一种Bt蛋白及其编码基因和应用的制造方法与工艺

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Bt蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：
水稻螟虫等鳞翅目害虫是水稻丰产稳产的重要制约因素之一。迄今为止，尚未发现任何对稻螟虫等鳞翅目害虫具有抗性的稻种资源。过去，对稻螟虫的防治主要以喷施化学农药为主，但大量的农药残毒不仅造成严重的环境污染，而且也使稻米的卫生品质下降，影响人们的身体健康。作为水稻生产大国，鳞翅目害虫每年给我国水稻生产造成了巨大损失。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)在其产胞过程中产生的一种晶体蛋白质，具有对鳞翅目昆虫专一性的毒杀作用。80年代，第一个编码Bt蛋白的基因被克隆，Bt蛋白对靶标害虫具有高效的和专一的杀虫活性，易于在环境中降解，且无任何残留，这些优点都是普通化学杀虫剂所无法比拟的。在长达逾百年的生产应用过程中，从未曾观察到Bt蛋白对环境及非靶标昆虫或哺乳类和鸟类动物等具有不良的影响或毒害作用。将来源于细菌的Bt基因经过人工改造，导入植物，可以使植物自身产生Bt蛋白，从而对鳞翅目昆虫具有抗性。近年来，通过转Bt基因培育转基因抗虫作物，已经在烟草、番茄、棉花、马铃薯、玉米、水稻和油菜等作物上获得成功。转Bt基因棉花和玉米等先后在美国、加拿大、阿根廷、巴西和印度等国家大面积推广应用，都取得了保产增收作用。2009年，全球转Bt基因抗虫作物的种植面积超过3800万公顷；中国的Bt棉种植面积也达到380万公顷，约占全国总种植面积的66％，减少化学农药用量约80余万吨，减量达70－80％，为棉农增产增收累计超过300亿元。2009年11月，农业部批准了转Bt基因抗虫水稻华恢1号以及用华恢1号为恢复系配制的杂交组合Bt汕优63的生物安全证书(农基安证字(2009)第072号：转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号在湖北省生产应用的安全证书)，从而使我国转基因水稻的商业应用迈开了令世界注目的第一步。修改Bt基因的编码序列，是进一步提高其在植物中应用价值的重要途径。迄今为止，已经公开许多经过人工改造的可用于植物的Bt蛋白基因。公开号为CN1083884C的中国专利文献公开了两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用，通过双链合成DNA的方法，人工合成了全长1824bp的Gry1Ab和Gry1Ac融合的GFM杀虫基因，结果Bt蛋白在植物中的表达量大幅度提高，全合成基因比原基因的表达提高了近百倍。范云六等在研制成功了苏云金杆菌(Bt)δ-内毒素cry1Ab/Ac杂种蛋白序列(以下简称wBt)，并于1996年提供给本申请人在水稻中使用，获得了表达wBt杂种蛋白的抗虫转化体(TuJ.，etal1998)。但现有Bt蛋白的杀虫活性仍有待进一步提高。

技术实现要素：
本发明提供了一种Bt蛋白，该Bt蛋白对鳞翅目昆虫的抗性比现有Bt蛋白更强。一种Bt蛋白，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明还提供了所述Bt蛋白的编码基因，碱基序列如SEQIDNo.2所示。本发明的Bt蛋白(mBt蛋白)及其编码基因是在wBt杂种蛋白(氨基酸序列如SEQIDNo.3所示)及其编码基因(碱基序列如SEQIDNo.4所示)的基础上进行改造而获得的。其改造程序为：(1)在wBt杂种蛋白第3、4位氨基酸残基之间插入一段多肽，该多肽的氨基酸序列为NPNINECI，对mBt蛋白的空间结构具有稳定作用；在wBt杂种蛋白第3、4位氨基酸残基之间插入该多肽，能够引起wBt杂种蛋白空间构型的改变，从而使获得的mBt蛋白的空间结构更为稳定；(2)对wBt杂种蛋白第97、480、521位氨基酸残基进行氨基酸替换型修饰(第97位的D替换为Q，第480位的R替换为K，第521位的N替换为H)，这几个氨基酸对wBt杂种蛋白的杀虫活性和专一性起关键作用，进行氨基酸替换型修饰后，mBt蛋白的杀虫活性和专一性得到进一步提高；(3)根据植物基因表达的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，对步骤(2)获得的编码序列进行密码子优化；(4)密码子优化完成后，在mBt蛋白编码序列的5’端添加植物核糖体结合序列AACA，以增强其表达活性。由此获得的mBt基因与wBt基因的碱基序列一致性为96.7％，mBt蛋白与wBt蛋白的氨基酸序列一致性为98.2％。本发明还提供了含有所述编码基因的表达单元、重组载体、转化子，所述重组载体的原始载体为pSB130-Actin::Tnos。本发明还提供了所述Bt蛋白在提高植物抗虫性能中的应用。作为优选，所述植物为水稻。与转wBt基因水稻，将本发明Bt蛋白的编码基因(mBt基因)转化水稻获得的转mBt基因水稻，其mBt基因的表达活性比wBt基因强约20～50％；对鳞翅目昆虫稻纵卷叶螟和二化螟的抗性也大大提高，主要表现在：稻纵卷叶螟能在转wBt基因水稻的叶片上形成一定的枯黄危害症状，而在转mBt基因水稻的叶片上则不形成或仅在剪口附近形成极小的枯黄危害症状；在转wBt基因水稻上，二化螟危害引起的白穗率为1.1±0.1％，而在转mBt基因水稻上，白穗率均为0。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的mBt基因在水稻中的表达活性明显增强，转mBt基因水稻对鳞翅目昆虫的抗性也大大提高，能够有效防治鳞翅目昆虫，保证水稻丰产稳产。附图说明图1为重组载体pSBmBt的质粒图谱；...