.3分钟，所述产物的氨基酸分析(未检测Cys)和质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,8小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx:2.77(3)Val:1.70(2)*Leu:1.00(1)Tyr:1.98(2)His:0.91(1)质谱(FAB)[M+H]+:1241表5流程1步骤处理时间(分钟)×处理次数1．(洗涤)DMF 1.2ml 1×22．(去保护)50％哌啶/DMF 12×13．(洗涤)DMF 1.2ml 1×74．(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当 30×1量)/NMP溶液0.9ml,DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml5．(洗涤)DMF 1.2ml 1×26．(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当 30×1量)/NMP溶液0.9ml,DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml7．(洗涤)DMF 1.2ml 1×4(2)合成SART-3“172-181”Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile(SEQ ID NO:4)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Ile-Alko树脂(0.41mmol/g,100-200目)，依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Leu-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在300分钟内将乙腈浓度升高至30％的同时，以7ml/min流速进行洗脱。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得66.3mg Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile。
在用含有0.1％TFA的12-42％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile的保留时间为23.8分钟，所述产物的氨基酸分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,12小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx: 0.94(1)Glx:1.03(1)Ala:1.00(1)Val:0.88(1)Ile:0.92(1)*Leu:1.00(1)Tyr:0.96(1)Phe:0.97(1)Lys:1.45(2)质谱(FAB):[M+H]+:1225(3)合成SART-3“284-292”Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu(SEQ ID NO:5)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko树脂，依次偶联Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asn-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在300分钟内将乙腈浓度升高至30％的同时，以7ml/min流速进行洗脱。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得25.0mg Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-GLn-Leu。
在用含有0.1％TFA的12-42％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-GLn-Leu的保留时间为19.0分钟，所述产物的氨基酸分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,12小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx:1.87(2)Glx:2.03(2)Ala:0.98(1)*Leu:2.00(2)Tyr:0.99(1)Lys:0.97(1)质谱(FAB):[M+H]+:1091(4)合成SART-3“315-323”Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile(SEQ ID NO:6)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Ile-Alko树脂(0.62mmol/g,100-200目)，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Ala-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在180分钟内将乙腈浓度升高至40％的同时，以7ml/min流速进行洗脱。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得15.4mg Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile。
在用含有0.1％TFA的21-51％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile的保留时间为19.6分钟，所述产物的氨基酸分析(未检测Met)以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,12小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内Asx:0.91(1)Glx:1.06(1)Ala:1.06(1)Ile:1.69(2)Tyr:0.81(1)*Phe:1.00(1)Lys:0.87(1)质谱(FAB):[M+H]+:1130(5)合成SART-3“416-425”Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu(SEQ ID NO:7)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko树脂，依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在180分钟内将乙腈浓度升高至35％的同时，以7ml/min流速进行洗脱。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得18.9mg Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu。
在用含有0.1％TFA的25-55％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu的保留时间为20.5分钟，所述产物的氨基酸分析(未检测Trp)以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,10小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内Asx:1.00(1)Glx:2.09(2)Ala:1.04(1)Val:0.89(1)Ile:0.86(1)*Leu:1.00(1)Tyr:1.95(2)质谱(FAB):[M+H]+:1300(6)合成SART-3“426-434”Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe(SEQ ID NO:8)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Phe-Alko树脂(0.72mmol/g,100-200目)，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后以7ml/min流速进行洗脱，同时在240分钟内将乙腈浓度升高至25％。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得34.0mg Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe。
