使用集光多生色团检测和分析多核苷酸－结合蛋白相互作用的方法和组合物的制作方法

专利名称：使用集光多生色团检测和分析多核苷酸－结合蛋白相互作用的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于样品中多核苷酸的检测和分析的方法、物品和组合物。
背景技术：
允许实时和高灵敏度多核苷酸分析的方法具有极大的科学和经济重要性。1，2，3其应用包括医学诊断、遗传突变的鉴定、基因送递监控和特定的基因组学技术。4阳离子有机染料，例如溴化乙锭和噻唑橙，在插入双链DNA(dsDNA)的沟时发光，并起直接DNA杂交探针的作用，但是缺乏序列特异性。5，6存在链特异性测定的能量/电子转移生色团对，但是需要两个核酸的化学标记，或同一个变化的链的双重修饰(例如分子信标)。7，8标记两个DNA位点的困难导致了低收率、高成本和单一标记的杂质，这些降低了检测灵敏度。9本领域需要检测和分析样品中特定多核苷酸的方法、以及在这类方法中有用的组合物和制品。
发明概述提供检测和测定样品中靶多核苷酸的方法、组合物和制品。
在第一个实施方案中，将怀疑含有靶多核苷酸的样品与聚阳离子多生色团及传感器多核苷酸结合蛋白(PBP)接触，所述PBP可以与靶多核苷酸结合。传感器PBP包括信号生色团。不欲受理论束缚，相信在样品中靶多核苷酸的存在下，可利用与结合到传感器PBP的靶多核苷酸主链的静电相互作用，将信号生色团引入阳离子多生色团附近(见

图1)。信号生色团于是可以从激发的聚阳离子多生色团获得能量，并发射可检测光。由于出现在样品中，所以靶多核苷酸可以得到分析，或可以在分析前或在分析同时得到扩增。
提供了解决方案，包括有利于进行本发明方法的试剂，以及含有这类试剂的试剂盒。该方法可用于多重设置中，在该设置中，使用多种不同的传感器PBP以测定多种不同的靶多核苷酸。使用例如表面结合的聚阳离子多生色团，可选在表面进行该方法；该表面可以是传感器。也可以以均一的形式提供该方法。在此描述的方法和物品可用作其他的检测多核苷酸技术的替代。
附图简述图1描述了本发明使用聚阳离子聚合物作为集光多生色团的方法。传感器PBP(PBP-C*)包括信号生色团和对感兴趣的靶多核苷酸的结合特异性。在与样品中的靶多核苷酸接触后，聚阳离子多生色团由于其与靶多核苷酸特有的相互作用而被引入信号生色团附近。然后多生色团的激发从信号生色团产生光发射。
图2描述了在工作实施例中使用的Tat-C*(其中C*为荧光素)、TAR RNA和dTAR RNA的分子结构。
图3显示聚合物1及Tat-C*的光谱。分别在380nm和480nm激发聚合物1和Tat-C*。测定条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)，pH＝7.4。
图4显示寡聚体1及Tat-C*的光谱。分别在365nm和480nm激发寡聚体1和Tat-C*。测定条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)，pH＝7.4。
图5显示寡聚体2及Tat-C*的光谱。分别在375nm和480nm激发寡聚体2和Tat-C*。测定条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)，pH＝7.4。
图6显示通过在365nm激发寡聚体1，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的发射光谱。条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)中，pH＝7.4。关于寡聚体1的发射对光谱进行标准化。
图7显示通过在375nm激发寡聚体2，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的发射光谱。条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)中，pH＝7.4。关于寡聚体2的发射对光谱进行标准化。
图8显示通过在380nm激发聚合物1，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的发射光谱。条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)中，pH＝7.4。关于聚合物1的发射对光谱进行标准化。
图9显示通过在365nm激发寡聚体1，SH3-C*和Tat-C*在TARRNA存在下的发射光谱。条件为TRIS EDTA缓冲液(10mM)中，pH＝7.4。关于寡聚体1的发射对光谱进行标准化。
发明详述本文的DNA和RNA传感器技术(包括“基因芯片”和“DNA芯片”)依赖于荧光标签(生光团)与DNA单链的共价附着。这些传感器大多被迫依赖于分析物样品的标记，样品间标记反应效率的变化导致不可避免的问题，使得需要复杂的交叉校准。其他系统依赖于“分子信标”途径，从而需要生光团和猝灭剂与精确设计的序列的附着。
提供了多核苷酸分析方法，该方法包括将样品与至少两种成分接触；(a)集光的发光多生色团系统，例如水溶性的缀合聚合物、半导体量子点(quantum dot)或树枝状结构之类，以及(b)与发光信号生色团缀合的传感器PBP(“PBP-C*”)。在多生色团的激发后，信号生色团C*光特征波长的发射显示溶液中靶多核苷酸的存在。通过使用多个不同的传感器PBP，每个具有不同的基本序列，和不同的信号生色团(PBPI-C1*，PBP2-C2*，PBP3-C3*，PBP4-C4*，等)，可以独立检测和测定多个不同的多核苷酸。
选择集光生色团和信号生色团(C*)，以使两个生色团的吸收谱带具有最小重叠，并使两个种类的发光发射光谱位于不同的波长。在水溶液中制备时，集光发光多生色团系统为正电荷的或阳离子的，优选为聚阳离子的(例如聚阳离子缀合的聚合电解质)。选择传感器PBP和多生色团，以使其在不存在靶时具有最弱的相互作用。在加入能与传感器PBP结合的靶多核苷酸后，靶多核苷酸与传感器PBP形成复合物。由于靶多核苷酸为负电荷，所以使传感器PBP与聚阳离子多生色团结合，从而允许能量经例如Frester能量转移机制从聚阳离子多生色团向信号生色团转移。当加入不与传感器PBP结合的多核苷酸时，不发生多生色团和传感器PBP之间的复合。因为在这类复合物不存在时，聚阳离子多生色团和信号生色团之间的平均距离对于有效的能量转移而言太远，所以仅有很少或没有来自信号生色团的发射。全部方案用于检测测试溶液中靶多核苷酸的存在。
除了描述的方法之外，本发明提供包括至少两种成分的主要水溶液；(a)阳离子多生色团，以及(b)“传感器PBP”(PBP-C*)，包括与信号生色团缀合的多核苷酸结合蛋白。
