棉花AVP1蛋白及其编码基因与应用的制造方法与工艺

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的AVP1蛋白，以及其在培育抗旱性、耐盐性提高的转基因植物中的应用。

背景技术：
干旱使得超过40％的地球陆地面积种植农作物受到限制，对全球农业生产和粮食供应也构成了严重的威胁，干旱是对农作物产量的主要环境限制条件之一。世界上盐碱土的面积很大，约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。在气候干燥的半干旱、干旱地区由于降雨量少、蒸发剧烈，盐分不断积累；海滨地区由于海水倒灌造成土壤含盐量增加。我国盐碱土主要分布于西北、华北、东北和滨海地区，随着大棚面积的逐年增长和栽培年代的推移，土壤盐渍化日趋严重。对绝大多数农作物来说，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为我国农业生产中十分重要的问题。采用传统的方法选育耐盐、抗旱的植物品种固然简便可行，但进展缓慢，局限性大。随着分子生物学技术的发展，一大批与植物耐盐、抗旱有关的基因相继得到克隆，植物转基因技术有了重大突破，这为有效利用旱地及盐碱地提高作物产量，治理盐渍化及荒漠化土地提供了新的思路和方法。植物的抗逆性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应,来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类:(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的基因及蛋白质。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得突破性的进展(ParkS.2005.Up-regulationofaH+-pyrophosphatase(H+-PPase)asastrategytoengineerdrought-resistantcropplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102:18830-18835；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell,15:63-78；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell,23:396–411)。通过生物技术手段，对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果,对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解。但就目前的研究状况而言,由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的机理还有待进一步研究。虽然许多研究机构通过现代生物技术，获得了各类具有一定耐盐、抗旱等抗逆能力的转基因植物，但还未达到产业化的标准。因此在提高植物抗逆性方面，还有许多工作需要做。

技术实现要素：
发明人从棉花中克隆AVP1基因，转化到烟草中，获得耐盐性、抗旱性提高的转基因烟草，在提高植物抗逆性研究领域具有明显的应用前景。本发明人利用SSH和RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个AVP1类蛋白的编码基因(本文命名为GhAVP1-2基因)的DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的耐盐性和抗旱性，而且这些性状可稳定遗传。本发明的第一方面提供棉花的一个AVP1类蛋白，其序列为SEQIDNo：1。本发明的第二方面提供编码本发明第一方面所述的蛋白的核苷酸序列。优选地，编码所述蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第二方面所述的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。在另一个实施方案中，所述表达载体为rd29A-GhAVP1-2-2300，如图2中所示。本发明的第四方面提供一种重组细胞，含有本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所述的重组表达载体。在一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本发明的第五方面提供一种改善植物耐盐性和/或抗旱性的方法，包括：将本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达。在一个实施方案中，所述植物是烟草。本发明的第六方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所述的重组表达载体的植物或植物组织。在一个实施方案中，所述植物是烟草。本发明的第七方面提供本发明第一方面所述的蛋白、本发明第二方面所述的核苷酸序列、本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性和/或抗旱性以及用于植物育种的用途。在一个实施方案中，所述植物是烟草。附图说明图1.植物表达载体rd29A-GhAVP1-2-2300构建流程(图1a-c)。图2.植物表达载体rd29A-GhAVP1-2-2300的质粒图谱。图3.转基因烟草和对照植物的抗旱性生长情况；左：转基因植株(T1N1-3)；右：对照烟草9。图4.转基因烟草和对照植物的耐盐性生长情况；左：转基因植株(T1N4-12)；右：对照烟草12。具体实施方式AVP1基因是液泡膜H+焦磷酸酶基因。实施例1、干旱胁迫下棉花SSH文库构建：具体方法为：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit所示的方法通过抑制消减杂交方法构建消减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶子的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗的叶子的mRNA作为对照(driver)。具体步骤简述如下：(1)供试材料：冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS培养基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。(2)材料处理：将供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光照培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组，25℃、光照培养，停止浇灌，处理10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子0.5g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)依照说明书提取棉花的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分离mRNA。(4)抑制消减杂交：为了增加获得EST(unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区，进行了如下抑制消减杂交。从前一步骤得到的mRNA根据Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit的说明获得cDNA。用RsaI(购自NewEnglandBiolabs)和HaeIII(购自NewEnglandBiolabs)分别对双链cDNA进行消化，做两组抑制消减杂交。第一组：对照组、干旱组获得的双链cDNA用RsaI酶切，然后进行抑制消减杂交；第二组：对照组、干旱组获得的双链cDNA用HaeIII酶切，然后进行抑制消减杂交。