在用含有0.1％TFA的12-42％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Ala-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe的保留时间为20.1分钟，所述产物的氨基酸分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,12小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内:
Asx:1.90(2)Val:0.95(1)*Leu:1.00(1)Tyr:1.00(1)Phe:0.99(1)Arg:2.93(3)质谱(FAB):[M+H]+:1239(7)合成SART-3“448-456”Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu(SEQ ID NO:9)按照类似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko树脂，依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Ala-OH，然后将产物去保护。将获得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后以7ml/min流速进行洗脱，同时在240分钟内将乙腈浓度升高至30％。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得22.8mg Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu。
在用含有0.1％TFA的20-50％线性浓度梯度乙腈洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu的保留时间为18.1分钟，所述产物的氨基酸分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃,12小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内Thr:0.91(1)Glx:1.03(1)Ala:1.91(2)*Leu:2.00(2)Tyr:1.00(1)Phe:0.97(1)Arg:0.97(1)质谱(FAB):[M+H]+:1083实施例6用肿瘤抗原肽及其衍生物从外周血淋巴细胞诱导CTL研究了用实施例5合成的肽“109-118”(SEQ ID NO:3)和“315-323”(SEQ ID NO:6)从外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL的能力。
采用Ficoll法从HLA-A基因座的A24杂合子(分别称为HD1和HD2)的健康提供者的外周血分离淋巴细胞。将淋巴细胞以2×106细胞/孔加入24孔培养板的各孔中，并用淋巴细胞培养基培养。以10μM将上述肿瘤抗原肽加入所述培养基中刺激外周血淋巴细胞。1周后，加入上述肿瘤抗原肽达到10μM，同时加入约2×105X-辐射(50 Gy)的外周血淋巴细胞，以进行第二次刺激。再过1周后，以相同的方法进行第三次刺激。第三次刺激后1周收获培养的淋巴细胞。用以下两种细胞作靶细胞(1×104细胞)表达SART-3的HLA-A2402-阳性的白血病T细胞系MT-2和表达SART-3的HLA-A2402-阴性的白血病T细胞系RPMI8402，按照类似于实施例1的ELISA检测法检测上述淋巴细胞(8×104细胞)应答所述靶细胞时在培养基中产生的IFN-γ量。结果见表6。表6上清液中的IFN-γ(pg/ml)HD1 HD2抗原肽 MT-2RPMI8402 MT-2RPMI8402“109-118” 1771159 207828“315-323” 204126 974 40无 552 154 413 69用“109-118”和“315-323”肽刺激的外周血淋巴细胞与HLA-A24-阳性MT-2反应，而不能与HLA-A24-阴性细胞RPMI8402反应，说明诱导HLA-A24-限制性类型的肿瘤抗原肽特异性CTL。
同样，用HLA-A24 cDNA的表达质粒导入其中而且用上述肽脉冲处理的COS-7细胞(ATCC号CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELLBANK,The Institute of Physical and Chemical Research)代替在上述试验中使用的MT-2，可进行相似的试验(J.Exp.Med.,187:277,1998)。
按照Naka等Cancer Res,55:4248-4252(1995)的描述，由SW620细胞(ATCC号CCL-227)制备其中HLA-A0201(GenBank收录号M84379)的cDNA已导入表达载体pCR3(INVITROGEN)的重组质粒。用以下转化体作靶细胞通过采用类似于实施例1的脂质转染法，用掺入SART-3基因cDNA的重组质粒克隆K和掺入HLA-A0201cDNA的重组质粒双重转染非洲绿猴肾脏细胞系COS-7(ATCC号CRL1615)(1×104细胞)制备的转化体，用ELISA测定5×104OK-CTL在应答所述靶细胞时产生的IFN-γ量。对照组为未用质粒转染的非处理组以及其中用重组质粒克隆K和掺入HLA-A2402 cDNA的重组质粒双重转染的组。结果见表7。表7靶细胞OK-CTL产生的IFN-γ量(pg/ml)COS-7 653COS-7+HLA-A0201+K 2401COS-7+HLA-A2402+K 600与其它靶细胞组相比，OK-4CTL与用掺入SART-3基因cDNA的重组质粒克隆K和掺入HLA-A0201 cDNA的重组质粒双重转染的靶细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明肿瘤抗原蛋白SART-3的抗原肽提呈在HLA-A0201上，而且OK-CTL识别它，提示SART-3含有HLA-A2限制性肿瘤抗原肽。
然后在2小时内以10μM用预先合成的预期能够结合HLA-A0201的各种肽，对1×104T2细胞施以脉冲，其中T2细胞是HLA-A0201阳性而且缺乏提呈内源肽能力的T-B杂交瘤细胞系。然后将所述细胞与6×104OK-CTL培养18小时，用ELISA法测定在培养物上清液中OK-CTL产生的IFN-γ量。对肿瘤抗原蛋白SART-3的氨基酸序列中的5种肽进行的测定的结果见表8，所述5种肽是包括位置152-位置160的序列的肽“152-160”(SEQ ID NO:25)、包括位置249-位置257的序列的肽“249-257”(SEQ ID NO:26)、包括位置302-位置310的序列的肽“302-310”(SEQ ID NO:27)、包括位置309-位置317的序列的肽“309-317”(SEQ ID NO:28)和包括位置386-位置394的序列的肽“386-394”(SEQ ID NO:29)。表8肽 上清液IFN-γ(pg/ml)*“152-160” 162“249-257” 209“302-310” 190“309-317” 213“386-394” 122*其中数值为减去未用肽脉冲处理的T2细胞产生的IFN-γ量的数值。
与没有用肽脉冲处理的细胞相比，KE4-CTL与用所述肽脉冲处理的细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明这5种肽起HLA-A2限制性肿瘤抗原肽的作用。
同样，用HLA-A2402 cDNA的表达质粒导入其中的COS-7细胞(ATCC号CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK,The Instituteof Physical and Chemical Research)代替在本试验中使用的T2细胞，可进行相似的试验(J.Exp.Med.,187:277,1998)。序列表独立文本在SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，而第九个氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，而第九个氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，而第九个氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，而第九个氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，而第九个氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。
工业适用性按照本发明能够提供新型肿瘤抗原蛋白及其基因、源自所述抗原蛋白的肿瘤抗原肽及其衍生物、以及体内或体外利用所述肿瘤抗原蛋白、基因、肿瘤抗原肽或其衍生物治疗、预防或诊断肿瘤。
