专利名称：具有芳族系聚酯降解能力的微生物以及使用该微生物的芳族系聚酯的降解方法
技术领域：
本发明涉及具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、以及使用该微生物的芳族系聚酯的降解方法。
背景技术：
近年来，脂族系聚酯通过通常的土壤微生物或脂肪酶等已知的酶来降解，从而作为生物降解性聚合物进行了研究开发。
对于对苯二甲酸、对羟基苯甲酸等具有芳族成分的聚酯，已知当含有的芳族成分为少量或耐热性显著降低时，可被通常土壤中或活性污泥中的微生物或已知酶生物降解。但是，对于降解象聚对苯二甲酸乙二醇酯(以下可简称为PET)这样的以芳族成分为主要成分的芳族系聚酯的微生物和酶则几乎尚未知晓，仅仅了解到有人提出通过用酶处理PET纤维或PBT织布来进行提高亲水性等的表面改性(参照日本特表2000-502412号公报和日本特表2001-502014号公报)。但是，明确显示PET被降解的数据则没有。
由此，降解PET时，通常采用的是在以高浓度氢氧化钠水溶液为代表的强碱性下进行加热处理的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、以及使用该微生物的芳族系聚酯的降解方法。
本发明人为实现上述目的，对于通过生物功能降解芳族系聚酯的方法进行了深入地研究，结果成功地分离出降解芳族系聚酯的微生物，完成了本发明。
即，本发明的目的通过属于根瘤菌属(Rhizobium)并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物实现。
本发明的另一目的通过芳族系聚酯的降解方法实现，其特征在于使属于根瘤菌属并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物与芳族系聚酯接触，降解该芳族系聚酯。
根据本发明，通过使用具有降解芳族系聚酯的能力、例如具有特异性降解的能力的微生物，可在温和的条件下安全、低成本、比较迅速地降解芳族系聚酯。
附图简述
图1是通过扫描电子显微镜(株式会社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的根瘤菌亚种OKH-03(Rhizobium sp.OKH-03)的照片(放大倍率20,000倍)。
图2是通过扫描电子显微镜(株式会社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的由实施例1的操作最终得到的PET薄膜的表面的照片图(放大倍率500倍)。
图3是通过扫描电子显微镜(株式会社日立制作所制造“SEM-2400”)拍照的由比较例1的操作最终得到的PET薄膜的表面的照片图(放大倍率500倍)。
实施发明的最佳方式以下详细说明本发明。
本发明中，芳族系聚酯可以是以芳族成分作为重复单元、例如含有50重量％或以上的聚对苯二甲酸乙二醇酯的聚酯。特别优选含有95重量％或以上的对苯二甲酸乙二醇酯重复单元。此时，作为可共聚的成分，例如作为除对苯二甲酸以外的二羧酸成分可举出邻苯二甲酸、间苯二甲酸、联苯二羧酸、二苯氧基乙烷二羧酸、2，6-萘二甲酸之类的芳族二羧酸及其衍生物，如琥珀酸、己二酸、壬二酸、癸二酸、癸烷二羧酸之类的脂族二羧酸及其衍生物。
乙二醇以外的二醇成分例如有二甘醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、丙二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，10-癸二醇等。
该芳族系聚酯的形状例如是纤维状、薄膜状、块状、它们的混合体等，可以是任何形态。
本发明的微生物只要是属于根瘤菌属、并具有降解芳族聚酯的能力的微生物即可，可以是任何微生物，特别优选根瘤菌亚种OKH-03(菌种保藏号FERM P-19483)。
上述菌株是本发明人在日本国内的土壤中新分离出的菌株，具有以下的细菌学性质。该菌株(杆菌)的SEM照片如图1所示。
表1
化学分类学性质·核蛋白体DNA的序列如SEQ ID N0.1所示。