抑制消减杂交的其他步骤及方法严格按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit产品说明书中所示的方法进行，最后合并两组正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物。(5)cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定合并的正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物(QIAquickPCRPurificationKit纯化，购自Qiagen)与pGEM-TEasy(购自Promega试剂盒)载体连接，依照pGEM-TEasy试剂盒的产品说明书，具体步骤如下：用200ulPCR管依次加入下列成分：纯化cDNA片段的第二次PCR产物3ul，T4连接酶缓冲液5ul，pGEM-TEasy载体lul，T4DNA连接酶1ul，于4℃连接过夜。取10μL连接反应产物，加入到100μL感受态大肠杆菌JM109(购自TAKARA)中，冰浴30min、热休克60s、冰浴2min，另加250μLLB液体培养基(1％Tryptone购自OXOID，0.5％YeastExtract购自OXOID，1％NaCl购自国药)置37℃摇床中，225r/min摇菌30min，取200μL菌液种植于含50ug/mL氨苄青霉素、40ug/mLX-gal、24ug/mLIPTG(X-gal/IPTG购自TAKARA)的LB固体培养基(LB液体培养基中加入1.5％的琼脂)培养板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取360个白色菌落(编号：Gh-D001至Gh-D360)。将360个白色克隆挑于含有50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板(CORNING)中，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，于–80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer1(Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒自带)和Primer2R(Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增,得到292个阳性克隆,对所有阳性克隆在送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。(6)差异克隆的cDNA测序分析：将DNA测序结果去除载体和不明确序列及多余的cDNA后，共得到180个EST(unigene)。经BlastN发现其中102条unigene在GenBank中有同源序列(同源性50％以上)，33条EST功能未知或者为假定蛋白,另有45条未获得同源匹配,推测可能是处于3’、5’末端非翻译区的较短序列。实施例2、GhAVP1-2基因的克隆在上述有同源序列的unigene中，克隆子Gh-D156序列：SEQIDNo：3：序列分析(核酸序列在NCBIBlast)表明该序列的编码的氨基酸序列属于AVP1类蛋白，本文将克隆子Gh-D156对应的编码基因命名为GhAVP1-2基因。根据已经获得的GhAVP1-2基因片段，设计两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物：GhAVP1-2GSP1：SEQIDNo：4：ATGTTATATTTGGCCTTGCTTTGhAVP1-2GSP2：SEQIDNo：5：ACAAATCTGTGATCATCCCAATTT实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds试剂盒购自invitrogen公司)。用SEQIDNO:4与3’端引物AUAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：ExTaq购自TAKARA，50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlmRNA反转录的cDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:4和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min。所得的PCR产物用双馏水稀释100倍后取2.0μl作为模板，用SEQIDNO:5与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl第一轮稀释的PCR产物，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:5和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min。第二次PCR产物(QIAquickPCRPurificationKit纯化，购自Qiagen)3u1连接于pGEM-TEasyVector，转化到大肠杆菌JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQIDNO:5与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增(50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl菌液，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:5和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min),得到4个阳性克隆,送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序,获得该基因的cDNA的3’端。根据已经获得的GhAVP1-2基因片段，设计三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物：GhAVP1-2GSP4：SEQIDNo：6：TCACAAAGGCACCAAATAGAGCCGhAVP1-2GSP5：SEQIDNo：7：CAATGGCAAATCCCTTTCCAATGGhAVP1-2GSP6：SEQIDNo：8：TCCAGCATTGTCACTGATGGGACC实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds试剂盒，购自invitrogen公司)。SEQIDNo：6作为mRNA反转录成cDNA的引物。用SEQIDNO：7与5’通用引物AAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA(反转录引物SEQIDNO:6)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：ExTaq购自TAKARA，50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl总RNA反转录的cDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:7和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min。所得的PCR产物用双蒸水稀释100倍后取2.0μl作为模板，用SEQIDNO:8与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl第一轮稀释的PCR产物，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:8和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min。