抗EpCAM抗体和使用方法与流程

本申请要求2013年10月2日提交的美国临时申请号61/885,817和2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,805的优先权，这些临时申请中的每一者特此以全文引用的方式并入。技术实现要素：本公开涉及潜在地缺乏T细胞表位并且引出降低的免疫反应的抗体和免疫偶联物。在一个实施方案中，抗体可以包含具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗体可以是抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、非免疫球蛋白支架、多聚体，以及其任何组合。在另一个实施方案中，抗体可以结合至抗原上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在额外实施方案中，组合物可以包括本文所描述的抗体和医药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂或稳定剂。在另一个实施方案中，免疫偶联物可以包含附接至效应分子的抗体(或其片段)，其中这种抗体可以具有：具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在其它实施方案中，效应分子可以是放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素(lectin)、毒素、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。在另一个实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可以包括施用治疗有效量的包含附接至效应分子的抗体的免疫偶联物，其中这种抗体包含具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，效应分子可以是放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素、毒素、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。在某些实施方案中，这种方法可以进一步包括检测受试者中的免疫偶联物或使其成像。在其它实施方案中，这种方法可以进一步包括从经过检测或成像的受试者中去除癌组织。在另一个实施方案中，提供了一种诊断、检测或监控受试者的癌症的方法，其可以包括使从所述受试者获取的测试样品与抗体接触以形成抗体-抗原复合物，其中这种抗体包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11的重链氨基酸序列，以及具有选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；测量测试样品中抗体-抗原复合物的量；以及使结果针对对照标准化。在另一个实施方案中，诊断、检测或监控受试者的癌症的方法可以涉及向受试者施用包含以下的抗体：具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及检测受试者中的抗体。在另一个实施方案中，用于诊断、检测或监控癌症的试剂盒可以包括具有以下的抗体：选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重链氨基酸序列，以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及其使用的说明书。在另一个实施方案中，使受试者的肿瘤成像的方法可以涉及向受试者施用包含以下的抗体：具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及通过体内成像检测抗体。附图说明图1是本发明的一个实施方案，特别是脱免疫VB5-845Fab片段(VB5-845-DI)以及VB5-845非脱免疫Fab片段(VB5-845-WT)的示意图。图2示出了使用iTopeTM对序列VH-WT(VH-野生型)的分析。含有潜在免疫原性肽的区域在“混杂高等”和“混杂中等”行中指示。图3示出了使用iTopeTM对序列VH-DI(VH-脱免疫)的分析。含有潜在免疫原性肽的区域在“混杂高等”和“混杂中等”行中指示。图4示出了使用iTopeTM对序列VL-WT(VL-野生型)的分析。含有潜在免疫原性肽的区域在“混杂高等”和“混杂中等”行中指示。图5示出了使用iTopeTM对序列VL-DI(VL-脱免疫)的分析。含有潜在免疫原性肽的区域在“混杂高等”和“混杂中等”行中指示。图6示出了使用iTopeTM对跨越单个氨基酸变化的序列VL-DI和VL-DIF(VL-DI加上额外的C端)的分析。图7展示了如通过流式细胞术测量，VB5-845-DI和VB5-845-WT对EpCAM阳性Cal-27和EpCAM阴性A-375的结合特异性。图8示出了VB5-845-DI对EpCAM阳性H&N鳞状细胞癌细胞系Cal27的剂量依赖性结合。通过流式细胞术，结合表示为中值荧光超过PBS对照的平均倍数增加。图9示出了如通过流式细胞术测量，VB5-845-WT和VB5-845-DI对Cal-27细胞的结合亲和力。图10示出了通过流式细胞术，VB5-845变体与VB6-845之间的竞争试验。图11描绘了VB5-845-DI的核苷酸和氨基酸序列。图12示出了使用Kabat编号，VB5-845-WT和VB5-845-DI的VH和VL域的比对。图13公开了使用VB5-845-Algo(开放圆圈)的VB6-845竞争试验。黑色圆圈和黑色三角形分别对应于VB5-845-WT和VB4-845。图14示出了VB5-845-Algo血清稳定性的西方墨点分析。分道1至4对应于0、3、6以及24小时的VB5-845-WT。分道5至8对应于0、3、6以及24小时的VB5-845-Algo。分道9是仅人类血清。L：梯并且C：对照。图15示出了VB5-845-WT(灰色)和VB5-845-Algo(黑色)的热稳定性，表示为0小时的一式两份平均值％。图16示出了如通过CD3+CD4+T细胞试验的增殖测量，VB5-845-Algo的免疫原性型态。图17示出了使用Kabat编号，VB5-845-WT和VB5-845Algo的VH和VL域的比对。具体实施方式本发明不限于所描述的特定工艺、组合物或方法，因为这些可能有变化。描述中所用的术语仅仅是出于描述特定型式或实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围。除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域的一般技术人员通常所理解的相同的含义。本文中无一事物被理解为承认本发明无权先于现有发明的公开内容。除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一种(a/an)”和“这种”包括复数种提及物。因此，举例来说，提及一种“抗氧化剂”是提及本领域的技术人员所知的一种或多种抗氧化剂和其等效物，等等。术语“约”意指加上或减去与其一起使用的数字的数值的10％。因此，约50％意指在45％至55％的范围内。如本文所用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包括(但不限于)人类和非人类脊椎动物，诸如野生、家养以及农场动物。可以使用的“抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、多聚体和其任何组合，以及来自重组来源和/或在转基因动物中产生的片段。抗体或片段可以来自任何物种，包括小鼠、大鼠、兔、仓鼠以及人类。嵌合抗体衍生物，即，组合非人类动物可变区与人类恒定区的抗体分子，也涵盖于本发明的范围内。嵌合抗体分子可以包括例如人源化抗体，其包含来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合域，以及人类恒定区。常规方法可以用于制造嵌合抗体。预期嵌合抗体将在人类受试者中比对应的非嵌合抗体免疫原性更小。人源化抗体可以例如如WO00/61635中所描述进一步稳定化并且以全文引用的方式并入。“抗癌剂”指的是有效治疗或预防癌症的化合物或治疗，包括(但不限于)化学剂、其它免疫治疗剂、癌症疫苗、抗血管生成化合物、某些细胞因子、某些激素、基因疗法、放射疗法、手术以及饮食疗法。“脱免疫”指的是当与野生型配对物相比时缺乏免疫反应或引出降低的免疫反应的分子。“脱免疫抗体”或“脱免疫抗体片段”指的是当与野生型配对物相比时缺乏一个或多个T细胞表位并且引出降低的免疫反应的抗体和抗体片段。“脱免疫VB5-845”指的是EpCAM抗体的Fab片段，其当与非脱免疫Fab片段VB5-845(VB5-845-WT)相比时VH域和VL域上的假定T细胞表位发生突变并且可能会引出降低的免疫反应。脱免疫VB5-845Fab片段(VB5-845-DI)包含脱免疫VH-CH域(SEQIDNO:1)和脱免疫VL-CL域(SEQIDNO:2)。非脱免疫VB5-845Fab片段(VB5-845-WT)包含野生型VH-CH域(SEQIDNO:5)和野生型VL-CL域(SEQIDNO:6)。“有效量”或“治疗有效量”意指在达成所需结果所必需的剂量和时段下有效的量。免疫偶联物的有效量可以根据以下因素而变化：诸如动物的疾病病况、年龄、性别、体重。可以调整给药方案以提供最佳治疗反应。举例来说，可以每天施用几个分次剂量，或可以如治疗情况的紧急性所指示按比例地降低剂量。“人源化抗体或抗体片段”意指抗体或片段包含人类构架区。“免疫偶联物”指的是偶联至效应分子的抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体可以是全长抗体或抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、多聚体和其任何组合，以及来自重组来源和/或在转基因动物中产生的片段。在一些实施方案中，抗体可以是合成蛋白质、结合蛋白质、或多肽。在一些实施方案中，效应分子可以是毒素、放射性核苷酸、放射性药物、标记剂、药物、细胞毒性剂、肽、蛋白质等等。这些效应分子可能能够当抗体结合至抗原时杀死、溶解或标记或诱导其它效应。