如实施例中所示例的，由诸如缀合聚合物之类的水溶性多生色团提供的光学放大可以用于检测与PBP传感器结合的多核苷酸。如此处所描述的，使用较高分子量的水溶性缀合聚合物或其他结构作为聚阳离子多生色团，可以增强放大。可以采用利用荧光检测方法的便利的均一形式提供本发明。本方法可用于检测扩增的靶多核苷酸，或者由于巨大的信号放大，作为单独链测定，不需要多核苷酸扩增。
因此，本发明超过现有基因芯片技术的独特优点包括避免了在分析前通过生光团或生色团与多核苷酸的共价偶联来首先标记各待分析样品的要求，其中多核苷酸包含于样品中或从样品衍生。这些偶联方法在偶联效率的重复性上具有固有的困难，并导致需要样品间的交叉校准。
对于可以关于靶多核苷酸查询样品的任何测定，此处描述的发明都是有用的。一般的测定涉及确定样品中靶多核苷酸的存在或其相对量，或者测定可以为定量或半定量的。
本发明的方法都可以用多重形式进行。使用缀合到各自传感器PBP上的不同的信号生色团，许多不同的传感器PBP可用于检测样品中相应的不同的靶多核苷酸。提供使用2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多不同传感器PBP的多种方法，这些传感器PBP可以同时用于测定相应的不同靶多核苷酸。
可以在基片上以及在溶液中进行本方法，尽管由于扩散问题预期溶液形式更为快速。因此可以采用例如在基片上的阵列形式进行测定，其中基片可以是传感器。这可以通过将测定成分(例如传感器PBP、聚阳离子多生色团或两者)锚定或另外整合到基片上而实现。这些基片可以是玻璃、硅、纸、塑料表面，或用作光电转换器的光电半导体(例如但是不限于铟掺杂的氮化镓或聚合的聚苯胺等)表面。给定传感器PBP的位置可以是已知的或以阵列形式确定，且阵列形式可以是可微编址的(microoddressable)或可毫微编址的(nanoaddressable)。
在对本发明进行更为详细的描述之前，应当理解，本发明不限定于所描述的特定方法学、设备、方案或仪器，因为这类方法、设备、方案或仪器当然是可变的。也应理解，此处使用的术语学仅出于描述特定实施方案的目的，而无意限制本发明的范围。
除非上下文另外明确指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的使用包括复数涵义。因此，例如，“一个靶多核苷酸”的涵义包括许多靶多核苷酸，“一个信号生色团”的涵义包括许多这类生色团，“一个传感器PBP”的涵义包括许多传感器PBP等。另外，除非上下文另外明确指出，具体复数涵义的使用，例如“二”、“三”等，理解为大量的相同主题。
除非上下文另外明确指出，术语“连接的”、“附着的”以及“相联的”在此可互换使用，且包括直接和间接连接、附着、相联或缀合。在描述值范围之时，应当理解，在所述范围的上、下限之间的各居间整数值及其分数，连同这些值之间的各个子范围也得以具体地公开。任何范围的上、下限可以独立包括于该范围内或从该范围内排除，且包括任一、无一或两个界限的各范围也包括在本发明内。当所讨论的值具有固有界限时，例如组分可以以0至100％的浓度存在，或者水溶液的pH可以分布于1至14范围内，这些固有的界限得以具体公开。当明确列举值时，也应理解，与列举值约相等量或数量的数值也在本发明的范围内，在此基础之上的范围也一样。公开组合物时，该组合物成分的各亚组合物也得以具体公开，并在本发明范围内。反过来，公开不同成分或几组成分时，其组合物也得以公开。当发明的任何成分作为具有众多替代物而进行公开时，发明的实施例也从而得以公开，在所述实施例中，各替代物单独或与其他替代物组合被排除在外；多于一个发明成分可以具有这类排除物，且具有这类排除物的成分的所有组合物也由此得以公开。
除非另有定义或上下文另有说明，此处使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同的涵义。在本发明的实践或测试中，尽管可以使用与此处所描述的方法和材料相似或相当的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
出于公开和描述引用文献的特定材料和方法学的目的，将这里提及的所有出版物引入作为参考。在此讨论的出版物仅仅由于其公开内容早于本申请的提交日而提供。在此不能解释为承认本发明不能依靠在先发明而具有早于所述公开内容的权利。
定义在本发明的描述中，下列术语将得到使用，并旨在按照下文说明而定义。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此可以互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。这些术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三、双和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)以及三、双和单链核糖核酸(“RNA”)。该术语也包括经例如烷基化和/或加帽修饰的多核苷酸及其未修饰形式。
无论经过修饰或未修饰，靶核苷酸都应当具有聚阴离子主链，优选糖磷酸酯主链，所述聚阴离子主链具有足够的负电荷以与在此描述的方法中聚阳离子多生色团静电相互作用，尽管其他力可以另外参与相互作用。在不存在靶时，传感器PBP是与多生色团最小相互作用的多核苷酸结合蛋白。本领域技术人员可以确定合适的给定测定形式的结合条件；可调节的非限制性参数包括测定成分的浓度、pH、使用的盐及其浓度、离子强度、温度等。
更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)；多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论剪接或未剪接；作为嘌呤或嘧啶碱基N-或C-糖苷的任何其他形式的多核苷酸；以及含有磷酸或其他聚阴离子主链的聚合物；以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，前提是所述聚合物以允许碱基配对和碱基堆积(例如见于DNA和RNA中)的构型含有核碱基(nucleobase)。在术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间没有对长度的有意区别，这些术语在此可以互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此这些术语包括，例如3’-脱氧-2’，5’-DNA、寡脱氧核苷酸N3’P5’氨基磷酸酯、2’-O-烷基取代的RNA、双和单链DNA以及双和单链RNA及其杂交体，所述杂交体包括例如DNA和RNA之间的杂交体，这些术语也包括已知的修饰类型，例如标记、烷基化、“帽”、一个或多个核苷酸被类似物取代、核苷酸间修饰，例如具有负电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有悬垂部分例如蛋白(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰连接(例如α异头核酸等)的那些、以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。
