专利名称：改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，属于生 物医药材料、药物递送以及分子影像学领域。
背景技术：
目前多功能纳米粒子(如光响应纳米粒子、磁响应纳米粒子和电响应纳米粒子) 已经广泛应用于分子影像、细胞分选等生物学领域。例如，超顺磁氧化铁纳米粒子已经作为 磁共振显影剂(如现有产品Feridex I. V.)和药物载体使用(Langmuir 2007，23，6342)；光 致发光量子点在细胞显影上的使用已得到充分证实和肯定(Nature Biotechnology2004, 22，8)，而且根据最新的科学研究表明金纳米粒子有望作为新一代X射线显影剂 (TheBritish Journal of Radiology,2006，79，248)。目前纳米晶体制造技术大体可分为两种方法水相合成法和有机相合成法 (Chem. Mater. 1996，8，2209 ;J. Am. Chem. Soc. 2004，126，273)。水相合成法所制备的纳米晶 体可直接分散于水中，但由于合成出的晶体粒径不均一、粒径分布广，物理性能较有机相制 备的晶体有所欠缺，水相合成的量子点荧光产率低于有机相制备的量子点，水相合成的超 顺磁氧化铁晶体的磁学性质也较差。这就造成水相合成的纳米晶体在生物学和工业应用上 的局限性。有机相制备的高性能纳米晶体，有着均一的粒径分布和可控的物理特性，但生物 相容性亟待提高。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足而提供一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳 米复合粒子的制备方法，其特点是将有机相合成的纳米晶体进行相转换，即从有机相转换 到水相。但在相转换过程中，要求不能出现大量颗粒团聚，不会在纯水溶剂或缓冲水溶剂中 造成沉淀。而且要根据不同的用途做到分散程度的可控性。相转换后的纳米粒子根据应用 条件添加不同的表面基团进行修饰，以满足必要的功能和性质要求。纳米晶体通过改性聚 乙烯亚胺的包裹，保持了原有纳米晶体物理特性同时又在水相中具有良好分散性能。本发明目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外都是重量份 数。改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备方法包括以下步骤1.改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体构建的纳米复合粒子的制备将浓度为2-10mg/ml单一分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的纳米晶体加 入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称取纳米晶体 0. 001-0. 5 重量份；将浓度为5-20mg/ml改性聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液、四氢呋喃溶液或乙醇溶液 1-10重量份与上述干燥的纳米晶体于温度25-30°C震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度25-30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5-100重量份水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4-12的磷酸缓冲溶液，震荡摇勻；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶 剂，制得改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体构建的纳米复合粒子。2.改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体和药物构建的纳米复合粒子的制备将浓度为2-10mg/ml单一分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的纳米晶体加 入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称取纳米晶体 0. 001-0. 5重量份，并加入0. 01-1重量份的疏水性药物阿霉素或顺钼；将浓度为5-20mg/ml改性聚乙烯亚胺的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶液1_10重量 份，加入到上述纳米晶体和药物的混合物质中，震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度25-30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5-100重量份 水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4-12的磷酸缓冲溶液，震荡摇勻；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶 剂，制得改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体和药物构建的纳米复合粒子。3.