如本文所用的“减少的引出免疫反应的倾向”意指修饰的EpCAM抗体或抗体片段比非修饰的EpCAM抗体免疫原性更小。“免疫反应”包括细胞与体液免疫反应。术语“直接施用于癌症部位”指的是直接或实质上直接引入，包括(但不限于)将免疫偶联物直接单次或多次注射至肿瘤中或肿瘤周围，连续或不连续灌注至肿瘤中或肿瘤周围，将贮库引入肿瘤中或肿瘤周围，将缓释器具引入肿瘤中或肿瘤周围，将缓释配方引入肿瘤中或肿瘤周围，直接施加至肿瘤上，直接注射至实质上直接供给肿瘤区域的动脉中，直接注射至实质上引流入肿瘤区域中的淋巴管中，直接或实质上直接引入实质上封闭腔(例如，胸膜腔)或管腔(例如，囊内)中。“肿瘤周围”是描述在被视作肿瘤边界的，诸如(但不限于)可触摸肿瘤边缘的约10cm内、优选地5cm内、更优选地1cm内的区域的术语。“直接施用”在预防发生或预防复发的情形中定义为直接施用于处于癌症发展或复发的风险下的部位中。“医药学上可接受”指的是由联邦或州政府的管理机构的一般临床使用和/或批准，在美国药典(UnitedStatesPharmacopoeia)中的清单，或由相关领域的技术人员的普遍接受。对于抗体结合的“生理状态”反映但不一定精确地复制EpCAM结合多肽将在体内遭遇EpCAM分子的状态。在生理状态下的结合应合理地预测在体内将发生的结合。“预防癌症”指的是预防癌症发生。在某些情况下，预防性治疗减少癌症复发。在其它情况下，预防性治疗降低患者发展癌症的风险，或抑制癌前病况(例如，结肠息肉)进展至实际的恶性病。“降低的剂量”指的是低于通常施用和/或推荐的剂量的剂量。通常施用的抗癌剂剂量可以在本领域中熟知的参考材料中找到，例如，最新版的医师案头参考(Physician'sDeskReference)。“治疗癌症”指的是抑制癌细胞复制、细胞凋亡、抑制癌症扩散(转移)、抑制肿瘤生长、减少癌细胞数目或肿瘤生长、降低癌症的恶性度(例如，增加的分化)、或改善癌症相关症状。“治疗剂”意指用于阻碍、对抗、减轻、预防或改善患者的不当病状、疾病或症状的药剂。“变体”指的是本文所描述的免疫偶联物、抗体或抗体片段、毒素(例如，假单胞菌毒素)或效应分子的任何医药学上可接受的衍生物、类似物或片段。变体还涵盖多聚体的一种或多种组分、包含个别组分的多聚体、包含多重个别组分的多聚体(例如，参考分子的多聚体)、化学分解产物以及生物分解产物。在特定的非限制性实施方案中，免疫偶联物相对于参考免疫偶联物由于参考免疫偶联物的EpCAM结合部分和/或毒素部分的变化而可以是“变体”。举例来说，变体免疫偶联物可以含有抗体部分和/或毒素部分的多聚体。在用于测量参考毒素制剂的毒性的标准试验中，分子的毒素部分的变体保留至少10％、至少30％、至少50％、至少80％、至少90％的毒性。在一些实施方案中，变体还可以指的是与本发明的免疫偶联物具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或95％序列一致性的多肽。在一些实施方案中，变体抗体可以指的是具有本发明的抗体的至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或95％序列一致性的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，变体抗体或免疫偶联物可以指的是当通过竞争结合试验测量时具有本发明的抗体的至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或95％结合亲和力的多肽或蛋白质。具有参考免疫偶联物的EpCAM结合部分的变化的变体免疫偶联物在生理状态下与抗EpCAM参考抗体的结合竞争至少10％并且优选地至少30％(并且参看下文)。竞争10％意指在饱和浓度的抗EpCAM参考抗体结合至EpCAM的试验中，当用当量浓度的变体抗EpCAM免疫偶联物达到平衡时10％的这些结合的参考抗体移位。作为一个非限制性实例，在抗体之间或在抗体与免疫偶联物之间的竞争通过以下方式测量：使标记的抗EpCAM参考抗体结合至细胞表面上的EpCAM或结合至涂布EpCAM的固体衬底以使得几乎所有的EpCAM位点被抗体结合，使这些抗体-抗原复合物与未标记的测试抗EpCAM抗体或未标记的测试免疫偶联物接触，以及测量从EpCAM结合位点移位的标记抗体的量，其中自由的标记抗体的量指示已经发生的竞争的量。“VB5-845”指的是在没有毒素偶联物的情况下EpCAM抗体的Fab片段。“VB6-845”指的是在遗传学上连接至修饰的三角梅蛋白(脱三角梅蛋白(deBouganin))毒素的EpCAM抗体的Fab片段。“4D5MOC-B”或“4D5”意指如以全文引用的方式并入本文中的WO00/61635中所描述嫁接至scFv4D5的人工人类共同构架上的人源化scFvMOC31抗体。4D5MOC-B由SEQIDNO:8表示。“MOC-31抗体”意指鼠类抗EpCAM或抗EGP-2抗体并且可获自商业来源，诸如BioGenex的目录号MU316-UC、ZymedLaboratoriesInc.的目录号18-0270、或UnitedStatesBiological的目录号M4165。免疫疗法已经成为对抗癌症的强有力的工具。针对肿瘤相关抗原(“TAA”)的鼠类和人源化/嵌合抗体以及其相应的抗体片段已经用于某些人类癌症的诊断和疗法。未偶联、毒素偶联以及放射性标记形式的这些抗体已经用于这类疗法中。对于免疫疗法所关注的一个肿瘤相关抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)，也称为17-1A、KSA、EGP-2以及GA733-2。EpCAM是跨膜蛋白质，其在包括肺癌、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌以及头颈鳞状细胞癌的许多实体肿瘤中高度表达，但在大多数正常上皮组织中弱表达。其表达与细胞增殖速率相关联。EpCAM特异性抗体已经用于使患有小细胞肺癌和非小细胞肺癌的患者的原发性肿瘤和转移成像并检测其。存在治疗性蛋白质的功效由于对治疗性蛋白质的不当免疫反应而受限的许多情况。若干小鼠单克隆抗体已经显示出在许多人类疾病配置中作为疗法的前景，但在某些情况下由于诱导显著程度的人类抗鼠类抗体(HAMA)反应而失败。对于单克隆抗体，已经开发许多技术来试图降低HAMA反应。这些重组DNA方法一般已经减少最终抗体构建体中的小鼠遗传信息，同时增加最终构建体中的人类遗传信息。尽管如此，所得“人源化”抗体在若干种情况下仍然在患者中引出免疫反应。诱导免疫反应的关键是在蛋白质内可以经由在MHCII类分子，所谓的“T细胞表位”上呈现而刺激T细胞活性的肽的存在。这类T细胞表位通常定义为具有结合至MHCII类分子的能力的任何氨基酸残基序列。隐含地，“T细胞表位”意指当结合至MHC分子时可以由T细胞受体(TCR)识别，并且可以至少原则上通过啮合TCR以促进T细胞反应而引起这些T细胞的活化的表位。因此，需要鉴别T细胞表位并从抗体和抗体片段去除T细胞表位并且开发引出降低的免疫反应的更佳抗体/抗体片段。抗体本文公开了结合至癌细胞抗原的脱免疫抗体和脱免疫抗体片段。在一些实施方案中，抗原可以是EpCAM。在一些实施方案中，抗体可以具有：具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。抗体可以是全长抗体或抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、多聚体，以及其任何组合。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，轻链和重链片段的序列可以经过修饰或用其它氨基酸置换以使得抗体在人类中引出降低的免疫反应。为了制造人源化抗体或抗体片段，可以使用本领域中已知的任何方法。举例来说，可以通过筛选人类抗体文库来获得人类抗体片段。另一种解决方案是通过将CDR区嫁接至人类构架上来移植非人类单克隆抗体的特异性。在所述技术的改善中，可以通过并入来源于所述非人类抗体的额外残基来产生具有改善的结合行为的人源化抗体或抗体片段。除了达成人源化以外，可以通过将具有所需结合亲和力和特异性的scFv片段的CDR嫁接至不同的表现更好的scFv的构架上来使用“修复”具有次最佳稳定性和/或折叠或产率的抗体片段的技术。制造人源化抗体或抗体片段的这类方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如在SCID小鼠中产生和体外免疫。在一些实施方案中，抗体片段可以是Fab，并且轻链和重链由共价键连接。在一些实施方案中，共价键联可以是二硫键。在一些实施方案中，共价键联可以经由化学交联剂，诸如二甲基己二亚酰胺化物、二甲基辛二亚酰胺化物等等。在一些实施方案中，可以使用氨基酸交联剂，诸如(Gly4-Ser)n。本文所描述的轻链和重链的序列可以用于得到scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体等等。可以使用各种蛋白质连接策略来产生二价或双特异性Fab和scFv，以及双功能Fab和scFv融合物。本文所描述的抗体片段可以在大肠杆菌中以生物功能形式克隆和表达。还可以通过重组DNA技术使用细菌或哺乳动物细胞产生抗体和抗体片段。在一些实施方案中，可以使用亲和力成熟工艺，借此可以修饰本文所描述的抗体的结合特异性、亲和力或亲合性。已经设计出许多实验室技术，借此通过在整个抗体片段上或在诸如CDR的所选区域上应用各种突变策略来形成氨基酸序列多样性。在一些实施方案中，重链和轻链的变体氨基酸序列分别与SEQIDNO:1和2具有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、最优选地至少80％、甚至更优选地至少90％并且甚至最优选地95％的序列一致性。在其它实施方案中，重链和轻链的变体氨基酸序列分别与SEQIDNO:11和12具有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、最优选地至少80％、甚至更优选地至少90％并且甚至最优选地95％的序列一致性。免疫偶联物在一些实施方案中，提供了免疫偶联物。在一些实施方案中，本文所公开的免疫偶联物可以是附接至效应分子的抗体，其中这种抗体包含具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗体可以是抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、多聚体，以及其任何组合。