应当理解，此处使用的术语“核苷”和“核苷酸”将包括不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基而且含有其他经过修饰的杂环碱的那些部分。这类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其他杂环。修饰的核苷或核苷酸也可以包括在糖部分的修饰，例如其中的一个或多个羟基以卤素、脂族基取代或官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”旨在包括核苷和核苷酸。
另外，对核苷酸单位的修饰包括对分别与互补嘧啶或嘌呤形成氢键的嘌呤或嘧啶碱基上的官能团的重排、附加、取代或其他改变。结果产生的修饰核苷酸单位可以任选地与其他这样修饰的核苷酸单位而非A、T、C、G或U形成碱基对。可以整合不阻碍多核苷酸功能的脱碱基位点；多核苷酸优选不包括脱碱基位点。多核苷酸中的一些或全部残基可以任选地以一种或多种方法修饰。
在允许胸苷的N3-H和C4-氧分别与腺苷的N1和C6-NH2之间、胞苷的C2-氧、N3和C4-NH2分别与鸟苷的C2-NH2、N’-H和C6-氧之间形成氢键的条件下，形成标准A-T和G-C碱基对。因此，例如，可以修饰鸟苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)形成异鸟苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)。这类修饰产生不再与胞嘧啶有效形成标准碱基对的核苷碱基。然而，修饰胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖-2-氧-4-氨基嘧啶)形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧嘧啶)，产生了修饰的核苷酸，该核苷酸不与鸟苷形成有效碱基对，但是将与异鸟苷形成碱基对。可从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得异胞嘧啶；可以通过由Switzer等人(1993)Biochemistry 3210489-10496以及其中引用的参考文献中描述的方法制备异胞苷；可以通过Tor等人(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467以及其中引用的参考文献中的方法制备2’-脱氧-5-甲基-异胞苷；可以使用Switzer等人(1993)如上，以及Mantsch等人(1993)Biochem.145593-5601的方法，或通过Collins等人在美国专利No.5,780,610中描述的方法制备异鸟嘌呤核苷酸。可以通过Piccirilli等人，(1990)Nature 34333-37中描述的用于合成2，6-二氨嘧啶及其互补物(1-甲基吡唑啉(methylpyrazolo)-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法合成其他非天然碱基对。已知其他这类形成独特碱基对的修饰的核苷酸单位，例如在Leach等人，(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和Switzer等人如上中描述的那些。
“互补的”或“基本互补的”指杂交或核苷酸或核酸之间(例如传感器多核苷酸结合蛋白和靶多核苷酸之间)的碱基配对的能力。互补核苷酸通常为A和T(或A和U)、或C和G。当一条链的碱基(进行最好的比对和比较，且具有插入或缺失)与另一条链碱基的至少约80％、通常至少约90％至95％、最优选约98％至100％匹配时，称两条单链多核苷酸基本互补。
作为选择，当多核苷酸或PNA将在选择性杂交条件下与其互补物杂交时，存在基本互补性。一般，当在至少14至25个碱基的一段上具有至少约65％的互补性、优选至少约75％、更优选至少约90％互补性时，将出现选择性杂交。见M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“优选结合”或“优选杂交”指与样品的另一种成分相比，结合对中一个成员与其结合配偶体增加的结合倾向。
杂交条件一般包括低于约1M的盐浓度，更常见地低于约500mM、优选低于约200mM。在肽核酸与多核苷酸之间杂交的情况下，杂交可以在含有很少或没有盐的溶液中进行。杂交温度可以低至5℃，但是一般高于22℃，更常见高于约30℃，优选超过约37℃。较长的片段对特异性杂交可能需要更高的杂交温度。其他因素可能影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，采用参数的组合比单独任何一个的绝对测量值更为重要。其他可控制的杂交条件包括缓冲液类型和浓度、溶液pH、降低背景结合的封闭试剂(例如重复序列或封闭蛋白溶液)的存在及浓度、去污剂类型及浓度、增加多核苷酸相对浓度的分子诸如聚合物、金属离子及其浓度、螯合剂及其浓度以及其他本领域已知的条件。
“多重化”在此指测定或其他分析方法，在这些方法中，可以同时测定多个分析物。
“任选的”或“任选地”意味随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，且该描述包括某事件或情形出现的情况以及不出现的情况。
提供包括两种成分的多核苷酸传感器；(a)水溶性集光发光聚阳离子多生色团，例如缀合聚合物、寡聚体或树枝状分子；(b)传感器多核苷酸结合蛋白或其结合片段，用发光信号生色团进行标记(PBP-C*)。PBP-C*与靶多核苷酸的结合导致复合物的形成，该复合物具有足够的负电荷以与聚阳离子多生色团相互作用。与阳离子集光分子的静电(及疏水)相互作用使信号生色团(C*)与集光分子密切接近。集光分子在适当频率的激发引起能量向信号生色团的转移。来自C*的发射证实了PBP-C*和靶多核苷酸之间的结合。如果传感器-靶相互作用是特异性的，那么C*发射对应于溶液中特定DNA或RNA序列的存在。
传感器操作的示意图显示于图1中。在水溶液中，阳离子集光分子(显示为黑色)与探针PBP-C*(显示为红色)之间具有最小的相互作用。选择PBP和集光分子，从而使它们在靶不存在时不发生显著的相互作用。在加入含有多核苷酸的样品后，可以发生两种情况。情况A显示信号PBP-C*与靶多核苷酸(蓝色)结合的结果。在这些条件下，带负电荷的DNA-PBP-C*或RNA-PBP-C*复合物通过与带正电荷的集光缀合分子的多重静电相互作用而结合。随后发生的密切接近导致能量从集光缀合分子向PBP-C*的信号生色团的转移，通过例如Frester能量转移机制。10，11具有信号C*特征波长的光的发射显示蛋白与RNA或DNA之间的识别。当不与PBP-C*相互作用的多核苷酸(以绿色显示)存在时，PBP-C*不与带负电荷的大分子毗邻，且阳离子集光分子和C*之间的距离对于能量转移而言过大(情况B)。