序列表<110>ITOH,Kyogo；Sumitomo Pharmaceuticals Company,Limited<120>新型肿瘤抗原SART-3及其肿瘤抗原肽<130>661463<150>日本98-242660<151>28.08.98<160>64<210>1<211>963<212>PRT<213> 人<400> 1Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu Ala Glu Ser5 10 15Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val Lys Ala Ala20 25 30Arg Thr Arg Arg Lys Val Leu Ser Arg Ala Val Ala Ala Ala Thr Tyr35 40 45Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly Val Ser Glu50 55 60Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu Ser Ser Pro65 70 75 80Gly Glu Tyr Glu Trp Glu TyrAsp Glu Glu Glu Glu Lys Asn Gln Leu85 90 95Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val Tyr Asp Tyr100 105 110Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Leu115 120 125Thr Lys Val Arg Met Ala Arg Gln Lys Met Ser Glu Ile Phe Pro Leu130 135 140Thr Glu Glu Leu Trp Leu Glu Trp Leu His Asp Glu Ile Ser Met Ala145 150 155 160Gln Asp Gly Leu Asp Arg Glu His Val Tyr Asp Leu Phe Glu Lys Ala165 170 175Val Lys Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu Glu Tyr Gly Gln Tyr180 185 190Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Lys Gly Gly Leu Glu Lys Val Arg Ser195 200 205Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val Gly Leu His Met Thr Lys Gly210 215 220Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile Val Glu225 230 235 240Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala245 250 255Ile Pro Leu Tyr Asp Met Glu Ala Thr Phe Ala Glu Tyr Glu Glu Trp260 265 270Ser Glu Asp Pro Ile Pro Glu Ser Val Ile Gln Asn Tyr Asn Lys Ala275 280 285Leu Gln Gln Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala Leu Leu Gln290 295 300Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile Asp Phe Glu305 310 315 320Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala325 330 335Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln340 345 350Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu Ser Val His
355 360 365Asn Arg Ala lle Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu Trp Ser Arg370 375 380Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln Val Ile Ser385 390 395 400Val Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln Ala Thr Asp405 410 415Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val420 425 430Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala435 440 445Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu Glu Arg Phe450 455 460Asn Glu Ser Gly Asp Pro Ser Cys Val Ile Met Gln Asn Trp Ala Arg465 470 475 480Ile Glu Ala Arg Leu Cys Asn Asn Met Gln Lys Ala Arg Glu Leu Trp485 490 495Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn Met Trp Leu500 505 510Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln His Cys Arg515 520 525Lys Ala Leu His Arg Ala Val Gln Cys Thr Ser Asp TyrPro Glu His530 535 540Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly Ser Leu Glu545 550 555 560Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu Ala Arg Val565 570 575Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala Leu Val Gln580 585 590Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg Ala Glu Lys595 600 605Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu Lys Arg Gly610 615 620Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gln625 630 635 640Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala Ala Gly Glu645 650 655Thr Gln Asn Val Glu Val Ala Ala Gly Pro Ala Gly Lys Cys Ala Ala660 665 670Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala Ala Ser Leu675 680 685Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile690 695 700Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr705 710 715 720Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val Gln Ile Arg725 730 735Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu740 745 750Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met Asp Arg Lys755 760 765Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val Ser Pro Cys Val Asp Lys Ser770 775 780Lys Asn Pro Asp Phe Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser Leu Glu Lys785 790 795 800His Lys Leu Phe Ile Ser Gly Leu Pro Phe Ser Cys Thr Lys Glu Glu805 810 815Leu Glu Glu Ile Cys Lys Ala His Gly Thr Val Lys Asp Leu Arg Leu