抗体或抗体片段可以是本文所公开的脱免疫抗体或脱免疫抗体片段中的任一者。在一些实施方案中，免疫偶联物中的抗体可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，免疫偶联物中的抗体可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，免疫偶联物中的抗体可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，免疫偶联物中的抗体可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在本文所描述的实施方案中，效应分子可以是放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素、毒素、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。在一些实施方案中，效应分子可以是毒素，诸如相思豆毒素(abrin)、蒴莲根毒素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、白树毒素(gelonin)、三角梅蛋白(bouganin)、修饰或脱免疫的三角梅蛋白(脱三角梅蛋白)、皂素(saporin)、蓖麻毒素(ricin)、蓖麻毒素A链、异株泻根毒蛋白(bryodin)、丝瓜籽蛋白(luffin)、苦瓜蛋白(momordin)、局限曲菌素(restrictocin)、假单胞菌外毒素A(PseudomonasexotoxinA)、百日咳毒素、破伤风毒素、肉毒杆菌毒素(botulinumtoxin)、志贺毒素(Shigellatoxin)、霍乱毒素、白喉毒素，以及其任何组合。在实施方案中，毒素可以是如SEQIDNO:4、SEQIDNO:9、SEQIDNO:33、SEQIDNO:42或SEQIDNO:43所示的脱三角梅蛋白。在实施方案中，毒素可以是如SEQIDNO:3所示的假单胞菌外毒素A。在其它非限制性实施方案中，毒素包含用来破坏DNA的药剂。因此，毒素可以是(但不限于)烯二炔(例如，卡奇霉素(calicheamicin)和埃斯培拉霉素(esperamicin))和非烯二炔小分子药剂(例如，博莱霉素(bleomycin)、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。根据本发明适用的其它毒素包括(但不限于)道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、偏端霉素A(distamycinA)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、海鞘素(ecteinascidin)、多卡霉素(duocarmycin)/CC-1065、以及博莱霉素/培洛霉素(pepleomycin)。在其它非限制性实施方案中，毒素包含用来破坏微管蛋白的药剂。这类毒素可以包括(但不限于)根霉素(rhizoxin)/美登素(maytansine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、阿里他汀(auristatin)、海兔毒素10(dolastatin10)、培洛斯德A(pelorusideA)、烷化剂、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶I抑制剂、以及喜树碱(camptothecin)衍生物。在其它非限制性实施方案中，免疫偶联物的毒素部分可以是烷化剂，包括(但不限于)白消安(busulfan)、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯脲霉素(chlorozotocin)、顺铂、克罗米松(clomesone)、氰基吗啉代阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)、环迪松(cyclodisone)、二脱水半乳糖醇(dianhydrogalactitol)、氟多潘(fluorodopan)、亥舒凡(hepsulfam)、海蒽酮(hycanthone)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C、米托唑酰胺(mitozolamide)、氮芥、哌嗪、哌嗪二酮、哌酰溴烷(pipobroman)、泊非霉素(porfiromycin)、螺旋乙内酰脲芥(spirohydantoinmustard)、替罗昔隆(teroxirone)、四铂(tetraplatin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)，等等。在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫偶联物的毒素部分可以是抗有丝分裂剂，包括(但不限于)别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素B(halichondrinB)、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、美登素、根霉素、紫杉醇(taxol)、紫杉醇衍生物、硫代秋水仙碱(thiocolchicine)、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱(vinblastinesulfate)以及硫酸长春新碱(vincristinesulfate)。在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫偶联物的毒素部分可以包含拓扑异构酶II抑制剂，包括(但不限于)阿霉素、氨萘非特(amonafide)、蒽吡唑(anthrapyrazole)衍生物、吡唑并吖啶、盐酸比生群(bisantreneHCl)、道诺霉素、脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美诺立尔(menogaril)、N,N-二苯甲基柔红霉素(daunomycin)、奥克赛唑(oxanthrazole)以及正定苯酰肼(rubidazone)。在其它非限制性实施方案中，免疫偶联物的毒素部分可以是RNA或DNA抗代谢物，包括(但不限于)5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶、阿西维辛(acivicin)、氨基蝶呤(aminopterin)、氨基蝶呤衍生物、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氨蝶呤衍生物、N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸、吡唑霉素(pyrazofurin)、三甲曲沙(trimetrexate)、2'-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、环胞苷、胍唑(guanazole)、羟基脲、肌苷二醛(inosineglycodialdehyde)、马克霉素II(macbecinII)、吡唑并咪唑、硫鸟嘌呤以及硫嘌呤。在一些实施方案中，免疫偶联物是结合至连接假单胞菌外毒素A的人类EpCAM的胞外域的人源化抗体片段。特别地，免疫偶联物可以是已经融合至截短形式的假单胞菌外毒素A(ETA252-608氨基酸)的EpCAM抗体的重组稳定化和人源化Fab片段，如SEQIDNO:3所示。这种免疫偶联物可以结合至在癌细胞上表达的EpCAM。一旦结合，免疫偶联物被内化并且假单胞菌外毒素A杀死细胞或阻断蛋白质合成，从而导致细胞死亡。重要的是，因为大多数正常粘膜细胞和成纤维细胞并不广泛表达EpCAM并且因此无法内化免疫偶联物，所以保护这些细胞免受外毒素的潜在副作用。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是附接至假单胞菌外毒素A的Fab。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链，并且假单胞菌外毒素A(ETA252-608氨基酸)融合至SEQIDNO:1的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链，并且假单胞菌外毒素A(ETA252-608氨基酸)融合至SEQIDNO:2的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且假单胞菌外毒素A(ETA252-608氨基酸)融合至SEQIDNO:11的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且假单胞菌外毒素A(ETA252-608氨基酸)融合至SEQIDNO:12的C端。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是附接至修饰的三角梅蛋白的人源化EpCAM抗体片段，其中这种修饰的三角梅蛋白具有减少的引出免疫反应的倾向。在一个优选的实施方案中，修饰的三角梅蛋白具有减少的活化T细胞的倾向并且修饰的三角梅蛋白在T细胞表位中的一个或多个氨基酸残基处被修饰。在一些实施方案中，修饰的三角梅蛋白(脱三角梅蛋白)具有如SEQIDNO:4所示的氨基酸。在一些实施方案中，修饰的三角梅蛋白可以具有如SEQIDNO:9所示的氨基酸。在一些实施方案中，修饰的三角梅蛋白可以具有如SEQIDNO:33所示的氨基酸。在一些实施方案中，修饰的三角梅蛋白可以具有如SEQIDNO:42所示的氨基酸。在一些实施方案中，修饰的三角梅蛋白可以具有如SEQIDNO:43所示的氨基酸。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是附接至修饰的三角梅蛋白的Fab。