我们使用下列成分作为特定的传感器工作实施例(a)水溶性集光发光缀合分子，例如缀合聚合物和缀合寡聚体；(b)用发光信号生色团在N末端标记的16残基肽(Tat-C*)。选择集光分子和信号生色团(C*)，从而使两种种类的发光发射光谱位于不同波长，并使C*的吸收与集光种类的发射重叠。在添加TAR RNA后，信号肽Tat-C*与TAR RNA特异性结合。带负电荷的TAR RNA/Tat-C*复合物然后与带正电荷的集光缀合分子结合(情况A)。随后发生的密切接近导致能量从集光缀合分子向Tat-C*的信号生色团的转移。具有信号Tat-C*特征波长的光的发射显示HIV TAR RNA的存在。当使用不与Tat相互作用的RNA的时候，RNA与阳离子分子相互作用，然而，没有向C*的能量转移。
开发检测1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的可靠技术具有重大的临床重要性。12，13，14，15HIV感染的传统检测技术是检测HIV抗体的ELISA试验，在该试验中将病毒抗原吸附到固相上。22，16将电泳分离与放射性同位素检测偶联的蛋白印迹也是此工作常用的。22，17这些技术的缺点包括复杂的仪器使用、测定所需的时间以及由于放射性探针的短半衰期和危险性质引起的复杂性。检测HIV病毒高度需要简单、高灵敏度、特异性和实时的方法。
由病毒感染细胞以高水平表达HIV的反式激活反应元件RNA序列(TAR)。18如此处所描述的，便利地实时监控TAR RNA的能力为快速检测HIV病毒的存在提供了可行方法。广泛的研究证实，反式激活蛋白(Tat)以高度特异性和大约1nM的亲和力与TAR RNA结合，形成稳定并且明确定义的复合物。19，20，21Tat与TAR RNA的特异性结合由此触发了使用此处描述之方法的临床相关实时HIV检测的信号转导。
工作实施例证实了全新的HIV生物光学传感器，该传感器将Tat肽和TAR RNA结合和折叠的特异性与缀合聚合物和寡聚体的巨大光学放大偶联。HIV RNA传感器包括两个成分(a)水溶性集光发光缀合分子，例如缀合聚合物和缀合寡聚体；(b)用发光信号生色团在N末端标记的16残基肽(Tat-C*)。探针肽和发光缀合分子与TARRNA的结合引起复合物的形成，并引导能量从缀合分子向Tat-C*的转移。具有信号Tat-C*特征波长的光的发射显示HIV-1TAR RNA的存在。
如实施例中所证实，水溶性缀合分子的光学放大可以用于检测HIV TAR RNA的存在。本发明可用于均一形式中，其中利用荧光检测方法的简便和特异性结合行为，并提供实时检测TAR RNA的能力，其中特异性结合行为见于蛋白-多核苷酸相互作用，例如Tat-TARRNA相互作用。工作实施例中使用的Tat肽、TAR RNA和dTAR RNA的结构显示于图2中(Tat-C*氨基酸以单字母编码显示)。
如Frester所显示的22，偶极-偶极相互作用引起从供体生色团向受体生色团的远程共振能量转移(FRET)。能量转移效率(E)与1/r6及重叠积分成比例，其中r为供体受体距离，如式1所示。
E∝1r6·o0∞FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ---(1)]]>在此描述的方法中，能量转移的距离要求受图1中相互作用的控制。重叠积分表现了供体发射和受体吸收之间的光谱重叠23。在此作为示例，可以选择传感器的成分以使其光学性质符合此要求。
样品包括或怀疑包括靶多核苷酸的样品部分可以是包括多核苷酸的任何生物材料来源，其中多核苷酸可以直接或间接从活生物(包括细胞、组织或流体)和该生物遗留的堆积物(包括病毒、支原体和化石)获得。样品可以全部或部分包括经合成方法制备的靶多核苷酸。一般，以主要水性介质获得样品，或者在其中分散样品。样品的非限制性实施例包括血液，尿液，精液，乳汁，痰，粘液，颊膜棉拭，阴道棉拭，直肠棉拭，吸出物，针吸活组织检查，从例如外科或尸体剖检获得的组织切片，血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外分泌物，泪液，唾液，肿瘤，器官，体外细胞培养成分样品(包括但是不限于从细胞培养基中的细胞生长产生的条件培养基、假定病毒感染的细胞、重组的细胞，以及细胞组分)和包括多核苷酸序列的重组文库。
样品可以是已知含有靶多核苷酸或其代替品的阳性对照样品。也可以使用阴性对照样品，尽管该样品未预期含有靶多核苷酸，但怀疑其含有(通过一个或多个试剂的污染)靶多核苷酸、或另一种能够产生假阳性的成分，且对其进行测试以证实没有由用于给定测定的试剂的靶多核苷酸造成的污染，并确定给定的一组测定条件是否产生假阳性(即使样品中不存在靶多核苷酸时也存在的阳性信号)。
样品可以经稀释、溶解、悬浮、提取或另外处理，以溶解和/或纯化任何存在的靶多核苷酸，或使其易于接触用于扩增方案中的试剂或检测试剂。样品含有细胞时，可以裂解或透化细胞以释放细胞中的多核苷酸。可以使用一步透化缓冲液裂解细胞，该缓冲液允许裂解后直接进行进一步的步骤，例如聚合酶链反应。
靶多核苷酸以及由此产生的扩增产物靶多核苷酸可以是单链、双链或更高级的，且可以是线性或环形的。示例性单链靶多核苷酸包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因组，尽管这些多核苷酸可以含有内在的互补序列及显著的二级结构。示例性双链靶多核苷酸包括基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因组、质粒、噬菌体和类病毒。可以合成制备或从生物来源纯化靶多核苷酸。可以纯化靶多核苷酸以去除或减少样品的一种或多种不需要的成分，或浓缩靶多核苷酸。反之，当靶多核苷酸对于特定测定而言过度浓缩时，可以将靶多核苷酸稀释。
样品收集及任选的核酸提取后，可以将包括靶多核苷酸的样品的核酸部分进行一个或多个预反应。预反应可以包括体外转录(IVT)、标记、断裂、扩增和其他反应。可以在检测和/或扩增前首先用反转录酶和引物处理mRNA，以产生cDNA；这可以使用纯化的mRNA体外进行或原位进行，例如在固定到载玻片上的细胞或组织中。核酸扩增增加了例如靶多核苷酸这类目标序列的拷贝数。多种扩增方法适于使用，包括聚合酶链反应方法(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、Qβ复制酶的使用、反转录、切口平移等。
靶多核苷酸为单链并将被扩增时，扩增的第一个循环形成与靶多核苷酸互补的引物延伸产物。如果靶多核苷酸为单链RNA，那么在第一次扩增中使用具有反转录酶活性的聚合酶，将RNA反转录为DNA，且可以进行另外的扩增循环以复制引物延伸产物。当然，必须设计PCR引物与其相应模板中的区域杂交，所述模板将产生可扩增片段；因此，每个引物必须杂交以致其3’核苷酸与其互补模板链中的核苷酸配对，所述互补模板链定位于用于在PCR中复制该互补模板链的引物的3’核苷酸的3’。