820 825 830Val Thr Asn Arg Ala Gly Lys Pro Lys Gly Leu Ala Tyr Val Glu Tyr835 840 845Glu Asn Glu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Val Met Lys Met Asp Gly Met850 855 860Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn Pro Pro Gln865 870 875 880Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro Gly Gly Pro885 890 895Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala Arg Gly Lys Gly Arg Thr Gln900 905 910Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Ala Pro915 920 925Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Pro Ala930 935 940Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu Phe945 950 955 960Leu Arg Lys963<210> 2<211> 3798<212> DNA<213> 人<400> 2ccacgcgtcc g atg gcg act gcg gcc gaa acc tcg gct tca gaa ccc gag 50Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu5 10gct gag tcc aag gct ggg ccc aag gct gac gga gag gag gat gag gtt 98Ala Glu Ser Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val15 20 25aag gcg gct agg aca agg aga aag gtg tta tcg cgg gct gtg gcc gct 146Lys Ala Ala Arg Thr Arg Arg Lys Val Leu Ser Arg Ala Val Ala Ala30 35 40 45gcg aca tac aag acc atg ggg cca gcg tgg gat cag cag gag gaa ggc 194Ala Thr Tyr Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly50 55 60gtg agc gag agc gat ggg gat gag tac gcc atg gct tcc tcc gcg gag 242Val Ser Glu Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu65 70 75agc tcc ccc ggg gag tac gag tgg gaa tat gac gaa gag gag gag aaa 290Ser Ser Pro Gly Glu Tyr Glu Trp Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Glu Lys80 85 90aac cag ctg gag att gag aga ctg gag gag cag ttg tct atc aac gtc 338Asn Gln Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val95 100 105tat gac tac aac tgc cat gtg gac ttg atc aga ctg ctc agg ctg gaa 386Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu110 115 120 125ggg gag ctt acc aag gtg agg atg gcc cgc cag aag atg agt gaa atc 434Gly Glu Leu Thr Lys Val Arg Met Ala Arg Gln Lys Met Ser Glu Ile130 135 140ttt ccc ttg act gaa gag ctc tgg ctg gag tgg ctg cat gac gag atc 482Phe Pro Leu Thr Glu Glu Leu Trp Leu Glu Trp Leu His Asp Glu Ile145 150 155agc atg gcc cag gat ggc ctg gac aga gag cac gtg tat gac ctc ttt 530Ser Met Ala Gln Asp Gly Leu Asp Arg Glu His Val Tyr Asp Leu Phe160 165 170gag aaa gcc gtg aag gat tac att tgt cct aac att tgg cta gag tat 578Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu Glu Tyr175 180 185ggc cag tac tca gtt ggt ggg att ggt cag aaa ggt ggc ctt gag aaa 626Gly Gln Tyr Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Lys Gly Gly Leu Glu Lys190 195 200 205gtt cgc tcc gtg ttt gaa agg gct ctc tcg tct gtt ggt tta cat atg 674Val Arg Ser Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val Gly Leu His Met210 215 220acc aaa gga ctc gcc ctc tgg gag gct tac cga gag ttt gaa agt gcg 722Thr Lys Gly Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala225 230 235att gtg gaa gct gct cgg ctt gag aaa gtc cac agt ctt ttc cgg cga 770Ile Val Glu Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg240 245 250cag ttg gcg atc cca ctc tat gat atg gag gcc aca ttt gca gag tat 818Gln Leu Ala Ile Pro Leu Tyr Asp Met Glu Ala Thr Phe Ala Glu Tyr255 260 265gaa gaa tgg tca gaa gac cca ata cca gag tca gta att cag aac tat 866Glu Glu Trp Ser Glu Asp Pro Ile Pro Glu Ser Val Ile Gln Asn Tyr270 275 280 285aac aaa gca cta cag cag ctg gag aaa tat aaa ccc tat gaa gaa gca 914Asn Lys Ala Leu Gln Gln Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala290 295 300ctg ttg cag gca gag gca cca agg ctg gca gaa tat caa gca tat atc 962Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile305 310 315gat ttt gag atg aaa att ggc gat cct gct cgc att cag ttg atc ttt 1010Asp Phe Glu Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe
320 325 330gag cgc gcc ctg gtc gag aac tgc ctt gtc cca gac tta tgg atc cgt 1058Glu Arg Ala Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg335 340 345tac agt cag tac cta gat cga caa ctg aaa gta aag gat ttg gtt tta 1106Tyr Ser Gln Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu350 355 360 365tct gta cat aac cgc gct att aga aac tgc ccc tgg aca gtt gcc tta 1154Ser Val His Asn Arg Ala Ile Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu370 375 380tgg agt cgg tac ctc ttg gcc atg gag aga cat gga gtt gat cat caa 1202Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln385 390 395gta att tct gta acc ttc gag aaa gct ttg aat gcc ggc ttc atc cag 1250Val Ile Ser Val Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln400 405 410gcc act gat tat gtg gag att tgg cag gca tac ctt gat tac ctg agg 1298Ala Thr Asp Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg415 420 425aga agg gtt gat ttc aaa caa gac tcc agt aaa gag ctg gag gag ttg 1346Arg Arg Val Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu430 435 440 445agg gcc gcc ttt act cgt gcc ttg gag tat ctg aag cag gag gtg gaa 1394Arg Ala Ala Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu450 455 460gag cgt ttc aat gag agt ggt gat cca agc tgc gtg att atg cag aac 1442Glu Arg Phe Asn Glu Ser Gly Asp Pro Ser Cys Val Ile Met Gln Asn465 470 475tgg gct agg att gag gct cga ctg tgc aat aac atg cag aaa gct cgg 1490Trp Ala Arg Ile Glu Ala Arg Leu Cys Asn Asn Met Gln Lys Ala Arg480 485 490gaa ctc tgg gat agc atc atg acc aga gga aat gcc aag tac gcc aac 1538Glu Leu Trp Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn495 500 505atg tgg cta gag tat tac aac ctg gaa aga gct cat ggt gac acc cag 1586Met Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln510 515 520 525cac tgc cgg aag gct ctg cac cgg gcc gtc cag tgc acc agt gac tac 1634His Cys Arg Lys Ala Leu His Arg Ala Val Gln Cys Thr Ser Asp Tyr530 535 540cca gag cac gtc tgc gaa gtg tta ctc acc atg gag agg aca gaa ggt 1682Pro Glu His Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly545 550 555tct tta gaa gat tgg gat ata gct gtt cag aaa act gaa acc cga tta 1730Ser Leu Glu Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu560 565 570gct cgt gtc aat gag cag aga atg aag gct gca gag aag gaa gca gcc 1778Ala Arg Val Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala575 580 585ctt gtg cag caa gaa gaa gaa aag gct gaa caa cgg aaa aga gct cgg 1826Leu Val Gln Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg590 595 600 605gct gag aag aaa gcg tta aaa aag aag aaa aag atc aga ggc cca gag 1874Ala Glu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu610 615 620aag cgc gga gca gat gag gac gat gag aaa gag tgg ggc gat gat gaa 1922Lys Arg Gly Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu625 630 635gaa gag cag cct tcc aaa cgc aga agg gtc gag aac agc atc cct gca 1970Glu Glu Gln Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala640 645 650gct gga gaa aca caa aat gta gaa gta gca gca ggg ccc gct ggg aaa 2018Ala Gly Glu Thr Gln Asn Val Glu Val Ala Ala Gly Pro Ala Gly Lys655 660 665tgt get gcc gta gat gtg gag ccc cct tcg aag cag aag gag aag gca 2066Cys Ala Ala Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala670 675 680 685gcc tcc ctg aag agg gac atg ccc aag gtg ctg cac gac agc agc aag 2114Ala Ser Leu Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys690 695 700gac agc atc acc gtc ttt gtc agc aac ctg ccc tac agc atg cag gag 2162Asp Ser Ile Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu705 710 715ccg gac acg aag ctc agg cca ctc ttc gag gcc tgt ggg gag gtg gtc 2210Pro Asp Thr Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val720 725 730cag atc cga ccc atc ttc agc aac cgt ggg gat ttc cga ggt tac tgc 2258Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys735 740 745tac gtg gag ttt aaa gaa gag aaa tca gcc ctt cag gca ctg gag atg 2306Tyr Val Glu Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met750 755 760 765gac cgg aaa agt gta gaa ggg agg cca atg ttt gtt tcc ccc tgt gtg 2354Asp Arg Lys Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val Ser Pro Cys Val770 775 780gat aag agc aaa aac ccc gat ttt aag gtg ttc agg tac agc act tcc 2402Asp Lys Ser Lys Asn Pro Asp Phe Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser