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:1的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:2的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:11的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:12的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:31的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:12的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:32的C端。在一些实施方案中，Fab可以具有：具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链，并且修饰的三角梅蛋白融合至SEQIDNO:12的C端。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:13所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。第一和第二多肽可以由一个或多个二硫键联连接。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:16所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:14所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:17所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:34所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:35所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:36所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:37所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:38所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:40所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:39所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:41所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:44所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:44所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:45所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:46所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:46所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有选自SEQIDNO:1、11、31或32的第一多肽和如SEQIDNO:47所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:48所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:48所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:49所示的第一多肽和如SEQIDNO:2所示的第二多肽的VB6-845Fab。在一些实施方案中，免疫偶联物可以是具有如SEQIDNO:49所示的第一多肽和如SEQIDNO:12所示的第二多肽的VB6-845Fab。在上述免疫偶联物中本文所公开的第一和第二多肽可以由一个或多个二硫键联连接。本文所描述的抗体或抗体片段可以通过任何方式偶联至效应分子。举例来说，抗体或抗体片段可以通过化学或重组方式附接至毒素。制备融合物或偶联物的化学方式在本领域中是已知的并且可以用于制备免疫偶联物。用于偶联抗体或抗体片段和毒素的方法必须能够连接抗体与毒素而不会干扰抗体或抗体片段结合至标靶分子的能力。在一个实施方案中，抗体和毒素都是蛋白质并且可以使用本领域中熟知的技术偶联。存在本领域中所公开的数百种交联剂，其可以偶联两种蛋白质。交联剂一般基于在抗体或毒素上可用或插入的反应官能团来选择。另外，如果不存在反应基团，那么可以使用光可活化交联剂。在某些情况下，可能需要在抗体与毒素之间包括间隔子。本领域中已知的交联剂包括同型双功能剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物和双(重氮基联苯胺)，以及异型双功能剂：间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺。可以用于使效应分子偶合至抗体片段的其它交联剂包括TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼)和TPMPH(S-(2-硫代吡啶基)巯基-丙酰肼)。TPCH和TPMPH在先前已经通过温和高碘酸盐处理而氧化的糖蛋白的碳水化合物部分反应，由此在交联剂的酰肼部分与高碘酸盐产生的醛之间形成腙键。异型双功能交联剂GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺)和SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷)与伯胺反应，由此将马来酰亚胺基引入组分上。这个马来酰亚胺基随后可以与另一种组分上的可以由先前提及的交联剂引入的硫氢基反应，由此在组分之间形成稳定的硫醚键。如果组分之间的位阻干扰任一种组分的活性，那么可以使用交联剂，其将长的间隔臂引入组分之间并且包括衍生物，诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n-琥珀酰亚胺酯(SPDP)。因此，存在许多适合的交联剂，其可以被使用并且各自取决于其对最佳免疫偶联物产量的影响来选择。还可以使用重组DNA技术制备抗体-效应分子融合蛋白质。在这样的情况下，使编码抗体的DNA序列融合至编码效应分子(诸如毒素)的DNA序列，得到嵌合DNA分子。将嵌合DNA序列转移至表达抗体-效应分子融合蛋白质的宿主细胞中。可以从细胞培养物中回收融合蛋白质并且使用本领域中已知的技术纯化。免疫偶联物的抗体部分可以源自免疫球蛋白，即，可以追溯至作为免疫球蛋白(或抗体)的起始分子。举例来说，可以通过使用本领域中已知的标准技术修饰免疫球蛋白支架来产生抗体。在另一个非限制性实例中，免疫球蛋白域(例如，可变重链和/或轻链)可以连接至非免疫球蛋白支架。此外，可以通过(但不限于)化学反应或遗传设计来开发抗体。因此，在一个非限制性实例中，免疫偶联物可以包含特异性地结合至肝癌细胞的源自免疫球蛋白的多肽(例如，选自抗体文库的抗体)或其变体；以及毒素或其变体。举例来说，可以重新设计这类免疫球蛋白多肽以影响其对标靶肿瘤相关分子的结合特征，或改善其物理特征。免疫偶联物的抗体部分不需要基于免疫球蛋白。因此，免疫偶联物可以包含特异性地结合至肝癌细胞的非免疫球蛋白多肽(例如，)或其变体；以及毒素或其变体。可以设计这种非免疫球蛋白多肽以结合至标靶肿瘤相关分子。此外，可以将非免疫球蛋白多肽工程改造至所需的亲和力或亲合性并且可以进行设计以耐受多种物理状态，包括极端pH范围和相对高的温度。确实，对于在医药组合物中使用，在生理状态下(例如，37℃、在肽酶存在下)具有相对长的半衰期的非免疫球蛋白多肽的设计可能是有利的。此外，这类分子或其变体可以展示良好的溶解度、小尺寸、适当的折叠并且可以在易得到的低成本细菌系统中表达，并且由此以商业上合理的量制造。设计非免疫球蛋白多肽的能力在一般技术人员的技能范围内。表位结合多肽的实例包括(但不限于)包含III型纤连蛋白(fibronectintypeIII)域的配体、基于包含普列克底物同源(Pleckstrin-Homology，PH)域的重复蛋白域的组装的结合分子、锚蛋白重复(ankyrinrepeat)，等等。在其它非限制性实施方案中，免疫偶联物包含具有与如SEQIDNO:3所示的假单胞菌外毒素A至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的氨基酸序列的变体。在其它实施方案中，免疫偶联物包含具有与如SEQIDNO:4所示的三角梅蛋白至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的氨基酸序列的变体。使用方法本文公开了使用本文所描述的抗体、抗体片段以及免疫偶联物的方法。在前述实施方案中的每一者中，所使用的抗体、抗体片段和/或免疫偶联物可以包括本文所公开的脱免疫抗体/抗体片段中的任一者，其中这种抗体/抗体片段包含具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可以涉及施用治疗有效量的抗体，其中这种抗体包含具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链；以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链。抗体可以是抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、多聚体，以及其任何组合。抗体或抗体片段可以是本文所公开的脱免疫抗体或脱免疫抗体片段中的任一者。在一些实施方案中，抗体进一步包含附接至抗体的效应分子(总体地，免疫偶联物)。在本文所描述的一些实施方案中，效应分子可以是放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素、毒素、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。在一些实施方案中，抗体和免疫偶联物可以用于治疗癌症，诸如肺癌、胃癌、肾癌、甲状腺癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、肝细胞癌、食管癌、胰腺癌以及前列腺癌。