第二次PCR产物(QIAquickPCRPurificationKit纯化，购自Qiagen)3u1连接于pGEM-TEasyVector，转化到JM109(具体方法同上),随机挑取10个白色菌落于含有50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQIDNO:8与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增(50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl菌液，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:8和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min),得到4个阳性克隆,送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序,获得该基因的cDNA的5’端。所得的5’RACE产物克隆测序后，与3’RACE产物测序结果拼接。获得GhAVP1-2全长cDNA序列。根据GhAVP1-2全长cDNA序列设计一对引物如下：GhAVP1-2F：SEQIDNo：9：ATGGGGGCGGCGATGTTGTCGGAGGhAVP1-2R：SEQIDNo：10：CTAAAAGATCTTGAAGAGTAGACCACC通过SEQIDNo：9和SEQIDNo：10来克隆GhAVP1-2基因全长。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlPrimeSTAR，10μM的引物SEQIDNo：9和SEQIDNo：10各2.0μl，30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后；72℃延伸10min。PCR扩增产物加A。将上述PCR产物加2.5倍的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5ul10×ExBuffer，0.5ul5mM的dATP，2.5ul10×ExTaq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约2300bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，连接至pGEMT-easy载体(购自Promega试剂盒)，转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQIDNO:9与SEQIDNO:10进行菌液PCR扩增(采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶，菌液进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl菌液，1.0μlPrimeSTAR，10μM的引物SEQIDNo：9和SEQIDNo：10各2.0μl，30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后；72℃延伸10min。)得到3个阳性克隆,送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序,序列为SEQIDNO:2。其蛋白表达序列为SEQIDNO：1。GhAVP1-2的氨基酸序列：SEQIDNo：1GhAVP1-2编码基因的核苷酸序列：SEQIDNo：2实施例3GhAVP1-2基因植物表达载体构建植物表达载体rd29A-GhAVP1-2-2300构建流程如图1所示。选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子rd29A及Tnos作为GhAVP1-2基因的启动子和终止子。具体步骤简述如下：SEQIDNO:11和SEQIDNO:12以植物表达载体PBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO:11和SEQIDNO:12各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物通过EcoRI、BglII(购自NewEnglandBiolabs)酶切连接到pCAMBIA2300获得pCAMBIA2300-1，连接反应条件见promegaT4连接酶盒所示步骤。SEQIDNO:11：GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGATSEQIDNO:12：ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTGSEQIDNo：13和SEQIDNo：14以PBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物通过SacI、EcoRI(购自NewEnglandBiolabs)酶切连接到pCAMBIA2300-1获得pCAMBIA2300-2，连接反应条件是promegaT4连接酶试剂盒所示步骤。SEQIDNo：13：AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAASEQIDNo：14：TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTASEQIDNO:15和SEQIDNO:16以拟南芥(哥伦比亚型，购自www.arabidopsis.org)DNA为模板(参考ZengJ.,etL.2002,PreparationoftotalDNAfrom“recalcitrantplanttaxa”,ActaBot.Sin.,44(6):694-697中的方法提取拟南芥DNA)扩增拟南芥rd29A启动子。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO:15和SEQIDNO:16各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物通过HindIII、SalI(购自NewEnglandBiolabs)酶切连接到pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3，连接反应条件是promegaT4连接酶试剂盒所示步骤。SEQIDNo：15：ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTASEQIDNo：16：TGAgtcgacTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAGSEQIDNo：17和SEQIDNo：18扩增AVP1-2基因，(模板是实施例2所获得含有AVP1-2基因的pGEMT-easy重组载体)，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlAVP1-2-pGEM，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物通过SalI、SacI(购自NewEnglandBiolabs)酶切连接到pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体rd29A-GhAVP1-2-2300，连接反应条件是promegaT4连接酶试剂盒所示步骤。SEQIDNo：17：TGAGTCGACATGGGGGCGGCGATGTTGTCGGAGSEQIDNo：18：AAGGAGCTCCTAAAAGATCTTGAAGAGTAGACCACC实施例4rd29A-GhAVP1-2-2300表达载体转化农杆菌农杆菌LBA4404(购自BiovectorScienceLab,Inc)感受态细胞制备：提前1-2d将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基平板(LB液体培养基中加入1.5％的琼脂)上划单斑接种，28℃培养1至2d。