基于这些性质，与《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey′s manualof systematic bacteriology)等比对，结果确认是属于根瘤菌属的微生物，但不是属于该属的公知菌株，因此，作为新发现菌株，于2003年8月11日，将该菌株保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(保藏号FERM P-19483)。属于根瘤菌属的微生物为生物安全性级别I，没有病原性，因此通过使用该菌株，可以进行生物学上安全的操作。
接着，对属于根瘤菌属、具有降解芳族系聚酯的能力的微生物的分离方法进行说明。
降解芳族系聚酯的微生物在土壤中或其它场所认为均存在，因此，从土壤、海洋等中取样，将其用公知的方法进行筛选，即可分离出具有降解芳族系聚酯的能力的微生物。特别优选从芳族系聚酯废弃物集中存放处或垃圾箱等中取样。
接着，使用含有芳族系聚酯作为唯一碳源的培养基作为培养基(以下也将该培养基称为芳族系聚酯培养基)。
其它氮源、矿物质源等例如可以使用硫酸铵、硝酸铵等无机铵盐，硫酸铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等金属盐及其水合物。
培养方法例如有振荡培养、静置培养等。为了从微生物的混合系统中获得特定的微生物，优选振荡培养，其中特别优选与限定营养源进行培养的浓缩(集积)培养法结合使用。
将从土壤等中取样的样品在上述培养基中培养，每隔规定时间添加培养基，使有用细菌浓集。
对培养时间没有特别限定，例如优选1-2个月左右。接着取出浓缩培养液中的芳族系聚酯，评价微生物对芳族系聚酯的降解活性。评价方法没有特别限定，例如通过扫描电子显微镜进行的表面观察，这既简便准确性又高，优选。
将上述具有芳族系聚酯降解能力的样品适当稀释，涂抹于LE琼脂培养基(LE培养基中进一步添加琼脂的培养基)等，形成菌落，进行分离(一次筛选)。
接着，再从经过一次筛选的菌株中筛选芳族系聚酯降解能力高的菌株(二次筛选)。即，通过使上述菌体增殖到对数增殖期、将浓集的大量菌体接种到芳族系聚酯培养基中等的方法进行培养，然后确认其芳族系聚酯降解能力，可得到具有芳族系聚酯降解能力的菌株。
将具有芳族系聚酯降解能力的菌株单独或组合使用，则可以安全且低成本地降解芳族系聚酯。
该降解方法可通过使上述微生物与芳族系聚酯接触而容易地进行。
这里，上述微生物与芳族系聚酯的接触优选通过将作为降解对象的芳族系聚酯浸泡在存在上述微生物的水溶液中来进行。
可以使用只有芳族系聚酯作为唯一的碳源的培养基作为该水溶液，并没有特别的限制，但优选芳族系聚酯以外的有机营养源的存在量为0.2重量％或以下，使用LE培养基，更优选使用在该LE培养基中添加无机化合物的培养基。这里所述的LE培养基是含有莴苣和蛋黄的提取液的培养基，可按照以下的方法制备。将3g在110℃干燥5小时的莴苣叶和3g煮蛋的蛋黄分别用1L离子交换水煮10分钟，冷却至室温后，用滤纸过滤。将这些滤液混合，以所得作为LE培养基。
这里所添加的无机化合物例如有硫酸铵、硝酸铵等无机铵盐，硫酸铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等金属盐及其水合物。
使微生物和芳族系聚酯接触的温度条件低于40℃，例如优选20-37℃的范围，进一步优选25-35℃，特别优选30℃。
接触时的pH优选6-9的范围。为了使pH在该范围内，例如将芳族系聚酯浸泡在水溶液中进行接触时，可以使用如盐酸、硫酸的无机酸，如氢氧化钠、氢氧化钾的无机碱及其水溶液对该水溶液进行调节。也可以使用如磷酸缓冲液的各种缓冲液进行调节。
最优选的条件是在20-37℃、在pH为6-9范围的LE培养基中，使本发明的微生物与芳族系聚酯接触。不过，通过其它方法，只要微生物与芳族系聚酯接触、芳族系聚酯可被降解，则也可以采用。
本发明的微生物与芳族系聚酯接触时，优选使微生物吸附于芳族系聚酯，在芳族系聚酯表面形成生物膜。这里所述的生物膜指的是微生物与其排泄物构成的层状物质，由此，本微生物与芳族系聚酯牢固粘附，并且形成降解芳族系聚酯的场所。
本发明的微生物与芳族系聚酯接触的时间是至少24小时即可，根据目标芳族系聚酯的降解量，可以设定任意的时间。接触时间达到2周或以上时，最好每2周将水溶液更换为新的水溶液。
通过上述方法，可以以0.5-4个月左右这样短的时间进行在自然界中几乎不降解的芳族系聚酯的降解。已确认生成二氧化碳作为降解产物。
实施例以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明不由此受任何限定。