起源于任何上皮细胞的癌症也可以由这些免疫偶联物和抗体靶向。在优选的非限制性实施方案中，癌症可受到将抗体或免疫偶联物直接施用于癌症部位的治疗。举例来说，标靶肿瘤团块可以接近于皮肤的表面。在另一个实例中，患病组织可以被囊肿包封，或在实质上封闭腔，包括(但不限于)管腔中发现。在其它实施方案中，癌症可受到静脉内施用抗体或免疫偶联物的治疗。在一些实施方案中，用于诊断癌症的试剂盒可以包括具有以下的抗体或其片段：SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重链氨基酸序列，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及其使用的说明书。在一些实施方案中，用于诊断癌症的试剂盒可以包括免疫偶联物，其中所述免疫偶联物包含附接至效应分子的具有以下的抗体或其片段：SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重链氨基酸序列，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及其使用的说明书。抗体或抗体片段可以是本文所公开的脱免疫抗体或脱免疫抗体片段中的任一者。在一些实施方案中，用于检测癌症的试剂盒可以包括抗EpCAM抗体片段，并且优选地进一步包括含有标记的抗Ig抗体，例如与酶(诸如碱性磷酸酶)连接的抗Ig抗体或放射性标记的抗Ig抗体的试剂。在一些实施方案中，抗EpCAM抗体片段可以附接至发色团、荧光团或放射性标记的配体。本文所公开的免疫偶联物和抗体还可以用于在受试者中进行检测或监控。在一些实施方案中，检测或监控受试者的癌症的方法可以涉及使从受试者获取的测试样品与抗体接触以形成抗体-抗原复合物，其中这种抗体包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重链氨基酸序列，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；测量测试样品中抗体-抗原复合物的量；以及使结果针对对照标准化。测试样品可以是血清、淋巴、腹水渗出物、细胞间流体、组织裂解物、唾液、组织切片、细胞、活检样品等等。抗体-抗原复合物可以通过任何方式检测，诸如圆点墨点法、西方墨点法、ELISA方法或夹心ELISA方法。而且，抗体-抗原复合物可以通过根据多级反应使用来检测，诸如与生物素结合的抗Ig抗体反应并且然后与抗生物素蛋白结合的物质反应。在其它实施方案中，检测或监控受试者的癌症的方法可以涉及使从受试者获取的测试样品与免疫偶联物接触以形成复合物，其中这种免疫偶联物包含具有以下的抗体：SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重链氨基酸序列，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；测量测试样品中复合物的量；以及使结果针对对照标准化。在另一个实施方案中，检测或监控受试者的癌症的方法可以涉及向受试者施用包含以下的抗体：具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及检测这种抗体。在另一个实施方案中，检测或监控受试者的癌症的方法可以涉及向受试者施用包含具有以下的抗体的免疫偶联物：具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及检测这种免疫偶联物。在一些实施方案中，本文所公开的抗体和免疫偶联物可以用于使受试者的肿瘤成像。在一些实施方案中，使受试者的肿瘤成像的方法可以涉及向受试者施用包含以下的抗体或抗体片段：具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及通过体内成像检测这种抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可以是本文所公开的脱免疫抗体或脱免疫抗体片段中的任一者并且可以附接至效应分子。在一些实施方案中，使受试者的肿瘤成像的方法可以涉及向受试者施用包含具有以下的抗体的免疫偶联物：具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:11、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的氨基酸序列的重链，以及具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链；以及通过体内成像检测这种免疫偶联物。免疫偶联物可以进一步包括效应分子。在一些实施方案中，用于检测癌症或使肿瘤成像的效应分子可以是放射性同位素、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。体内成像可以通过本领域中的任何已知技术来进行，诸如近红外荧光成像(NIRF)、荧光反射成像(FRI)、荧光介导的断层摄影(FMT)、正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、磁共振成像(MRI)、PET联合计算机断层摄影成像(PET/CT)、PET联合磁共振成像(PET/MRI)，以及其任何组合。在一些实施方案中，方法可以进一步包括在受试者的体内成像之后切除癌组织，诸如肿瘤或一部分器官。手术切除可以通过本领域中已知的任何技术来进行。在一些实施方案中，方法可以进一步包括在切除之后施用抗体或免疫偶联物以测量肿瘤切除的完全性。在某些实施方案中，如本文所描述的抗体用放射性示踪物标记。放射性示踪物通常是含有放射性同位素的物质，这使得容易检测和测量。许多不同形式的氢、碳、磷、硫以及碘通常用于医学诊断中。本发明的抗体可以用任何适合的放射性示踪物标记。优选的放射性示踪物包括用于医学成像的放射性示踪物。所使用的常见放射性示踪物包括18F、67Ga、81mKr、82Rb、99mTc、mIn、123I、131I、133Xe、201T1以及90Y。优选地，如本文所描述的抗体用18F、123/131I、mIn、90Y或99mTc标记。本发明的抗体还可以用本领域中已知的任何荧光探针标记。非限制性实例包括荧光素、氨基香豆素乙酸、四甲基罗丹明异氰酸酯(tetramethylchodomineisocyanate)、德克萨斯红(TexasRed)、Cy3.0、Cy5.0、绿色荧光蛋白，等等。在另一个优选的实施方案中，如本文所描述的抗体用对比剂标记。对比剂是用于增加或改变人体或动物体中的器官、流体或解剖结构的对比度的物质。本发明的抗体可以用任何适合的对比剂标记。优选的对比剂包括用于医学成像的对比剂。优选地，本发明的抗体用MRI(磁共振成像)对比剂标记，诸如超顺磁性对比剂或顺磁性对比剂。MRI对比剂通常是螯合金属或胶体。最常使用的对比剂包括基于钆(Gd)的对比剂，诸如钆-DTPA；基于氧化铁的对比剂，诸如超顺磁性氧化铁小粒子(SPIO)和超顺磁性氧化铁超小粒子(USPIO)；以及基于螯合锰的顺磁性对比剂，诸如Mn-DPDP。本发明还提供了降低术后并发症的风险的方法，其包括在手术并且在特定非限制性实施方案中是用以治疗癌症的手术之前、期间或之后施用有效量的免疫偶联物。本发明还提供了预防癌症发生、预防或延迟癌症复发、或降低癌症的复发率的方法，其包括向有需要的患者直接施用有效量的免疫偶联物。本发明还提供了使肿瘤或癌症对一种或多种其它抗癌剂敏感的方法，其包括施用本发明的免疫偶联物。在一个非限制性实施方案中，其它抗癌剂包含另一种靶向EpCAM的免疫偶联物。在另一个非限制性实施方案中，其它抗癌剂抗癌剂包含放射线。其它抗癌剂可以在施用免疫偶联物之前、与其叠加、同时和/或之后施用。当同时施用时，免疫偶联物和其它抗癌剂可以在单一配方中或在独立配方中施用，并且如果独立的话，那么任选地通过不同施用途径施用。因此，一种或多种免疫偶联物和一种或多种其它抗癌剂的组合可以协同作用以对抗肿瘤或癌症。在一些实施方案中，免疫偶联物可以与一种或多种抗癌剂共同施用、同时施用或依序施用。在一些实施方案中，抗癌剂可以是他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、吲哚昔芬(iodoxyfene)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、阿那曲唑(anasfrozole)、来曲唑(letrazole)、硼唑(borazole)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸环丙孕酮(cyproteroneacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(luprolide)、非那雄胺(finasteride)、赫赛汀(herceptin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿霉素、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、依达比星(idarubicin)、丝裂霉素C、放线菌素D(dactinomycin)、光辉霉素(mithramycin)、顺铂、卡铂(carboplatin)、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(busulphan)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、亚硝基脲、噻替派(thiotephan)、长春新碱、紫杉醇、泰索帝(taxotere)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、伊立替康(Irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、埃博霉素(epothilone)、易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva)、索拉非尼(Sorafenib)、血管生成抑制剂、EGF抑制剂、VEGF抑制剂、CDK抑制剂、细胞因子、Her1和Her2抑制剂、以及单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供了治疗癌症的方法，其包括施用免疫偶联物与放射线疗法方案的组合。