785 790 795cta gag aaa cac aag ctg ttc atc tca ggc ctg cct ttc tcc tgt act 2450Leu Glu Lys His Lys Leu Phe Ile Ser Gly Leu Pro Phe Ser Cys Thr800 805 810aaa gag gaa cra gaa gaa arc tgt aag gct cat ggc acc gtg aag gac 2498Lys Glu Glu Leu Glu Glu Ile Cys Lys Ala His Gly Thr Val Lys Asp815 820 825ctc agg ctg gtc acc aac cgg gct ggc aaa cca aag ggc ctg gcc tac 2546Leu Arg Leu Val Thr Asn Arg Ala Gly Lys Pro Lys Gly Leu Ala Tyr830 835 840 845gtg gag tat gaa aat gaa tcc cag gcg tcg cag gct gtg atg aag atg 2594Val Glu Tyr Glu Asn Glu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Val Met Lys Met850 855 860gac ggc atg act atc aaa gag aac atc atc aaa gtg gca atc agc aac 2642Asp Gly Met Thr Ile Lys Glu Ash Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn865 870 875cct cct cag agg aaa gtt cca gag aag cca gag acc agg aag gca cca 2690Pro Pro Gln Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro880 885 890ggt ggc ccc atg ctt ttg ccg cag aca tac gga gcg agg ggg aag gga 2738Gly Gly Pro Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala Arg Gly Lys Gly895 900 905agg acg cag ctg tct cta ctg cct cgt gcc ctg cag cgc cca agt gct 2786Arg Thr Gln Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala910 915 920 925gca gct cct cag gct gag aac ggc cct gcc gcg gct cct gca gtt gcc 2834Ala Ala Pro Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala930 935 940gcc cca gca gcc acc gag gca ccc aag atg tcc aat gcc gat ttt gcc 2882Ala Pro Ala Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala945 950 955aag ctg ttt ctg aga aag tgaacgggac gctgggagac aggaaatgcc2930Lys Leu Phe Leu Arg Lys960ttacttcact ctggcccggc ggacctccca ccacccagca gtgcactggg gatggacagg 2990cctggtgtgc tgcgtgctcg caaccacaga tggctcctcg gctttagaca gaaaggggaa 3050ggggttctaa gtcaagagcc tttcagtgct ccctcatatt gagggcagtg gcagaaaagt 3110gaccactctg caggctgggc ccaggatgtg gtgtcctgag atagttttgt atcttaaaga 3170ctgaggcaca gaagcgaaac gagaacacac tgtttttgag acacagttgt ccaaatgttt 3230ctggccagct ccggcccctt tttgtatgac acttctcttc caccctgcac agcacatgtg 3290cccgtcattc ttttaatttt aaaagatgaa atggcagatg ctagtaattc acagaatggc 3350ctcttgtggg ggtgggtctg agggaagtca gctataaaac atttgctgga gttttgttca 3410atggggctgt gcatttttat attatgtgtt tgtaaatgac atgtcagccc ttgtttcatg 3470tttcctaaaa gcagaatatt tgcaacattt gttttgtata ggaattattt gtgccacctg 3530ctgtggactg ttttctttgc ctagtgacta gtgacctgtg ttgtctaaac atgagtttca 3590gccctttggt tttgtttaat accatgtcaa atgcaaactt caattctccc catttagctt 3650tattaaactg acgttctctt caaaacttct tgctgaatgg tactcagatg tgcattcaca 3710tacagatgtg ttttgaagtg ggtgtacctt gctttaccta atagatgtgt aaatagaact 3770tttgtaagtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3798<210>3<211>10<212>PRT<213>人<400>3Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>人<400>4Leu Phe Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Ile5 10<210>5<211>9<212>PRT<213>人<400>5Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Gln Leu5<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Ala Tyr Ile Asp Phe Glu Met Lys Ile5<210>7<211>10<212>PRT<213>人<400>7Asp Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu5 10<210>8<211>9<212>PRT<213> 人<400>8Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val Asp Phe5<210>9<211>9<212>PRT<213>人<400>9Ala Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu5<210>10<211>9<212>PRT<213>人<400>10Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Ile5<210>11<211>10<212>PRT<213>人<400>11Ile Phe Pro Leu Thr Glu Glu Leu Trp Leu5 10<210>12<211>9<212>PRT<213>人<400>12Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu5<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Glu Tyr Gly Gln Tyr Ser Val Gly Gly Ile5 