短肽修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备将上述方法制备的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 001-0. 5重量份，分散 在5-50重量份PH值为7. 4，浓度为3mg/ml乙二胺四乙酸二钠的磷酸缓冲溶液中；将0. 001-50 重量份的交联剂 N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate 或N- (Maleimidoacetoxy) -succinimide ester溶解于1-10重量份二甲亚砜溶剂中制成 交联剂溶液，把交联剂溶液与上述磷酸缓冲溶液混合均勻，在搅拌下，于温度25°C反应4小 时，得到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500-1000重量份透析3次，得到交联剂修饰 的纳米复合粒子；将含有巯基修饰的环精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽或甘氨酸_甘氨酸_半胱氨 酸_甘氨酸_精氨酸_赖氨酸_赖氨酸_精氨酸_精氨酸_谷氨酰胺_精氨酸_精氨酸_精 氨酸-赖氨酸短肽0. 001-0. 5重量份溶解于10-100重量份PH值7. 4的磷酸缓冲溶液中， 将此溶液与上述交联剂修饰的纳米粒子溶液混合，在搅拌下，于温度25-30°C反应8小时， 得到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500-1000重量份透析3次；制得短肽修饰的改 性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。4.葡萄糖单糖或葡聚糖多糖或聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合 粒子的制备(a)葡萄糖单糖或葡聚糖多糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备将上述方法制备的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 001-0. 5重量份分散 于10-100重量份PH值8. 5的硼酸盐缓冲溶液中，加入0. 001-0. 5重量份的葡萄糖单糖或 分子量为2000、4000或5000g/mol的葡聚糖多糖；按氰基硼氢化钠与葡萄糖单糖或葡聚糖多糖的摩尔比1-10 1，向上述溶液中加 入氰基硼氢化钠，在搅拌下，于温度25-30°C反应48-72小时；将上述粗产物用500-1000重量份去离子水透析3次，制得葡萄糖单糖或葡聚糖多 糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子；(b)聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备将分子量为2000、4000或5000g/mol的聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺0. 001-0. 5重量份溶于1-20重量份三氯甲烷或四氢呋喃溶剂中，加入0. 001-0. 5重量份纳 米晶体或0. 01-1重量份疏水性药物阿霉素或顺钼和0. 001-0. 5重量份纳米晶体的混合物， 震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度25_30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5_100重量份 水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4-12的磷酸缓冲溶液，震荡摇勻；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷或四氢呋喃溶剂，制 得聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。5.多层复合聚电解质修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备将带有负电荷的浓度为l-10mg/ml，分子量为5000g/mol的聚苯乙烯磺酸钠或 硫酸葡聚糖水溶液5-10重量份加入圆底烧瓶中，在搅拌速度500-1000rpm下，于温度 25-30°C，再将上述方法制得的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 001-0. 5重量份滴 加到瓶中；待反应1-4小时后，将瓶中的溶液转移至离心管中，设定转速为2000-8000rpm，离 心5-20min，离心后的下层沉积物加入少量纯水分散，得到第一层包裹带有负电荷聚电解质 层的纳米复合粒子；按上述方法制备同样浓度带有正电荷的分子量为5000g/mol的聚烯丙基胺盐酸 盐或壳聚糖聚电解质水溶液，并加入上述制备的第一层包裹带有负电荷聚电解质层的纳米 粒子，应用相同方法制得第二层包裹带有正电荷聚电解质层的纳米粒子。重复以上步骤制 得多层复合聚电解质修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。6.纳米金或纳米银粒子修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备将上述方法制得的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 001-0. 