疗法还可以包含手术和/或化学疗法。举例来说，免疫偶联物可以与放射线疗法和顺铂(Platinol)、氟尿嘧啶(5-FU，Adrucil)、卡铂(Paraplatin)和/或太平洋紫杉醇(Taxol)组合施用。使用免疫偶联物的治疗可以允许根据较低剂量的放射线和/或较少频率的放射线治疗使用，这可以例如降低严重咽喉痛的发生率，这种咽喉痛阻碍吞咽功能，潜在地引起不合需要的重量损失或脱水。用于组合疗法的医药组合物还可以包括(但不限于)抗生素(例如，放线菌素D、博莱霉素、光辉霉素、蒽霉素(anthramycin))、天冬酰胺酶、BCG蛋白质、白喉毒素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、抗有丝分裂剂、相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、神经生长因子、血小板源性生长因子、组织纤溶酶原活化剂、抗组胺剂、抗恶心剂，等等。确实，将有效量的免疫偶联物直接施用于需要这种治疗的患者可以使得降低剂量的另一种抗癌剂具有临床上显著的功效。在不施用免疫偶联物的情况下可能观测不到降低剂量的其它抗癌剂的这种功效。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，其包括施用降低剂量的一种或多种其它抗癌剂。此外，包含免疫偶联物的组合疗法用于需要这种治疗的患者当与标准治疗方案的持续时间或周期数相比时可以允许相对短的治疗时间。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，其包括历时相对短的持续时间和/或在较少的治疗周期中施用一种或多种其它抗癌剂。因此，根据本发明，包含免疫偶联物和另一种抗癌剂的组合疗法可以降低整体癌症治疗的毒性(即，副作用)。举例来说，当递送降低剂量的免疫偶联物和/或其它抗癌剂时，和/或当减少周期的持续时间(即，单一施用的时段或一系列的这类施用的时段)时，和/或当减少周期数时，可以观测到当与单一疗法或另一种组合疗法相比时降低的毒性。使用本发明的抗体或免疫偶联物的癌症治疗的临床结果可易于由相关领域的技术人员，诸如医师辨别。举例来说，用以测量癌症的临床标志物的标准医学测试可以是治疗功效的强有力的指示。这类测试可以包括(但不限于)身体检查、机能量表、疾病标志物、12导联ECG、肿瘤测量、组织活检、细胞检查、细胞学、肿瘤计算的最常直径、放射线摄影、肿瘤的数位成像、生命征象、重量、不良事件的记录、感染发作的评估、合并用药的评估、疼痛评估、血液或血清化学、检测血清标志物、尿分析、CT扫描以及药物动力学分析。此外，包含免疫偶联物和另一种抗癌剂的组合疗法的协同效应可以通过与经历单一疗法的患者的比较研究来确定。在周期期间将要施用的抗体或免疫偶联物的有效剂量根据施用模式而变化。直接施用(例如，瘤内注射)与全身静脉内施用免疫偶联物相比需要小得多的免疫偶联物全身剂量。熟练的技术人员将显而易见，局部施用可以得到较低的身体剂量，并且在那些情况下，将预期并需要所得低循环血浆水平的免疫偶联物。在一个实施方案中，直接施用抗体或免疫偶联物的有效剂量可以在约10至3000、20至900、30至800、40至700、50至600、60至500、70至400、80至300、90至200、或100至150微克/肿瘤/天的范围内。在其它实施方案中，剂量可以在约10至20、21至40、41至80、81至100、101至130、131至150、151至200、201至280、281至350、351至500、501至1000、1001至2000、或2001至3000微克/肿瘤/天的范围内。在特定实施方案中，剂量可以为至少约20、40、80、130、200、280、400、500、750、1000、2000或3000微克/肿瘤/天。在其它实施方案中，抗体或免疫偶联物施用是以约0.01毫克/公斤/剂至约2000毫克/公斤/剂的剂量。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物的有效剂量可以在约100至5000、200至4000、300至3000、400至2000、500至1000、600至900、或700至1500微克/肿瘤/月的范围内。在其它实施方案中，剂量可以在约100至199、200至399、400至649、650至999、1000至1799、1800至2499、2500至3499、3500至4999、5000至7499、7500至10000、或10001至20000微克/肿瘤/月的范围内。在特定实施方案中，剂量可以为至少约100、200、400、650、1000、1400、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、7500、10000或20000微克/肿瘤/月。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物以等效于或低于在安全性检验中所确立的最大耐受剂量的每周期总剂量瘤内施用，但剂量相对于肿瘤体积进行校准。举例来说，受试者将接受介于每cm31微克与每cm3肿瘤500微克之间或足以达到大约介于每cm3肿瘤组织14皮摩尔与7纳摩尔之间的剂量。剂量将以不超过肿瘤体积的约20-50％的体积施用。免疫偶联物将在适合的盐溶液中稀释。举例来说，对于3cm3的估算体积的肿瘤、14皮摩尔(每cm31微克)的目标剂量、以及肿瘤的约1/3的最大注射相对体积，将3微克免疫偶联物稀释至约1ml稀释剂中。在周期期间将要与抗体或免疫偶联物一起施用的另一种抗癌剂的有效剂量也根据施用模式而变化。一种或多种抗癌剂可以瘤内或通过其它施用模式递送。通常，化学治疗剂全身施用。标准剂量和治疗方案在本领域中是已知的(参看例如最新版的默克索引(MerckIndex)和医师案头参考)。举例来说，在一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期200至4000mg/m2的范围内的达卡巴嗪(dacarbazine)。在一个优选的实施方案中，剂量在每周期700至1000mg/m2的范围内。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期25至50mg/m2的范围内的氟达拉滨(fludarabine)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期200至2000mg/m2的范围内的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期1.5至7.5mg/kg的范围内的多烯紫杉醇(docetaxel)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至15mg/kg的范围内的太平洋紫杉醇。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至20mg/kg的范围内的顺铂。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至20mg/kg的范围内的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期2至8mg/kg的范围内的阿霉素。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期40至160mg/kg的范围内的表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期50至200mg/kg的范围内的环磷酰胺。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期50至75、75至100、100至125、或125至150mg/m2的范围内的伊立替康。在另一个实施方案中，抗癌剂包含剂量在约每周期3.7至5.4、5.5至7.4、7.5至11、或11至18.5mg/m2的范围内的长春碱。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.7至1.4或1.5至2mg/m2的范围内的长春新碱。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期3.3至5、5至10、10至100、或100至1000mg/m2的范围内的甲氨蝶呤。使用抗体或免疫偶联物的组合疗法可以使癌症或肿瘤对施用额外的抗癌剂敏感。因此，本发明涵盖用于预防、治疗癌症和/或预防癌症复发的组合疗法，其包括在降低剂量的抗癌剂之前、之后或同时施用有效量的抗体或免疫偶联物。举例来说，使用免疫偶联物的初始治疗可以增加癌症或肿瘤对使用一定剂量的抗癌剂的后续攻击的敏感性。这种剂量接近或低于当单独施用抗癌剂时或在不存在抗体或免疫偶联物的情况下的标准剂量的低范围。当同时施用时，抗体或免疫偶联物可以与抗癌剂独立地施用，并且任选地经由不同施用途径。因此，在一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至10、11至20、21至40、或41至75mg/m2的范围内的顺铂，例如PLATINOL或PLATINOL-AQ(BristolMyers)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期2至3、4至8、9至16、17至35、或36至75mg/m2的范围内的卡铂，例如PARAPLATIN(BristolMyers)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.25至0.5、0.6至0.9、1至2、3至5、6至10、11至20、或21至40mg/kg的范围内的环磷酰胺，例如CYTOXAN(BristolMyersSquibb)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.5至1、2至4、5至10、11至25、26至50、或51至100mg/m2的范围内的阿糖胞苷，例如CYTOSAR-U(Pharmacia&Upjohn)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至50mg/m2的范围内的阿糖胞苷脂质体，例如DEPOCYT(ChironCorp.)