通常通过以下方法扩增靶多核苷酸，即，将一条或多条靶多核苷酸链与引物和具有适当活性的聚合酶接触，来延伸引物，并复制靶多核苷酸，以产生全长互补多核苷酸或其较短部分。可以使用任何具有聚合酶活性、可复制靶核苷酸的酶，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、具有多于一类聚合酶活性的酶、以及不耐热或热稳定的酶。也可以使用酶混合物。示例性酶包括DNA聚合酶例如DNA聚合酶I(“PolI”)、PolI的克列诺(Klenow)片段、T4、T7、SequenaseT7、SequenaseVersion 2.0 T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌属(Pyrococcus)物种GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶例如大肠杆菌(E.coli)、SP6、T3和T7RNA聚合酶；以及反转录酶例如AMV、M-MuLV、MMLV、RNA酶H-MMLV(SuperScript)、SuperScriptII、ThermoScript、HIV-1和RAV2反转录酶。所有这些酶有商品供应。具有多重特异性的示例性聚合酶包括RAV2和Tli(外切)聚合酶。示例性热稳定聚合酶包括Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌属物种GB-D DNA聚合酶。
选择适宜的反应条件以允许靶多核苷酸的扩增，反应条件包括pH、缓冲液、离子强度、一种或多种盐的存在及浓度、反应物和辅因子的存在及浓度，例如核苷酸和镁和/或其他金属离子(例如锰)、任选的助溶剂、温度、包括聚合酶链反应的扩增方案的热循环特征；反应条件可能部分依赖于使用的聚合酶和样品的性质。助溶剂包括甲酰胺(一般在约2至约10％)、甘油(一般在约5至约10％)和DMSO(一般在约0.9至约10％)。为了使假阳性的产生或扩增期间产生的假象最小化，可以在扩增方案中使用技术。这些包括“降落(touchdown)”PCR、热启动技术、嵌套引物的使用、或设计PCR引物使其在引物-二聚体形成事件中形成茎环结构，从而不被扩增。可以使用加速PCR的技术，例如离心PCR，其允许样品中更强的对流，且包括快速加热和冷却样品的红外线加热步骤。可以进行一个或多个扩增循环。可以使用一个引物的过量在PCR过程中产生一个引物延伸产物的过量；优选地，过量产生的引物延伸产物是将要检测的扩增产物。许多不同的引物可以用于扩增样品中不同的靶多核苷酸或特定靶多核苷酸的不同区域。
扩增的靶多核苷酸可以经历扩增后处理。例如，在有些情况下，为了提供更易于接近的片段，可能需要在杂交前使靶多核苷酸片段化。任何生产可用于所进行的测定中的大小的片段的方法都可以用于进行核酸的片段化；合适的物理、化学和酶学方法为本领域所公知。
可以在允许传感器PBP与扩增产物在至少部分扩增循环期间结合的条件下进行扩增反应。当以此方式进行测定时，可以通过监控扩增方案期间在杂交之后出现的、来自信号生色团的光发射的改变，来进行所述杂交的实时检测。
聚阳离子多生色团已经证实，集光多生色团系统由于其包括的多生色团而是有效的光吸收物。实例包括但是不限于缀合聚合物、缀合分子聚集体、通过侧链与饱和聚合物附着的发光染料、半导体量子点和树枝状结构。例如，可以将缀合聚合物上的每个重复单位视为起作用的生色团，量子点由许多原子组成，饱和聚合物可以在侧链上由许多发光染料分子官能化，且可以合成含有许多共价结合的单独生色团的树枝状聚合物(dendrimer)。生色团组件向固体支持物(例如聚合物珠或表面)上的附着也可以用于集光。
集光多生色团系统可以有效地将能量转移给邻近的发光种类(例如“信号生色团”)。能量转移机制包括例如共振能量转移(Frster(或荧光)共振能量转移，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。然而，这些能量转移机制一般为相对短程的；即，集光多生色团系统与信号生色团的密切邻近是有效能量转移所必需的。在有效能量转移的条件下，当多生色团的整个吸收能力超出信号生色团时，例如，当集光多生色团系统中单独生色团的数目大时，出现信号生色团发射的放大；即，当入射光(“泵光(pump light)”)的波长为被集光多生色团系统吸收的波长时，信号生色团的发射比信号生色团直接由泵光激发时更强。
缀合聚合物(CP)以不定域的电子结构为特征，且可以用作化学和生物学靶的高反应性光学报道分子。24，25因为有效缀合长度基本短于聚合物链的长度，所以主链含有大量密切临近的缀合片段。因此，缀合聚合物对于集光有效，并通过Frster能量转移使光学放大成为可能。26在带有相反电荷的受体的存在下，水溶性CP表现出超乎寻常的荧光猝灭效率，且对生物识别事件的转导具有特别的重要性。27，28在阳离子聚合电解质和DNA之间自然发生的聚合物间复合已有描述，且主要是静电力协同作用的结果。29，30，31芳香族聚合物单元和DNA碱基之间的疏水相互作用最近也得到了认识。32，33聚合电解质/DNA相互作用的自由能由所用的参与种类的结构结合溶液变量(例如pH、离子强度和温度)进行控制。34这些相互作用的强度和特异性最近协同用于识别质粒DNA的三级结构。35用于本发明的多生色团为聚阳离子的，以致它们可以与靶多核苷酸静电相互作用，从而依靠传感器PBP和靶多核苷酸之间的结合将不带电的传感器PBP上的信号生色团引入能量接受附近区域。在描述的方法中，可以使用任何能吸收光、并将能量转移到传感器PBP上的信号生色团的聚阳离子多生色团。可以使用的示例性多生色团包括缀合聚合物、饱和聚合物或以任何可行方式整合多个生色团的树枝状聚合物、以及半导体纳米晶体(nanocrystal)(SCNC)。缀合聚合物、饱和聚合物和树枝状聚合物可以被制备以用于整合多个阳离子种类，或可以被衍生以用于在合成后赋予其聚阳离子性；半导体纳米晶体可以通过向其表面添加阳离子种类而被赋予聚阳离子性。
在优选的实施方案中，使用缀合聚合物作为聚阳离子多生色团。
示例性聚阳离子多生色团显示如下，其中阳离子水溶性缀合分子为聚合物1(其中n＝2-100,000)、寡聚体1和寡聚体2。这种特定分子结构并非关键的；可以使用任何水溶性阳离子集光分子。
聚合物1 寡聚体1 m＝1寡聚体2 m＝2
水溶性、阳离子、发光缀合分子的分子结构。
其他实例显示于聚合物3中，其中阳离子水溶性缀合分子为具有碘化物反荷阴离子的聚((9，9-双(6’-N，N，N-三甲基铵)-己基)-芴亚苯基)(下面表示为聚合物3)。36该聚合物的特定大小并非关键的，只要能够吸收光、并将能量转移给引入邻近的信号生色团即可。“n”的一般值在2至约100,000范围内。这种特定分分子结构并非关键的；可以使用任何具有相对高发光量子效率的水溶性阳离子缀合聚合物。