实施例1将PET膜在0.1当量的盐酸水溶液中浸泡3小时，然后在70重量％的乙醇水溶液中浸泡12小时以上，通过在无菌状态下干燥，进行灭菌处理，准备尺寸1.4cm×2.0cm、重量60.7mg这种PET膜作为芳族系聚酯。将该PET膜与10ml由表2记载的成分构成的pH7.0的水溶液培养基、1ml含有根瘤菌属亚种OKH-03(保藏号FERM P-19483)的培养液一起密封在带有有机硅栓的内径18mm的试管中。
表2
保持好氧条件，使用横向振动的振荡培养机，在30℃、300行程/分钟的条件下进行振荡，每2周将试管内的溶液更换成新溶液，共进行55天的振荡培养。
从试管内取出PET膜，在70重量％的乙醇溶液中超声波处理20分钟，除去由附着于膜表面的菌体和菌体排泄物形成的生物膜。
接着将该PET膜在室温、真空下干燥24小时，然后测定重量，降解处理后的PET膜的重量是56.2mg，减量率为7.4％，降解速度为0.015mg/cm2·天。降解处理后，如图2所示，通过电子显微镜目视观察，可见表面被降解。
比较例1实施例1中，不添加含有根瘤菌属亚种OKH-03(保藏号FERM P-19483)的培养液，除此之外进行同样的操作，PET膜的重量是60.7mg，未见显著的重量减少。如图3所示，通过电子显微镜目视观察，可见表面未被降解。
序列表<110>京都工艺纤维大学长帝人株式会社<120>具有芳族系聚酯降解能力的微生物以及使用该微生物的芳族系聚酯的降解方法<130>P37008<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>469<212>DNA<213>根瘤菌sp.OKH-03<400>1tggagagttt gatcctggct cagaacgaac gctggcggca ggcttaacac atgcaagtcg 60agcgcatcgc aagatgagcg gcagacgggt gggtaacgcg tgggaatcta ccgtgcccta120cggaatagct ccgggaaact ggaattaata ccgtatacgc ccttcggggg aaagatttat180cggggtatga tgagcccgcg ttggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg240acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg ggactgagac acggcccaaa300ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat360gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcaccggtga agataatgac420ggtaaccgga gaagaagccc cggctaactt cgtgccagca gccgcggta469
权利要求
1.微生物，该微生物属于根瘤菌属并具有降解芳族系聚酯的能力。
2.权利要求1的微生物，该微生物被命名为根瘤菌属亚种OKH-03(Rhizobium sp.OKH-03)，以保藏号FERM P-19483保藏。
3.芳族系聚酯的降解方法，其特征在于使权利要求1的微生物与芳族系聚酯接触，降解该芳族系聚酯。
4.权利要求3的方法，其中芳族系聚酯含有95重量％或以上的对苯二甲酸乙二醇酯重复单元。
5.权利要求3的方法，其中微生物与芳族系聚酯的接触在LE培养基中进行。
6.权利要求3的方法，其中微生物与芳族系聚酯的接触在20℃-37℃的范围进行。
7.权利要求3的方法，其中微生物与芳族系聚酯的接触在pH6-9的范围进行。
8.权利要求3的方法，其中使微生物与芳族系聚酯的接触在微生物在芳族系聚酯的表面形成生物膜的状态下进行。
全文摘要
本发明提供属于根瘤菌属(Rhizobium)并具有降解芳族系聚酯的能力的微生物、使用该微生物进行的芳族系聚酯的降解方法，通过该方法，可以安全且低成本、并且较迅速地降解芳族聚酯。
文档编号C08J11/10GK1871339SQ20048003082
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月19日 优先权日2003年8月22日
发明者小田耕平, 木村良晴, 平贺和三, 前田康人, 丰原清纲, 峰松宏昌 申请人:帝人株式会社