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期15至250mg/m2的范围内或在约每周期0.2至2mg/kg的范围内的达卡巴嗪，例如DTIC或DTICDOME(BayerCorp.)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.1至0.2、0.3至0.4、0.5至0.8、或0.9至1.5mg/m2的范围内的拓扑替康，例如HYCAMTIN(SmithKlineBeecham)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期5至9、10至25、或26至50mg/m2的范围内的伊立替康，例如CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期2.5至5、6至10、11至15、或16至25mg/m2的范围内的氟达拉滨，例如FLUDARA(BerlexLaboratories)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期200至2000mg/m2、每周期300至1000mg/m2、每周期400至800mg/m2、或每周期500至700mg/m2的范围内的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期6至10、11至30、或31至60mg/m2的范围内的多烯紫杉醇，例如TAXOTERE(RhonePoulencRorer)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期10至20、21至40、41至70、或71至135mg/kg的范围内的太平洋紫杉醇，例如TAXOL(BristolMyersSquibb)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.5至5mg/kg、每周期1至4mg/kg、或每周期2-3mg/kg的范围内的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期2至4、5至8、9至15、16至30、或31至60mg/kg的范围内的阿霉素，例如ADRIAMYCIN(Pharmacia&Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(BristolMyersSquibb)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期3.5至7、8至15、16至25、或26至50mg/m2的范围内的依托泊苷，例如VEPESID(Pharmacia&Upjohn)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.3至0.5、0.6至0.9、1至2、或3至3.6mg/m2的范围内的长春碱，例如VELBAN(EliLilly)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mg/m2的范围内的长春新碱，例如ONCOVIN(EliLilly)。在另一个实施方案中，额外的抗癌剂包含剂量在约每周期0.2至0.9、1至5、6至10、或11至20mg/m2的范围内的甲氨蝶呤。在另一个实施方案中，免疫偶联物与至少一种其它免疫治疗剂组合施用，免疫治疗剂包括(但不限于)美罗华(rituxan)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗1(campath-1)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)以及曲妥珠单抗(trastuzutmab)。在另一个实施方案中，免疫偶联物与一种或多种抗血管生成剂组合施用，抗血管生成剂包括(但不限于)血管抑素(angiostatin)、沙利度胺(thalidomide)、圈形区5(kringle5)、内皮抑素(endostatin)、Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、抗凝血酶、纤连蛋白的29kDaN端和40kDaC端蛋白水解片段、催乳素(prolactin)的16kDa蛋白水解片段、血小板因子4的7.8kDa蛋白水解片段、对应于血小板因子4的片段的13氨基酸肽、对应于胶原蛋白I的片段的14氨基酸肽、对应于血小板反应蛋白I(thrombospondinI)的片段的19氨基酸肽、对应于SPARC的片段的20氨基酸肽，以及其变体，包括其医药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物与一种或多种细胞因子组合施用，细胞因子包括(但不限于)淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括(但不限于)白介素1、白介素2、白介素6、白介素12、白介素15、白介素18)，以及其变体，包括其医药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物与癌症疫苗组合施用，癌症疫苗包括(但不限于)自体细胞或组织、非自体细胞或组织、癌胚抗原、α-胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑素细胞世系蛋白以及突变的肿瘤特异性抗原。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物与激素疗法联合施用。激素治疗剂包括(但不限于)激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate，LUPRON))以及类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)、视黄素(retinoid)、倍他米松(betamethasone)、皮质醇(cortisol)、可的松(cortisone)、强的松(prednisone)、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)。在另一个实施方案中，抗体或免疫偶联物与基因疗法程序联合施用以治疗或预防癌症。在另一个实施方案中，靶向EpCAM的抗体或免疫偶联物与增加所关注的肿瘤细胞中EpCAM的表达的一种或多种药剂组合施用。优选地增加EpCAM表达以使得更多数目的EpCAM分子在肿瘤细胞表面上表达。举例来说，这种药剂可以抑制EpCAM抗原胞吞的正常周期。这种组合治疗可以改善单独的或与其它抗癌剂或放射线疗法一起的靶向EpCAM的免疫偶联物的临床功效。在特定的非限制性实施方案中，增加肿瘤细胞中的EpCAM表达的药剂是酒石酸长春瑞滨(vinorelbinetartrate，Navelbine)和/或太平洋紫杉醇(Taxol)。因此，组合疗法可以增加癌症或肿瘤对所施用的免疫偶联物和/或额外抗癌剂的敏感性。以这种方式，更短的治疗周期可以成为可能，从而减少毒性事件。因此，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括历时短的治疗周期向有需要的患者施用有效量的免疫偶联物和至少一种其它抗癌剂。周期持续时间可以在约1至30、2至27、3至15、4至12、5至9、或6至8天的范围内。周期持续时间可以根据使用中的特定抗癌剂而变化。本发明还涵盖连续或不连续施用，或分成几次部分施用的日剂量。特定抗癌剂的适当周期持续时间将为熟练的技术人员所了解，并且本发明涵盖用于每种抗癌剂的最佳治疗时程的连续评估。熟练的技术人员的具体指南在本领域中是已知的。或者，可能需要更长的治疗周期。因此，周期持续时间可以在约10至56、12至48、14至28、16至24、或18至20天的范围内。周期持续时间可以根据使用中的特定抗癌剂而变化。施用途径本文所描述的抗体和/或免疫偶联物可以经由任何适合的途径施用于患者。抗体和/或免疫偶联物可以通过注射至血管系统中或通过注射至器官中而施用。优选的施用途径包括肠道外、血管内和/或静脉内注射。肠道外施用包括皮下、肌肉内、腹膜内、腔内、鞘内、瘤内、经皮以及静脉内注射。在一个优选的实施方案中，抗体和/或免疫偶联物作为大丸药静脉内施用，或通过经一段时间连续输注而施用。在其它实施方案中，抗体和/或免疫偶联物可以直接施用于癌症部位。本发明的免疫偶联物和抗体可以按常规方式通过其具活性的任何途径施用。施用可以是全身的、肠道外、局部或经口。举例来说，施用可以是(但不限于)肠道外、经口、经颊或经眼途径，或阴道内，通过吸入，通过积存注射，或通过植入。因此，本发明的抗体/免疫偶联物(单独的或与其它医药品一起)的施用途径可以是(但不限于)舌下、可注射剂(包括皮下或肌肉内注射的短效、积存、植入以及团粒形式)，或通过根据阴道乳膏、栓剂、子宫托、阴道环、直肠栓剂、宫内节育器以及经皮形式(诸如贴片和乳膏)使用。根据本发明的一个方面，通过直接施用将抗体或免疫偶联物和/或其它抗癌剂递送至患者。因此，免疫偶联物和/或其它抗癌剂可以不受限制地通过一次或多次直接注射至肿瘤中，通过连续或不连续灌注至肿瘤中，通过引入免疫偶联物的贮库，通过将缓释器具引入肿瘤中，通过将缓释配方引入肿瘤中，和/或通过直接施加至肿瘤上来施用。通过施用于肿瘤中的模式，还涵盖将免疫偶联物和/或其它抗癌剂引入肿瘤的区域，或引入实质上直接流至肿瘤的区域中的血管或淋巴管中。在每种情况下，医药组合物以至少足以达到终点的量施用，并且必要时包含医药学上可接受的载剂。预期抗体或免疫偶联物可以瘤内施用，而任何其它抗癌剂可以通过其它施用模式(例如，静脉内)递送至患者。另外，在多种抗癌剂意图递送至患者的情况下，免疫偶联物和一种或多种其它抗癌剂可以瘤内递送，而其它抗癌剂可以通过其它施用途径(例如，静脉内和经口)递送。在一些实施方案中，组合物可以是本文所描述的抗体和医药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂或稳定剂。在一些实施方案中，组合物可以是本文所描述的免疫偶联物和医药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂或稳定剂。