n＝2-100,000也可以使用水溶性缀合寡聚体作为聚阳离子多生色团。这类具有碘化物反荷离子的水溶性、阳离子、发光缀合寡聚体的实例显示如下(在此表示为寡聚体4) 尽管较小的寡聚体4不显示高分子量聚合物特征的巨大的信号放大，但这类较小的分子可用于解开结构特性关系，所述结构特性关系由于固有的多分散性和聚合物中发现的批次间变化而难于确定。另外，在水性介质中，寡聚体例如4比其他聚合的对应物更可溶，且预期疏水相互作用对于4不如对聚合物结构重要。寡聚体组件因此可能为特定应用所需。
传感器PBP提供与待测靶多核苷酸结合的传感器PBP。已知将信号生色团与传感器PBP附着的化学方法。特定的传感器PBP结构，包括与生色团缀合的结构，可以使用商业资源定做或化学合成。
在公开的方法中，可以使用任何能够与感兴趣的靶多核苷酸结合的蛋白。PBP的非限制性实例包括DNA结合蛋白，包括转录因子、剪接因子、多腺苷酸结合蛋白、染色质成分、病毒蛋白、可以检测病毒感染的蛋白、复制因子、以及参与细胞有丝分裂和/或减数分裂的蛋白。RNA-蛋白相互作用介导重要的细胞过程，包括转录、转录后修饰、RNA剪接和翻译。37，38，39，40许多致病性病毒，例如1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)41、细小核糖核酸病毒42和流感病毒43的复制周期依赖于特定的RNA-蛋白相互作用。对于医学诊断和基因组研究中的效用，这类相互作用的特异性可以用作序列特异性传感器的基础。示例性多核苷酸结合蛋白包括锌指蛋白、同源域蛋白、翼状螺旋(叉头(forkhead))蛋白、亮氨酸拉链蛋白、螺旋-环-螺旋蛋白、螺旋-转角-螺旋蛋白和组蛋白样蛋白。
可以从细胞来源分离或可以体外产生PBP，例如通过体外转录/翻译方法或通过完全合成方法。PBP可以是天然存在的蛋白、天然存在的蛋白的突变体、通过例如分子进化方法产生的随机产生的蛋白、或怀疑具有未知结合特异性的多核苷酸结合蛋白。
监控RNA/蛋白相互作用具有重要性的一个理由是，蛋白结构可以作为抑制RNA功能的抗生素。一个实例是调节蛋白Rev与Rev反应元件(RRE，病毒RNA的亚结构域)的相互作用，所述Rev反应元件对于人免疫缺陷病毒(HIV)复制是重要的。含有116个氨基酸的Rev通过诱导不完整剪接的病毒mRNA转录物在细胞质中的累积而促进表达。蛋白/DNA结合和相互作用是重要的，因为这些事件调节DNA的多种功能及代谢。将展示这种特性的蛋白称为序列特异性DNA结合蛋白。它们介导DNA复制、重组、链断裂和转录。
用于工作实施例中的Tat肽易于使用固相方法合成，且可以通过HPLC纯化，并且用MALDI-TOF质谱和氨基酸分析进行表征。已知将信号生色团与肽附着以形成信号传感器或PBP-C*的化学方法。44特定的实例是在N末端具有荧光素的Tat-C*。可以通过商业来源定制特定的PBP-C*结构。
其他可以使用的PBP的实例包括结合A型流感病毒RNA的基质蛋白(M1，具有单字母编码序列“DPNNMDKAVKLYRKLKR”)和结合前核糖体RNA的hnRNP U蛋白(单字母编码“MRGGNFRGGAPGNRGGYNRRGN”)。例如，可在测定中使用M1检测样品中的流感病毒，与为HIV显示的工作实施例相似。
信号生色团在此描述的用于本发明的生色团包括可以在合适的溶液中从激发的聚阳离子多生色团接受能量、并发射光的任何物质。对于多重测定，可以使用具有可检测的不同发射光谱的多种不同信号生色团。生色团可以是生光团或荧光团。一般的荧光团包括荧光染料、半导体纳米晶体、稀土元素螯合物和绿色荧光蛋白。
示例性荧光染料包括荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚(carboxyrhodol)、羧基罗丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-铬、藻红蛋白、PerCP(多甲藻素叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、Marina Blue、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPYFL-Br2、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、其缀合物及其组合物。示例性稀土元素螯合物包括铕螯合物、铽螯合物和钐螯合物。
本领域已知各种荧光半导体纳米晶体(“SCNC”)；生产和利用半导体纳米晶体的方法描述于1999年5月27日公布的PCT Publ.No.WO99/26299，发明人为Bawendi等人；1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；以及Bruchez等人，Science 2812013，1998。可以用明确的峰发射波长以很窄的发射带获得半导体纳米晶体，这允许在相同测定中使用大量不同的SCNC作为信号生色团，任选地与其他非SCNC型信号生色团组合。
术语“绿色荧光蛋白”指天然的水母(Aequorea)绿色荧光蛋白及突变形式，经鉴定，所述突变形式展示改变的荧光特征，包括改变的激发和发射最大值以及不同形状的激发和发射光谱(Delagrave，S.等人，(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.等人，(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分离了具有红移激发光谱的克隆的维多利亚水母(Aequorea victoria)GFP突变体。Bio/Teclinology13151-154(1995).Heim，R.等人报道了具有蓝色荧光的突变体(Tyr66至His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基片对于那些在基片上进行的测定的变化，基片可以包括大范围的材料，既可以是生物的、非生物的、有机的、无机的，也可以是这些的任何组合。例如，基片可以是聚合的L-B膜、官能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修饰的硅、或大量凝胶或聚合物的一种，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidenedifluoride)、聚苯乙烯、交联的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、丙交酯-乙交酯共聚物(poly(lactide coglycolide))、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯-乙酸乙酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚硅氧烷、聚合硅石、乳胶、葡聚糖聚合物、环氧聚合物、聚碳酸酯或其组合。可以使用导电聚合物和光电导的材料。