5重量份加入 到5-50重量份纯水中，在搅拌下，加热到70-100°C ；按氮元素与金或银元素的摩尔比0.5-5 1向上述反应液中加入四氯金酸或硝酸 银；在温度70-100°C下，反应l-20min后移除热源，将粗产物以转速1000-8000rpm离 心2-lOmin，收集沉淀并再次用纯水分散，制得以纳米金或纳米银粒子修饰的改性聚乙烯亚 胺构建的纳米复合粒子。纳米晶体为顺磁氧化铁纳米晶体Fe304、γ _Fe203、MnFe2O4或CoFe2O4,超顺磁纳米 晶体FePt ；金纳米晶体或银纳米晶体；量子点纳米晶体CdSe或CdZnS，具有壳层结构晶体 CdSe/ZnS 或 CdSe/CdS 中的任一种。改性聚乙烯亚胺为疏水基团接枝改性的支化聚乙烯亚胺或线性聚乙烯亚胺，其 中支化聚乙烯亚胺或线性聚乙烯亚胺的分子量为600g/mOl、1800g/mOl、10000g/mOl或 25000g/mol中的任一种。改性聚乙烯亚胺中的疏水基团为C6-C18的饱和烷烃；胆固醇；胆酸；聚己内酯或聚 乳酸中的任一种。性能测试1.应用透射电镜对改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子进行表征。如图2所示， 对比图2a所示有机相分散的Fe3O4纳米晶体和图2b所示纯水中分散的饱和十二烷烃改性 支化聚乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒子，结果表明制备的纳米复合粒子在水相溶剂中可单一分散。如图4所示，水相溶剂中分散的聚己内酯改性支化聚乙烯亚胺 包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒子，结果表明制备的纳米复合粒子在水相溶剂中可 形成团簇结构。如图8所示，改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子应用聚乙烯亚胺上的氨 基对水相中金离子的还原，形成原位晶体生长，透射电镜结果表明纳米复合粒子表面修饰 有纳米金粒子。2.应用电位粒径测试仪对水相溶液中分散的改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米 复合粒子进行粒径和电位测试。如图10和图11所示，蓝色线条为聚乙二醇修饰的改性聚 乙烯亚胺构建的纳米复合粒子；绿色线条为葡萄糖单糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米 复合粒子；红色线条为未加修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。结果表明修饰有 聚乙二醇和葡萄糖单糖的纳米复合粒子粒径未发生明显变化，但纳米复合粒子电位变小， 表明葡萄糖单糖和聚乙二醇成功修饰在纳米复合粒子表面。3.应用荧光光度计对改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子进行光学性能测试。如 图5所示，对比三氯甲烷中分散的CdSe/ZnS纳米晶体和改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳 米晶体构建的纳米复合粒子，从有机相转移到水相前后荧光发射光谱未发生变化。4.紫外分光光度计对改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子进行光学性能测试。如 图6所示，对比三氯甲烷中分散的纳米金晶体和改性聚乙烯亚胺包裹纳米金晶体构建的纳 米复合粒子，从有机相转移到水相前后紫外吸收峰值未发生变化。如图9所示，纳米金修饰 的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子中存在纳米金的紫外吸收峰。5.应用激光共聚焦显微镜对改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子标记的细胞进 行光学性能测试。如图7所示，应用改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳米晶体构建的纳米复 合粒子对小鼠间充质肝细胞进行细胞标记，纳米复合粒子可以有效地进入细胞质内。6.应用超导量子干涉仪对改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的磁学性质进行 测试。如图3所示，结果证实改性聚乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒子保持 了原有Fe3O4纳米晶体超顺磁性。本发明具有如下优点1.改性聚乙酰亚胺对纳米晶体和疏水性药物进行包裹，实现将纳米晶体和疏水性 药物从有机相转移至水相中。转移到水相后纳米晶体原有的物理学特性不发生改变。所制 备的纳米复合粒子粒径可调。2.改性聚乙酰亚胺构建的纳米复合粒子表面可进行多种化学基团修饰或使用层 层自组装方法对纳米复合粒子进行表面修饰。3.在改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子水溶液中应用聚乙烯亚胺上的氨基对 水相中金离子或银离子的还原，形成原位晶体生长。4.改性聚乙酰亚胺构建的纳米复合粒子应用于细胞标记、基因载入以及显影成像。