10<210>14<211>9<212>PRT<213>人<400>14Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile5<210>15<211>10<212>PRT<213>人<400>15Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala Ile Pro Leu5 10<210>16<21l>10<212>PRT<213>人<400>16Glu Tyr Glu Glu Trp Ser Glu Asp Pro Ile5 10<210>17<211>9<212>PRT<213>人<400>17Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala Leu5<210>18<211>10<212>PRT<213>人<400>18Arg Tyr Ser Gln Tyr Leu Asp Arg Gln Leu5 10<210>19<211>10<212>PRT<213>人<400>19Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe5 10<210>20<211>10<212>PRT<213>人<400>20Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu5 10<210>21<211>10<212>PRT<213>人<400>21Asp Tyr Pro Glu His Val Cys Glu Val Leu5 10<210>22<211>10<212>PRT<213>人<400>22Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu Phe5 10<210>23<211>9<212>PRT<213>人<400>23Glu Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu5<210>24<211>9<212>PRT<213>人<400>24Pro Phe Ser Cys Thr Lys Glu Glu Leu5<210>25<211>9<212>PRT<213>人<400>25Trp Leu His Asp Glu Ile Ser Met Ala
5<210>26<211>9<212>PRT<213>人<400>26Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala Ile5<210>27<211>9<212>PRT<213>人<400>27Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu5<210>28<211>9<212>PRT<213>人<400>28Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile5<210>29<211>9<212>PRT<213>人<400>29Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val5<210>30<211>9<212>PRT<213>人<400>30Asn Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val5<210>31<211>9<212>PRT<213>人<400>31Lys Met Ser Glu Ile Phe Pro Leu Thr5<210>32<211>9<212>PRT<213>人<400>32Trp Leu Glu Tyr Gly Gln Tyr Ser Val5<210>33<211>10<212>PRT<213>人<400>33Ser Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val5 10<210>34<211>10<212>PRT<213>人<400>34Ala Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu5 10<210>35<211>10<212>PRT<213>人<400>35Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu5 10<210>36<211>10<212>PRT<213>人<400>36Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala Leu Val5 10<210>37<211>9<212>PRT<213>人<400>37Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala Leu Val5<210>38<211>10<212>PRT<213>人<400>38Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln Tyr Leu5 10<210>39<211>9<212>PRT<213>人<400>39Ala Leu Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala5<210>40<211>10<212>PRT<213>人<400>40Ala Leu Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala Met5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人<400>41Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人<400>42Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln Ala Thr5 10<210>43<211>9<212>PRT<213>人<400>43Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val5<210>44<211>10<212>PRT<213>人<400>44Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala5 10<210>45<211>9<212>PRT<213>人<400>45Asn Met Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu5<210>46<211>10<212>PRT<213>人<400>46Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile5 10<210>47<211>9<212>PRT<213>人<400>47Ser Ile Thr Val Phe Val Ser Asn Leu
5<210>48<211>9<212>PRT<213>人<400>48Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr Lys Leu5<210>49<211>10<212>PRT<213>人<400>49Lys Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val5 10<210>50<211>9<212>PRT<213>人<400>50Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser Leu5<210>51<211>9<212>PRT<213>人<400>51Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala5<210>52<211>10<212>PRT<213>人<400>52Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>53Val Xaa Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Xaa5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>54Leu Xaa Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Xaa5 10<210>55<211> 9<212> PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>55Asn Xaa Asn Lys Ala Leu Gln Gln Xaa5<210>56<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>56Ala Xaa Ile Asp Phe Glu Met Lys Xaa5<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>57Asp