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液(1:20的比例)接种于100ml同样浓度抗生素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量预冷10％甘油重悬浮菌体,4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用10％甘油重复洗3-4次；加入适量冰浴预冷的10％甘油重新悬浮细菌沉淀，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。转化农杆菌：在冰上融化上述农杆菌LBA4404感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl的实施例3制备的表达载体构建rd29A-GhAVP1-2-2300，混匀后冰浴约10min。将上述混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使混合物到达底部，注意不要有气泡。将电击杯(购自bio-rad，型号Micropulser)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm的电击杯，MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB液体培养基中。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将上述悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃，225rpm培养1h。取100-200μl的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)平板上，28℃培养。实施例5利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草用75％酒精浸泡烟草(国家烟草中期库，获取单位中国农科院烟草所，库编号I5A00660)种子30s，再用0.1％升汞浸泡8min，进行表面消毒。将消过毒的烟草种子置于MS固体培养基(18.78mMKNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mMNH4NO3，1.5mMMgSO4，3.0mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上无菌发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用实施例4中处于对数生长期的含表达载体的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS固体培养基)；并以未被农杆菌浸染的叶盘作为对照叶片。将农杆菌浸染的叶片转到分化培养基(MS固体培养基+1mg/LBA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS固体培养基+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基上。同时，将对照叶片转到分化培养基(MS固体培养基+1mg/LBA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS固体培养基+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基上。取农杆菌浸染的烟草小苗叶片，提取基因组DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)后，用引物SEQIDNo：17和SEQIDNo：18进行PCR鉴定(ExTaq购自TAKARA，50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNo：18各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min)，选取20株成功转化的转基因烟草编号成T0M1-T0M20。灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透，将上述培养T0M1-T0M20转基因烟草小苗和对照小苗移栽到所述蛭石上，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS。大约60天后获得种子。实施例6过表达GhAVP1-2转基因烟草T1代的抗旱模拟实验及功能鉴定灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。将T0代转基因烟草T0N1、T0N2、T0N3、T0N4和T0N5的种子以及对照烟草种子分别播种在蛭石上，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS，培养25天之后，摘取最下端一片叶子，提取基因组DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，利用引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18做PCR鉴定(ExTaq购自TAKARA，50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNo：18各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min)，剔除阴性植株(对照烟草也同样摘取一片叶子)。挑取大小一致的转基因烟草(T1N1、T1N2、T1N3、T1N4和T1N5各10株，编号分别是T1N1-1至T1N1-10、T1N2-1至T1N2-10、T1N3-1至T1N3-10、T1N4-1至T1N4-10和T1N5-1至T1N5-10)、对照烟草(10株，编号是对照1至对照10)做耐旱实验。转基因烟草、对照烟草干旱14天(不浇水)，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环。然后取出植株对植株进行称重。上述T1代转基因植株的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而转基因植株都能够正常生长，显示出明显的抗旱性(参见图3及表1)。在图3中，选取转基因植株T1N1-3和对照烟草9示例性显示，其他烟草的结果与它们类似。实施例7过表达GhAVP1-2转基因烟草T1代的抗盐模拟实验及功能鉴定灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。将T0代转基因烟草T0N1、T0N2、T0N3、T0N4和T0N5的种子以及对照烟草种子分别播种在蛭石上，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS，培养25天之后，摘取最下端一片叶子，提取基因组DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，利用引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18做PCR鉴定(ExTaq购自TAKARA，50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNo：18各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环；72℃延伸10min)，剔除阴性植株(对照烟草也同样摘取一片叶子)。挑取大小一致的转基因烟草(T1N1、T1N2、T1N3、T1N4和T1N5各10株，编号分别是T1N1-11至T1N1-20、T1N2-11至T1N2-20、T1N3-11至T1N3-20、T1N4-11至T1N4-20和T1N5-11至T1N5-20)、对照烟草(10株，编号是对照11至对照20)做耐盐实验，浇灌100mMNaCl，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，14天后观察结果：T1代转基因植株的耐盐性鉴定表明，对照植株都不能正常生长，生长明显受到抑制，而转基因植株生长都明显高于对照植株，显现出明显的耐盐性(参见图4及表1)。在图4中，选取转基因植株T1N4-12和对照烟草12示例性显示，其他烟草的结果与它们类似。