图1为改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体构建纳米复合粒子流程2为正己烷中分散的Fe3O4纳米晶体和饱和十二烷烃改性聚乙烯亚胺包裹纳米 Fe3O4晶体构建的纳米复合粒子进行相转移前(a)和相转移后(b)透射电镜图片。
8
图3为饱和十二烷烃改性聚乙烯亚胺包裹纳米Fe3O4晶体构建的纳米复合粒子在 测试温度300K磁滞回线数据。图4为聚己内酯改性聚乙烯亚胺包裹MnFe2O4纳米晶体构建的纳米复合粒子透射 电镜图片。图5为三氯甲烷中分散的CdSe/ZnS量子点纳米晶体和水溶液中饱和十八烷烃改 性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS量子点纳米晶体构建的纳米复合粒子荧光发射光谱图像。图6为三氯甲烷溶液中分散的金纳米晶体和水相溶液中胆酸改性聚乙烯亚胺包 裹金纳米晶体构建的纳米复合粒子紫外_可见光吸收光谱。图7为饱和十八烷烃改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS量子点纳米晶体构建的纳米 复合粒子进行细胞标记，被标记细胞激光共聚焦显微镜拍摄结果。图8为金纳米粒子修饰的改性聚乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒 子透射电镜图片。图9为金纳米粒子修饰的改性聚乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒 子紫外_可见光吸收光谱图。图10为应用电位粒径测试仪对水相溶液中分散的聚乙二醇和葡萄单糖修饰的改 性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子电位测试图谱。图11为应用电位粒径测试仪对水相溶液中分散的聚乙二醇和葡萄单糖修饰的改 性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子粒径测试图谱。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于 对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例1将浓度为10mg/ml，在正己烷中单一分散的Fe3O4纳米晶体加入试剂瓶中，通过真 空干燥方式去除有机溶剂，然后称取Fe3O4纳米晶体0. OOlg ；将浓度为20mg/ml饱和十二烷 烃改性支化聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液IOg与上述干燥的纳米晶体于温度25°C震荡混合 均勻；将上述有机溶液在温度25°C，超声功率130W，振幅65%，加入到IOOg纯水中，震荡摇 勻24小时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷溶剂；制得改性聚 乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒子。如图2所示，透射电镜结果显示改性聚 乙烯亚胺包裹Fe3O4纳米晶体构建的纳米复合粒子在水相中单一分散。如图3所示，通过超 导量子干涉仪检测纳米晶体相转移后保持原有Fe3O4纳米晶体超顺磁物理性质。实施例2将浓度为8mg/ml，在正己烷中单一分散的MnFe2O4纳米晶体加入试剂瓶中，通过真 空干燥方式去除有机溶剂，然后称取MnFe2O4纳米晶体0. 5g ；将浓度为20mg/ml聚己内酯改 性支化聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液IOg与上述干燥的纳米晶体于温度25°C震荡混合均勻； 将上述有机溶液在温度30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5g纯水中，震荡摇勻24小 时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂；制得改性聚乙烯亚 胺包裹MnFe2O4纳米晶体构建的纳米复合粒子。如图4所示，透射电镜结果显示改性聚乙烯亚胺包裹MnFe2O4纳米晶体构建的纳米复合粒子在水相溶液中呈团簇结构。实施例3将浓度为2mg/ml，在正己烷中单一分散的FePt纳米晶体加入试剂瓶中，通过真空 干燥方式去除有机溶剂，然后称取FePt纳米晶体0. OOlg ；将浓度为20mg/ml胆固醇改性线 性聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液Ig与上述干燥的纳米晶体于温度25°C震荡混合均勻；将上 述有机溶液在温度25°C，超声功率130W，振幅65%，加入到IOg PH值为4的磷酸缓冲溶液 中，震荡摇勻24小时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷溶剂； 制得改性聚乙烯亚胺包裹FePt纳米晶体构建的纳米复合粒子。实施例4将浓度为4mg/ml，在三氯甲烷中单一分散的CdSe/ZnS纳米晶体加入试剂瓶中，通 过真空干燥方式去除有机溶剂，然后称取CdSe/ZnS纳米晶体0. 02g ；将浓度为20mg/ml饱 和十八烷烃改性线性聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液IOg与上述干燥的纳米晶体于温度25V 震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度250C，超声功率130W，振幅65 %，加入到20g纯水 中，震荡摇勻24小时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷溶剂； 制得改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳米晶体构建的纳米复合粒子。