Xaa Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Xaa5 10<210>58<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>58Asp Xaa Leu Arg Arg Arg Val Asp Xaa5<210>59<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>59Ala Xaa Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Xaa5<210>60<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>60Trp Xaa His Asp Glu Ile Ser Met Xaa5<210>61<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>61Ser Xaa Phe Arg Arg Gln Leu Ala Xaa5<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>62Leu Xaa Gln Ala Glu Ala Pro Arg Xaa5<210>63<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>63Arg Xaa Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Xaa5<210>64<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>64Leu Xaa Ala Met Glu Arg His Gly Xaa权利要求
1．一种DNA，它编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的蛋白或取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO:1氨基酸序列组成的蛋白变异体，前提是所述蛋白和蛋白变异体产生能够与HLA抗原结合而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。
2．SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的DNA或在严格条件下与所述DNA杂交的DNA变异体，前提是所述DNA或DNA变异体产生和表达的蛋白质可产生能够与HLA抗原结合而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。
3．一种表达质粒，它含有权利要求1或2的DNA。
4．一种转化体，它是用权利要求3的表达质粒转化的转化体。
5．产生重组蛋白的方法，它包括培养权利要求4的转化体，回收所表达的重组蛋白。
6．一种肿瘤抗原蛋白，它由权利要求1或2的DNA编码，或者用权利要求5的方法制得。
7．一种药用组合物，它含有作为活性成分的权利要求1或2的DNA，或权利要求6的蛋白质。
8．用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求1或2的DNA，或权利要求6的蛋白质。
9．一种肿瘤抗原肽或其具有相同功能性质的衍生物，所述肿瘤抗原肽是衍生自权利要求6的蛋白的部分肽而且能够与HLA抗原结合并被细胞毒性T淋巴细胞识别。
10．其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2的权利要求9的肿瘤抗原肽，或其具有相同功能性质的衍生物。
11．权利要求10的肿瘤抗原肽或其具有相同功能性质的衍生物，所述肿瘤抗原肽包括选自SEQ ID NO:3-52中任何一个所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
12．权利要求11的肿瘤抗原肽或其具有相同功能性质的衍生物，所述肿瘤抗原肽包括选自SEQ ID NO:3-9和25-29中任何一个所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
13．权利要求11的肿瘤抗原肽衍生物，它包括选自其中SEQ IDNO:3-52中任何一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
14．权利要求13的肿瘤抗原肽衍生物，它包括选自其中SEQ IDNO:3-9和25-29中任何一个所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
15．权利要求13的肿瘤抗原肽衍生物，它包括选自其中SEQ IDNO:3-24中任何一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
16．权利要求13的肿瘤抗原肽衍生物，它包括选自其中SEQ IDNO:25-52中任何一个所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
17．权利要求14的肿瘤抗原肽衍生物，它包括选自SEQ ID NO:53-64中任何一个所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
18．用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的至少一种选自权利要求9-17中任何一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质。
19．一种重组DNA，它包含至少一种编码权利要求9-17中任何一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA。
20．一种重组多肽，它可通过表达权利要求9的重组DNA获得。
21．用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求19的重组DNA或权利要求20的重组多肽。
22．一种抗体，它特异性结合权利要求6的任何一种肿瘤抗原蛋白和权利要求9-17中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物。
23．一种抗原提呈细胞，其中HLA抗原和权利要求9-17中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在具有抗原提呈能力的细胞表面上，所述具有抗原提呈能力的细胞从肿瘤患者分离获得。
24．一种抗原提呈细胞，其中HLA抗原和肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在其上，所述抗原提呈细胞可通过使权利要求1或2的DNA、权利要求6的肿瘤抗原蛋白、权利要求19的重组DNA或权利要求20的重组多肽加入从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞获得。
25．用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求23或24的抗原提呈细胞。
26．一种细胞毒性T淋巴细胞，它特异性识别HLA抗原和权利要求9-17中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物。
27．一种细胞毒性T淋巴细胞，它特异性识别HLA抗原和肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物，所述复合物提呈在权利要求23或24的抗原提呈细胞上。
28．用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求26或27的细胞毒性T淋巴细胞。
29．一种肿瘤诊断试剂，它包含权利要求9-17中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物、权利要求6的蛋白或权利要求20的重组多肽。
30．细胞毒性T淋巴细胞OK-CTL，其保藏号是FERM BP-6818
31．鉴定肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽的方法，它包括应用权利要求30的OK-CTL。
全文摘要
新型肿瘤抗原蛋白;其基因;衍生自该肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽;这些物质的衍生物;以及在体内或体外利用这些物质治疗、预防、诊断肿瘤等。
文档编号C07K14/435GK1324404SQ99812596
公开日2001年11月28日 申请日期1999年8月27日 优先权日1998年8月28日
发明者伊东恭悟, 中尾真修 申请人:伊东恭悟, 住友制药株式会社