基片可以是平面晶状基片，例如基于硅石的基片(例如玻璃、石英等)，或在在例如半导体和微处理器工业中使用的晶状基片，例如硅、砷化镓、铟掺杂的GaN等，且包括半导体纳米晶体。
基片可以采取光电二极管、光电传感器(例如光电半导体晶片或光电薄膜半导体)或生物芯片的形式。单独传感器PBP在基片上的位置是可编址的；这可以以高密集形式进行，且所述位置可以是可微编址或可毫微编址的。
硅石气凝胶也可以用作基片，并可以通过本领域已知的方法制备。气凝胶基片可以用作游离的固定基片，或用作另一种基片材料的表面涂层。
基片可以采取任何形式，一般为板、载玻片、珠子、丸、盘、颗粒、微粒、纳米颗粒、链、沉淀物、任选地多孔凝胶、薄片、管、球、容器、毛细管、垫、切片、膜、芯片、多孔板或盘、光学纤维等。基片可以是任何刚性或半刚性形式。基片可以含有凸起或凹下的区域，测定成分位于其上。可以使用熟知的技术将基片表面蚀刻，以提供所需的表面特征，例如管沟、v形沟、台式结构等。
基片表面可以由与基片相同的材料组成，或可以由不同材料制成，并且可以通过化学或物理方法与基片偶联。这类偶联表面可以由大量材料中的任何一种组成，例如聚合物、塑胶、树脂。多聚糖、硅石或基于硅石的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或任何上面列举的基片材料。表面可以是光学透明的，可以具有表面Si-OH官能团，例如在硅石表面可见的那些。
选择基片和/或其任选的表面，以致为使用的合成和/或检测方法提供合适的光学特征。基片和/或表面可以是透明的，以允许基片暴露于从多重方向施加的光。可以以反射“镜”结构提供基片和/或表面，来增加光的回收。
基片和/或其表面通常对其将被暴露的使用中的条件具有抗性，或经过处理具有抗性，并且可以任选地在暴露于这类条件后、经处理以去除任何抗性材料。
可以通过任何合适的方法，例如美国专利No.5,143,854、PCTPubl.No.WO92/10092、1990年12月6日提交的美国专利申请序号07/624,120(现已放弃)、Fodor等人，Science，251767-777(1991)以及PCT Publ.No.WO90/15070中描述的方法，将测定成分加工或附着在基片上。使用机械合成策略的阵列合成技术在例如PCTPublication No.WO93/09668和美国专利No.5,384,261中有描述。
更进一步的技术包括基于珠的技术，例如在PCT Appl.No.PCT/US93/04145中描述的那些，以及基于针的(pin based)方法，例如在美国专利No.5,288,514中描述的那些。
可应用于传感器PBP向基片附着的额外流体通道或点样方法在1992年11月20日提交的美国专利申请序号07/980,523和美国专利No.5,384,261中得到描述。通过以下方法将试剂输送给基片(1)在预定区域内定义的管道内流动，或(2)在预先确定的区域上“点样”。可以在将要保护的基片部分上使用保护性涂层，例如亲水或疏水涂层(依赖于溶剂性质)，有时与促进其他区域中由反应物溶液进行湿润的材料组合。在此方式中，另外防止流动溶液流出其指定的流动路径。
一般的分配器包括微量吸移管(可选自动控制)、喷墨打印机、一系列管、歧管、吸移管阵列等，以致可以将多种试剂顺序或同时输送到反应区域。
生色团的激发和检测提供可激发聚阳离子多生色团、并且短于待测发射波长的波长的任何装置都可以用于激发。激发源优选不直接显著激发信号生色团。源可以是宽波段紫外光源，例如带有合适滤色片的氘灯；白光源的输出，例如氙灯或氘灯经过单色器析取所需波长；连续波(cw)气体激光器、固态二极管激光器或任何脉冲激光器。可以通过任何适宜的设备或技术检测来自信号生色团发射的光；许多适宜的途径为本领域已知。例如，荧光计或分光光度计可以用于检测在多生色团的激发后，测试样品是否发射具有信号生色团波长特征的光。
试剂盒也提供试剂盒，其包括用于进行本发明方法的试剂。在一个实施方案中，试剂盒包括与感兴趣的靶多核苷酸结合的传感器PBP、以及聚阳离子多生色团。传感器PBP与信号生色团缀合。在样品中存在靶多核苷酸时，传感器PBP在与靶结合后被引入多生色团附近，所述靶与聚阳离子多生色团静电结合。
试剂盒的成分通过盒子保持。使用试剂盒以进行本发明方法的说明书随盒子提供，并且可以以任何固定介质提供。说明书可以位于盒子内或盒子外，且可以印刷于形成盒子的任何表面之内或之外，这使得说明书易读。试剂盒可以为多种形式，含有一种或多种不同的传感器PBP的复合，所述传感器PBP可以与相应的不同靶多核苷酸结合。
实施例列举下列实施例，以便为本领域技术人员提供如何进行并使用本发明的完整描述，且无意限制被认为是本发明的范围。进行了努力以保证所用数字的精确性(例如，量、温度等)，但是一些实验误差和偏差需要解释。除非另有说明，份为重量份，温度为摄氏度，压力为处于或接近大气压，且所有材料都有商业供应。下面描述的TAR RNA和dTAR RNA寡核苷酸购买于Dharmacon Research Inc.(Lafayette，美国)。由荧光素在N末端修饰的多肽(Tat-C*和SH3-C*)由Sigma-Genosys(Texas，美国)定做。按照文献中的描述制备聚合物1和寡聚体2。45在tris-EDTA缓冲液(10mM，pH＝7.4)中使用PTI Quantum Master荧光计进行所有荧光和FRET实验，所述荧光计装备有氙灯激发源。
实施例1聚合物1、Tat-C*的发射光谱和Tat-C*的吸收光谱显示于图3中。数据显示聚合物1的发射和Tat-C*的吸收之间的极好重叠，保证了荧光共振能量转移。
实施例2寡聚体1、Tat-C*的发射光谱和Tat-C*的吸收光谱显示于图4中。数据显示寡聚体1的发射和Tat-C*的吸收之间的极好重叠，保证了荧光共振能量转移。
实施例3寡聚体2、Tat-C*的发射光谱和Tat-C*的吸收光谱显示于图5中。数据显示寡聚体2的发射和Tat-C*的吸收之间的极好重叠，保证了荧光共振能量转移。
实施例4将Tat-C*探针([Tat-C*]＝1.0×10-8M)与等摩尔量的TAR RNA于室温混合，并以同样的方式与非特异性dTAR RNA混合。已知TARRNA中的突出结构是Tat肽与TAR RNA结合的必要条件。46，47dTARRNA在结构上与TAR RNA密切相关，缺少Tat结合所必需的三个基本的突出结构。