如图5所示，对比有机 相中CdSe/ZnS和水相中改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳米晶体构建的纳米复合粒子的荧 光发射光谱谱图，图谱显示相转移前后CdSe/ZnS纳米晶体光学性质未发生变化。实施例5将浓度为2mg/ml，在三氯甲烷中单一分散的CdZnS纳米晶体加入试剂瓶中通过真 空干燥方式去除有机溶剂，然后称取CdZnS纳米晶体0. OOlg ；将浓度为20mg/ml聚乳酸改 性线性聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液Ig与上述干燥的纳米晶体于温度30°C震荡混合均勻； 将上述有机溶液在温度30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到20g PH值为12的磷酸缓冲 溶液中，震荡摇勻24小时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷溶 剂；制得改性聚乙烯亚胺包裹CdZnS纳米晶体构建的纳米复合粒子。实施例6将浓度为4mg/ml，在三氯甲烷中单一分散的纳米金晶体加入试剂瓶中，通过真空 干燥方式去除有机溶剂，然后称取纳米金晶体0. OOlg ；将浓度为20mg/ml胆酸改性支化聚 乙烯亚胺的三氯甲烷溶液IOg与上述干燥的纳米晶体于温度25°C震荡混合均勻。将上述有 机溶液在温度25°C，超声功率130W，振幅65%，加入到20g纯水中，震荡摇勻24小时；通过 减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷溶剂；制得改性聚乙烯亚胺包裹纳 米金晶体构建的纳米复合粒子。如图6所示，对比三氯甲烷中纳米金晶体和水相中改性聚 乙烯亚胺包裹纳米金晶体构建的纳米复合粒子的紫外_可见光吸收光谱图，图谱显示相转 移前后纳米金晶体光学性质未发生变化。实施例7将浓度为10mg/ml，在正己烷中单一分散的Fe3O4纳米晶体加入试剂瓶中通过真 空干燥方式去除有机溶剂，然后称取Fe3O4纳米晶体0. OOlg并加入0. Olg的疏水性药物阿 霉素；将浓度为5mg/ml聚己内酯改性支化聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液Ig加入到上述干燥 的纳米晶体与药物的混合物质中，震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度25°C，超声功率 130W，振幅65%，加入到5g纯水中，震荡摇勻24小时；通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂；制得改性聚乙烯亚胺包裹药物和纳米晶体构建的纳米复合 粒子。实施例8将浓度为2mg/ml，在正己烷中单一分散的CdZnS纳米晶体加入试剂瓶中通过真空 干燥方式去除有机溶剂，然后称取CdZnS纳米晶体0. 5g并加入Ig的疏水性药物顺钼；将 浓度为20mg/ml聚乳酸改性支化聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液IOg加入到上述干燥的纳米晶 体与药物的混合物质中，震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度30°C，超声功率130W，振幅 65%，加入到10g，PH值为12的磷酸缓冲溶液中，震荡摇勻24小时；通过减压旋转蒸发方法 除去上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂；制得改性聚乙烯亚胺包裹药物和纳米晶体构建 的纳米复合粒子。实施例9将上述方法制备的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 5g，分散在50g PH值为7. 4，浓度为3mg/ml乙二胺四乙酸二钠的磷酸缓冲溶液中；将0. 5g的交联剂 N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate 溶解于 Ig 二甲亚砜溶剂中制成交联剂 溶液，把交联剂溶液与上述磷酸缓冲溶液混合均勻，在搅拌下，于温度25°C反应4小时，得 到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500g透析3次，得到交联剂修饰的纳米复合粒子； 将含有巯基修饰的环精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽0. 5g溶解于IOg PH值7. 4的磷酸缓 冲溶液中，将此溶液与上述交联剂修饰的纳米粒子溶液混合，在搅拌下，于温度30°C反应8 小时，得到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500g透析3次；制得短肽修饰的改性聚乙 烯亚胺构建的纳米复合粒子。实施例10将改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0.5g分散于IOg PH值8. 5的硼酸盐缓 冲溶液中，加入0. 5g的葡萄糖单糖；按氰基硼氢化钠与葡萄糖单糖或葡聚糖多糖的摩尔比 10 1向上述溶液中加入氰基硼氢化钠，在搅拌下，于温度30°C反应72小时；将上述粗产 物用500g去离子水透析3次，制得葡萄糖单糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒 子。如图10和图11为葡萄糖单糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子粒径和电位 测试结果，结果表明修饰有葡萄糖单糖的纳米复合粒子粒径未发生明显变化，但纳米复合 粒子电位变小，表明葡萄糖单糖成功修饰在纳米复合粒子表面。实施例11将分子量为2000g/mol的聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺0. 5g溶于Ig四氢呋喃 溶剂中，加入0. 5g CdZnS纳米晶体，震荡混合均勻；将上述有机溶液在温度25°C，超声功率 130W，振幅65%，加入到IOOg纯水溶剂中，然后震荡摇勻；通过减压旋转蒸发方法除去上述 水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂，制得聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒 子。如图10和图11为聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子粒径和电位测 试结果，结果表明修饰有聚乙二醇的纳米复合粒子粒径未发生明显变化，但纳米复合粒子 电位变小，表明葡萄糖单糖和聚乙二醇成功修饰在纳米复合粒子表面。实施例12将浓度10mg/ml，分子量为5000g/mol的聚苯乙烯磺酸钠水溶液IOg加入到圆底烧 瓶中，在搅拌速率500rpm，温度25°C下，将上述方法制得的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子水相溶液0. OOlg加入到瓶中，全过程用时约为lOmin;待反应4小时后，将瓶中的溶 液转移至离心管中，设定转速为8000rpm，离心20min，离心后的下层沉积物加入少量纯水 分散，得到第一层包裹带有负电荷聚电解质层的纳米复合粒子；按上述方法制备同样浓度 带有正电荷的分子量为5000g/mol的聚烯丙基胺盐酸盐聚电解质溶液，向其中滴加上述制 备的第一层包裹带有负电荷聚电解质层的纳米粒子，应用相同方法制得第二层包裹带有正 电荷聚电解质层的纳米粒子。重复以上步骤，制得多层复合聚电解质修饰的改性聚乙烯亚 胺构建的纳米复合粒子。实施例13将饱和十二烷烃改性支化聚乙烯亚胺包裹Fe304纳米晶体构建的纳米复合粒子 0.5g加入到50g纯水中，在搅拌下将溶液加热到70°C ；按氮元素和金的摩尔比例5 1 向上述反应液中加入四氯金酸；在温度70°C下，反应20min后移除热源，将粗产物以转速 SOOOrpm离心lOmin，收集沉淀并再次用纯水分散，制得以纳米金修饰的改性聚乙烯亚胺构 建的纳米复合粒子。对产物应用透射电镜和紫外_可见分光光度计进行检测。检测结果如 图8和图9所示，改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子表面修饰有纳米金粒子。应用实例1应用饱和十二烷烃改性聚乙烯亚胺包裹Fe304纳米晶体粒子进行细胞标记。将所 选取的小鼠骨髓基质干细胞在2cm2细胞培养皿上进行常规细胞铺板，24小时后加入0. 02g 疏水十二烷烃改性聚乙烯亚胺包裹纳米Fe304晶体粒子，标记2-4小时后弃掉标记液，加入 完全培养基后继续常规培养48小时后制得由改性聚乙烯亚胺包裹Fe304纳米晶体构建的纳 米复合粒子标记的小鼠骨髓基质干细胞。应用实例2应用聚己内酯改性聚乙烯亚胺包裹的MnFe204纳米晶体载体复合质粒DNA构建的 多功能分子显影纳米复合粒子。将0.05g聚己内酯改性聚乙烯亚胺包裹的纳米晶体粒子， 过滤除菌；按照该纳米粒子溶液中所含有的聚乙烯亚胺中氮元素和质粒DNA中磷元素的氮 磷摩尔比0.5 1-25 1进行调控，将纳米复合体和质粒DNA水溶液混合。室温静置30 分钟得到一种非病毒基因转染载体复合质粒DNA构建的多功能纳米复合粒子。该非病毒基 因转染载体复合质粒DNA构建的多功能纳米复合粒子粒径可控(15-200nm)，在不同氮磷摩 尔比条件下表面可带不同程度的正电和负电。应用实例3应用饱和十八烷烃改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS壳层结构纳米晶体粒子进行细 胞标记。将所选取的小鼠骨髓间充质干细胞在2cm2细胞培养皿上进行常规细胞铺板，24小 时后加入0. 001g饱和十八烷烃改性聚乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳米晶体构建的纳米复合粒 子，标记2-4小时后弃掉标记液，加入完全培养基后继续常规培养24-48小时后制得改性聚 乙烯亚胺包裹CdSe/ZnS纳米晶体构建的纳米复合粒子标记的小鼠骨髓基质干细胞。实验 结果通过激光共聚焦对标记后细胞进行检测。细胞标记结果如图7所示，证明细胞可高效 吞噬纳米复合粒子。应用实例4应用改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子复合质粒DNA构建的多功能纳米复合 粒子在体外转染中的应用方法及应用磁共振成像(MRI)进行检测的方法，其步骤和条件如下 选取细胞株进行转染，在细胞培养皿上进行常规细胞铺板，24小时后加入由不同 氮磷摩尔比构建的前述纳米复合物0. 001-lg进行基因转染，4-6小时后弃掉转染液，加入 完全培养基后继续常规培养24-48小时后可检测外源基因在转染细胞较高水平表达。应用 1. 5T核磁共振扫描方法如下，将转染后的细胞0. 1 X 106-3 X 106转移至0. lml离心管中，与 5%浓度的gelatin phantom混合均勻，应用戊二醛交联固定。将固定后的细胞放置于1. 5T 磁共振扫描仪中，进行T2-Weighted或T2*或其它序列扫描获得磁共振影像。