在水中的寡聚体1([寡聚体1]＝8.0×10-8M)的添加以及随后通过在365nm激发获得的Tat-C*产生的荧光比较(图6)显示，Tat-C*/TAR RNA相对于非特异性Tat-C*/dTAR RNA对具有高10倍以上的强度比。这些FRET差异证实HIV TRA RNA传感器对特定RNA的特异性。另外，荧光素发射比不存在寡聚体1时从在荧光素吸收最大值的直接Tat-C*激发获得的高出25倍以上。能量转移复合物中增加的Tat-C*发射显示，光学放大由缀合寡聚体1提供。
实施例5将Tat-C*探针([Tat-C*]＝1.0×10-8M)与等摩尔量的TAR RNA于室温混合，并以同样的方式与非特异性dTAR RNA混合。在水中的寡聚体2([寡聚体2]＝6.O×10-8M)的添加以及随后通过在375nm激发获得的Tat-C*产生的荧光比较(图7)显示，Tat-C*/TAR RNA相对于非特异性Tat-C*/dTAR RNA对具有高15倍的强度比。这些FRET差异证实了本发明的HIV TRA RNA传感器对特定RNA的特异性。另外，荧光素发射比不存在寡聚体2时从直接Tat-C*激发获得的高出30倍以上。能量转移复合物中增加的Tat-C*发射显示，光学放大由缀合寡聚体2提供。
实施例6使用水溶性缀合聚合物1(平均n＝约15)作为集光生色团。将Tat-C*探针([Tat-C*]＝1.0×10-8M)与等摩尔量的TAR RNA于室温混合，并以同样的方式与非特异性dTAR RNA混合。将水中的聚合物1([聚合物1]＝4.8×10-7M)添加到Tat-C*和TAR RNA混合物中，引起Tat-C*的荧光(图8)，该荧光具有比非特异性Tat-C*/dTAR RNA高15倍以上、比不存在聚合物1时从直接Tat-C*激发获得的高1O倍的强度比。因此，可以实现显著较高的FRET比率和相应较高的灵敏度。1对于Tat-C*和TAR RNA混合物的滴定显示，FRET比率随1的浓度增加，直至1对TAR RNA的电荷比接近4∶1，此后发现FRET比率降低。对于寡聚体2观察到了相似的模式。
实施例7也使用另一个用荧光素在N末端标记的肽序列(SH3-C*；单字母编码AKPRPPRPLPVAC)作为信号探针，该肽序列不能与TARRNA特异性结合。图9([SH3-C*或Tat-C*]＝1.0×10-8M，[TARRNA]＝1.0×10-8M，[寡聚体1]＝8.0×10-8M)仅显示在Tat-C*存在时的C*发射。这些FRET差异证明本发明的HIV TRA RNA传感器依赖于Tat肽序列与TAR RNA的特异性相互作用。
尽管本发明参照优选的实施方案得到一些详细的描述，但按照此处的教导，本领域技术人员将认识到，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以进行某些改变和修饰。相应地，本发明仅受权利要求的限制。
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权利要求
1.测定方法，其包括提供怀疑含有靶多核苷酸的样品；提供聚阳离子多生色团，所述聚阳离子多生色团与靶多核苷酸相互作用，并且在激发后能够将能量转移给信号生色团；提供传感器多核苷酸结合蛋白(PBP)，其可以与靶多核苷酸结合，所述传感器PBP与信号生色团缀合；在如果存在靶多核苷酸，则传感器PBP可以与靶多核苷酸结合的条件下，将样品与传感器PBP和多生色团在溶液中接触；向溶液施加可以激发多生色团的光源；以及检测光是否从信号生色团发射。
2.权利要求1的方法，其中多生色团包括选自饱和聚合物、缀合聚合物、树枝状聚合物和半导体纳米晶体的结构。
3.权利要求2的方法，其中多生色团包括饱和聚合物。
4.权利要求2的方法，其中多生色团包括树枝状聚合物。
5.权利要求2的方法，其中多生色团包括半导体纳米晶体。
6.权利要求2的方法，其中多生色团包括缀合聚合物。
7.权利要求6的方法，其中缀合聚合物具有结构 其中n＝2-100,000。
8.权利要求6的方法，其中缀合聚合物具有结构
9.权利要求6的方法，其中缀合聚合物具有结构 其中n＝2-100,000。
10.权利要求6的方法，其中缀合聚合物具有结构 其中m＝1或2。
11.权利要求1的方法，其中样品与接近1∶1电荷比的传感器PBP和多生色团接触。
12.权利要求1的方法，其中样品在足够量的有机溶剂的存在下与传感器PBP和多生色团接触，以降低传感器PBP和多生色团之间的疏水相互作用。
13.权利要求1的方法，其中样品与多种不同的传感器PBP接触，所述不同的传感器PBP包括相应不同的信号生色团，其中各个不同的传感器PBP可以与相应不同的靶多核苷酸选择性结合。
14.权利要求1的方法，其中生色团为荧光团。
15.权利要求14的方法，其中荧光团选自半导体纳米晶体、荧光染料和稀土元素螯合物。
16.权利要求15的方法，其中荧光团为半导体纳米晶体。
17.权利要求15的方法，其中荧光团为荧光染料。
18.权利要求17的方法，其中荧光染料为荧光素。
19.权利要求17的方法，其中荧光团为稀土元素螯合物。
20.权利要求1的方法，其中靶多核苷酸为DNA。
21.权利要求1的方法，其中靶多核苷酸为RNA。
22.权利要求1的方法，其中样品包括单链靶多核苷酸。
23.权利要求1的方法，其中样品包括双链靶多核苷酸。
24.权利要求1的方法，其中靶多核苷酸通过扩增反应生产。
25.多核苷酸传感溶液，其包括与靶多核苷酸结合的传感器多核苷酸结合蛋白(PBP)，所述传感器PBP与信号生色团附着；聚阳离子多生色团，其可以与靶多核苷酸静电相互作用，并且当在传感器PBP与靶多核苷酸结合后引入信号生色团附近时，在激发后能够将能量转移给信号生色团。
26.测定样品中靶多核苷酸的试剂盒，其包括传感器PBP，其可以与靶多核苷酸结合；聚阳离子多生色团，其可以与靶多核苷酸静电相互作用，并且当在传感器PBP与靶多核苷酸结合后引入信号生色团附近时，在激发后能够将能量转移给信号生色团；保持传感器PBP和多生色团的盒子；以及附随所述盒子提供的说明书，其描述如何使用试剂盒的成分以测定样品中的靶多核苷酸。
27.权利要求1的方法，其中从信号生色团发射的在阈值水平之上的光显示靶多核苷酸存在于样品中。
28.权利要求1的方法，其中从信号生色团发射的光的量经过定量并用于测定样品中靶多核苷酸的量。
29.权利要求12的方法，其中荧光团是绿色荧光蛋白。
30.权利要求1的方法，其中靶多核苷酸没有扩增。
全文摘要
提供了测定样品中靶多核苷酸的方法、组合物和物品。将怀疑含有靶多核苷酸的样品与聚阳离子多生色团与传感器PBP接触，所述传感器PBP可以与靶多核苷酸结合。传感器PBP包括信号生色团，以从激发的多生色团吸收能量，并在靶多核苷酸存在时发射光。该方法可用于多重形式。也提供了试剂盒，该试剂盒包括进行这样方法的试剂。
文档编号C08G63/91GK1771335SQ200480009631
公开日2006年5月10日 申请日期2004年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者G·巴赞, B·刘, S·王 申请人:加州大学评议会