权利要求
一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)将浓度为2 10mg/ml单一分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的纳米晶体加入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称取纳米晶体0.001 0.5重量份；(2)将浓度为5 20mg/ml改性聚乙烯亚胺的三氯甲烷溶液、四氢呋喃溶液或乙醇溶液1 10重量份与上述干燥的纳米晶体于温度25 30℃震荡混合均匀；(3)将上述有机溶液在温度25 30℃，超声功率130W，振幅65％，加入到5 100重量份水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4 12的磷酸缓冲溶液，震荡摇匀；(4)通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶剂，制得改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体构建的纳米复合粒子。
2.一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包 括以下步骤(1)将浓度为2-10mg/ml单一分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的纳米晶体加 入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称取纳米晶体 0. 001-0. 5重量份，并加入0. 01-1重量份的疏水性药物阿霉素或顺钼；(2)将浓度为5-20mg/ml改性聚乙烯亚胺的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶液1_10重量 份，加入到上述纳米晶体和药物的混合物质中，震荡混合均勻；(3)将上述有机溶液在温度25-30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5-100重量份 水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4-12的磷酸缓冲溶液，震荡摇勻；(4)通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷、四氢呋喃或乙醇溶 剂，制得改性聚乙烯亚胺包裹纳米晶体和药物构建的纳米复合粒子。
3.一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包 括以下步骤(1)将上述方法制备的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0.001-0. 5重量份，分散 在5-50重量份PH值为7. 4，浓度为3mg/ml乙二胺四乙酸二钠的磷酸缓冲溶液中；(2)将0. 001-0. 5 重量份的交联剂 N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate 或N- (Maleimidoacetoxy) -succinimide ester溶解于1-10重量份二甲亚砜溶剂中制成 交联剂溶液，把交联剂溶液与上述磷酸缓冲溶液混合均勻，在搅拌下，于温度25°C反应4小 时，得到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500-1000重量份透析3次，得到交联剂修饰 的纳米复合粒子；(3)将含有巯基修饰的环精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽或甘氨酸_甘氨酸_半胱氨 酸_甘氨酸_精氨酸_赖氨酸_赖氨酸_精氨酸_精氨酸_谷氨酰胺_精氨酸_精氨酸_精 氨酸_赖氨酸短肽0. 001-0. 5重量份溶解于10-100重量份PH值7. 4的磷酸缓冲溶液中， 将此溶液与上述交联剂修饰的纳米粒子溶液混合，在搅拌下，于温度25-30°C反应8小时， 得到的粗产物用PH值7. 4的磷酸缓冲溶液500-1000重量份透析3次；制得短肽修饰的改 性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。
4.一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包 括以下步骤a.葡萄糖单糖或葡聚糖多糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备(1)将上述方法制备的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0.001-0. 5重量份分散于 10-100重量份PH值8. 5的硼酸盐缓冲溶液中，加入0. 001-0. 5重量份的葡萄糖单糖或分子 量为2000、4000或5000g/mol的葡聚糖多糖；(2)按氰基硼氢化钠与葡萄糖单糖或葡聚糖多糖的摩尔比1-10 1，向上述溶液中加 入氰基硼氢化钠，在搅拌下，于温度25-30°C反应48-72小时；(3)将上述粗产物用500-1000重量份去离子水透析3次，制得葡萄糖单糖或葡聚糖多 糖修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子；b.聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备(1)将分子量为2000、4000或5000g/mol的聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺 0. 001-0. 5重量份溶于1-20重量份三氯甲烷或四氢呋喃溶剂中，加入0. 001-0. 5重量份纳 米晶体或0. 01-1重量份疏水性药物阿霉素或顺钼和0. 001-0. 5重量份纳米晶体的混合物， 震荡混合均勻；(2)将上述有机溶液在温度25-30°C，超声功率130W，振幅65%，加入到5-100重量份 水相溶剂中，其中水相溶剂为纯水或PH值为4-12的磷酸缓冲溶液，震荡摇勻；(3)通过减压旋转蒸发方法除去上述水相溶液中残留的三氯甲烷或四氢呋喃溶剂，制 得聚乙二醇修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。
5.一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包 括以下步骤(1)将带有负电荷的浓度为l-10mg/ml，分子量为5000g/mol的聚苯乙烯磺酸钠或硫酸 葡聚糖水溶液5-10重量份加入圆底烧瓶中，在搅拌速度500-1000rpm下，于温度25_30°C， 再将上述方法制得的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0. 001-0. 5重量份加入到瓶中；(2)待反应1-4小时后，将瓶中的溶液转移至离心管中，设定转速为2000-8000rpm，离 心5-20min，离心后的下层沉积物加入少量纯水分散，得到第一层包裹带有负电荷聚电解质 层的纳米复合粒子；(3)按上述方法制备同样浓度带有正电荷的分子量为5000g/mol的聚烯丙基胺盐酸盐 或壳聚糖聚电解质水溶液，并加入上述制备的第一层包裹带有负电荷聚电解质层的纳米粒 子，应用相同方法制得第二层包裹带有正电荷聚电解质层的纳米粒子，重复以上步骤制得 多层复合聚电解质修饰的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子。
6.一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特征在于该方法包 括以下步骤(1)将上述方法制得的改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子0.001-0. 5重量份加入到 5-50重量份纯水中，在搅拌下，将上述溶液加热到70-100°C ；(2)按氮元素与金或银元素的摩尔比0.5-5 1向上述反应液中加入四氯金酸或硝酸银；(3)在温度70-100°C下，反应l-20min后移除热源，将粗产物以转速1000-8000rpm离 心2-lOmin，收集沉淀并再次用纯水分散，制得以纳米金或纳米银粒子修饰的改性聚乙烯亚 胺构建的纳米复合粒子。
7.如权利要求1-6之一所述改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于纳米晶体为顺磁氧化铁纳米晶体Fe304、y -Fe2O3^ MnFe2O4或CoFe2O4，超顺磁纳米晶体 FePt ；金纳米晶体或银纳米晶体；量子点纳米晶体CdSe或CdZnS，具有壳层结构晶体CdSe/ ZnS或CdSe/CdS中的任一种。
8.如权利要求1-6之一所述改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备方法，其特 征在于改性聚乙烯亚胺为疏水基团接枝改性的支化聚乙烯亚胺或线性聚乙烯亚胺的一种， 其中支化聚乙烯亚胺或线性聚乙烯亚胺的分子量为600g/mOl、1800g/mOl、10000g/mOl或 25000g/mol中的任一种。
9.如权利要求1-6之一所述改性聚乙烯亚胺构建的纳米复合粒子的制备方法，其特征 在于改性聚乙烯亚胺中的疏水基团为C6-C18的饱和烷烃；胆固醇；胆酸；聚己内酯或聚乳酸 中的任一种。
全文摘要
本发明公开了一种改性聚乙烯亚胺构建的多功能纳米复合粒子的制备方法，其特点是将有机相合成的纳米晶体进行相转换，即从有机相转换到水相。但在相转换过程中，要求不能出现大量颗粒团聚，不会在纯水溶剂或缓冲水溶剂中造成沉淀。而且要根据不同的用途做到分散程度的可控性。相转换后的纳米粒子根据应用条件添加不同的表面基团进行修饰，以满足必要的功能和性质要求。纳米晶体通过改性聚乙烯亚胺的包裹，保持了原有纳米晶体物理特性的同时又在水相中具有良好分散性能。这种纳米复合粒子可携带疏水性的纳米晶体和疏水性药物应用于分子影像和药物递送，并且能够作为基因载体应用于基因转染；同时利用纳米复合粒子中聚乙烯亚胺上的氨基对水溶液中金离子或银离子还原，形成原位晶体生长，从而构建多功能分子显影探针。
文档编号C08L79/02GK101928458SQ20101021878
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者刘刚, 刘琛, 王志勇, 艾华, 苏红莹, 马娜 申请人:四川大学