根据本发明的免疫偶联物可以包含于医药组合物或药物中。适于直接施用的医药组合物包括(但不限于)冻干粉末或水性或非水性无菌可注射溶液或悬浮液，其可以进一步含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及促使组合物实质上与预定接受者的血液等张的溶质。可以存在于这类组合物中的其它组分包括例如水、醇、多元醇、甘油以及植物油。临时注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒以及片剂制备。免疫偶联物可以例如(但不限于)作为冻干粉末供应，其在施用于患者之前用无菌水或盐水复原。本发明的医药组合物可以包含医药学上可接受的载剂。适合的医药学上可接受的载剂包括基本上化学惰性和无毒的组合物，其不会干扰医药组合物的生物活性的有效性。适合的医药载剂的实例包括(但不限于)水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、氯化N-(l(2,3-二油烯基氧基)丙基)N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)以及脂质体。这类组合物应含有治疗有效量的化合物，连同适量的载剂一起以提供直接施用于患者的形式。在另一个实施方案中，医药组合物包含抗体或免疫偶联物和一种或多种额外的抗癌剂，任选地在医药学上可接受的载剂中。组合物可以呈医药学上可接受的盐形式，其包括(但不限于)与游离氨基形成的那些，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的那些；以及与游离羧基形成的那些，诸如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的那些。在本发明的各种实施方案中，医药组合物通过例如在手术期间局部输注、局部施加(例如，在手术之后结合伤口敷料)、注射、导管的方式、栓剂的方式或植入物的方式直接施用于肿瘤的区域。植入物可以是多孔、无孔或凝胶状物质，包括膜，诸如硅橡胶膜，或纤维。栓剂一般含有在0.5％至10％(以重量计)的范围内的活性成分。在其它实施方案中，控制释放系统可以置于标靶肿瘤附近。举例来说，微量泵可以将控制的剂量直接递送至肿瘤的区域中，从而精细地调节医药组合物的时序和浓度。在一些实施方案中，医药载剂可以包括(但不限于)粘合剂、包衣、崩解剂、填充剂、稀释剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、共轭亚油酸(CLA)、明胶、蜂蜡、纯水、甘油、任何类型的油，包括(但不限于)鱼油或大豆油，等等。抗体/免疫偶联物的医药组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载剂或赋形剂。这类载剂或赋形剂的实例包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶，以及聚合物，诸如聚乙二醇。对于经口施用，免疫偶联物和抗体可以容易地通过组合这些免疫偶联物/抗体与本领域中熟知的医药学上可接受的载剂来配制。这类载剂能够使本发明的免疫偶联物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等等，用于由所治疗的患者经口摄入。用于经口使用的医药制剂可以通过以下方式获得：添加固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，以及需要时在添加适合的助剂之后加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。适合的赋形剂包括(但不限于)填充剂，诸如糖，包括(但不限于)乳糖、蔗糖、甘露糖醇以及山梨糖醇；纤维素制剂，诸如(但不限于)玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以添加崩解剂，诸如(但不限于)交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。糖衣丸核心可以具备适合的包衣。出于这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸包衣中以供鉴别或用以表征抗体/免疫偶联物剂量的不同组合。可以经口使用的医药制剂包括(但不限于)由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以含有与以下混合的活性成分：填充剂，诸如乳糖；粘合剂，诸如淀粉；和/或润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁；以及任选地，稳定剂。在软胶囊中，免疫偶联物/抗体可以溶解或悬浮于适合的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于经口施用的所有配方应在适合于这种施用的剂量中。对于经颊施用，组合物可以采用例如以常规方式配制的片剂或含片的形式。对于通过吸入施用，根据本发明使用的组合物便利地以气雾剂喷雾呈现形式从加压包装或喷雾器，通过使用适合的推进剂递送，这种推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒，其含有免疫偶联物/抗体和适合的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本发明的组合物还可以配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，其含有例如常规的栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯。除了先前所描述的配方以外，本发明的组合物还可以配制成积存制剂。这类长效配方可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射而施用。积存注射可以按约1个至约6个月或更长的时间间隔施用。因此，举例来说，免疫偶联物/抗体可以与适合的聚合或疏水物质(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐配制。在经皮施用中，举例来说，本发明的组合物可以施加至膏药，或可以由经皮治疗系统施加，由此供应给生物体。本发明的组合物还可以与其它活性成分，诸如佐剂、蛋白酶抑制剂或其它相容性药物或化合物组合施用，其中可见这种组合在达成本文所描述的方法的所需作用方面是合乎需要的或有利的。在一些实施方案中，崩解剂组分包含以下一者或多者：交联羧甲基纤维素钠(croscarmellosesodium)、羧甲基纤维素钙(carmellosecalcium)、交联聚维酮(crospovidone)、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、离子交换系统、基于食用酸和碱性碳酸盐组分的泡腾系统、粘土、滑石、淀粉、预胶凝化淀粉、羟基乙酸淀粉钠、纤维素絮、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸钙、金属碳酸盐、碳酸氢钠、柠檬酸钙或磷酸钙。在一些实施方案中，稀释剂组分包含以下一者或多者：甘露糖醇、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、山梨糖醇、木糖醇、粉末状纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、淀粉、羟基乙酸淀粉钠、预胶凝化淀粉、磷酸钙、金属碳酸盐、金属氧化物或金属铝硅酸盐。在一些实施方案中，任选的润滑剂组分当存在时包含以下一者或多者：硬脂酸、金属硬脂酸盐、硬脂酰富马酸钠、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、山嵛酸甘油酯、矿物油、植物油、石蜡、亮氨酸、二氧化硅、硅酸、滑石、丙二醇脂肪酸酯、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇、聚丙二醇、聚烷二醇、聚氧乙烯-甘油脂肪酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙氧基化植物油或氯化钠。实施例实施例1：将T细胞表位定位于EpCAM抗体片段的VH和VL域上的方法.非脱免疫EpCAM抗体片段(Fab)VB5-845-WT的VH-CH和VL-CL域的序列由SEQIDNO:5和6表示，并且也已经在美国专利号7,339,031中公开，这个专利以引用的方式并入本文中。用跨越针对34个MHCII类等位基因中的每一者测试的蛋白质的重叠9聚体进行使用iTopeTM对序列的分析。基于与MHCII类分子的潜在‘配合’和相互作用对每个9聚体进行评分。由软件计算的肽得分处于0与1之间。突出强调产生高的平均结合得分(在iTopeTM评分函数中>0.55)的肽。如果>＝50％的MHCII类结合肽(即，34个等位基因中的17个)具有高结合亲和力(得分>0.6)，那么这类肽定义为“混杂高等亲和力”MHCII类结合肽。以>0.55的得分结合>＝50％的等位基因的MHCII类结合肽定义为“混杂中等亲和力”。序列还用于通过BLAST搜索查询TCEDTM以鉴别与先前所鉴别的T细胞表位的任何高序列同源性。非脱免疫VH-CH域指定为野生型(WT)VH-CH(SEQIDNO:5)，并且脱免疫VH-CH域指定为脱免疫(DI)VH-CH(SEQIDNO:1)。类似地，非脱免疫VL-CL域指定为野生型(WT)VL-CL(SEQIDNO:6)，并且脱免疫VL-CL域指定为脱免疫(DI)VL-CL(SEQIDNO:2)。仅可变域-VH-WT、VH-DI、VL-WT以及VL-DI的肽的分析示于图2至6中。表1示出了产生VH-DI所需的突变氨基酸。表2示出了产生VL-DI所需的突变酸。表1表2测试其它突变，但未列于上表中，因为其未能表达或在结合研究中失败。实施例2：制备脱免疫VB5-845虽然使用分子VB5-845硅片内评估Fab突变，但使用单独的脱免疫Fab以及含有融合至轻链的C端上的脱三角梅蛋白毒素有效负荷的脱免疫Fab片段的融合蛋白质完成生物表征。脱三角梅蛋白毒素有效负荷(SEQIDNO:4)用作流式细胞术研究的标签并且作为诱导上清液的ELISA定量的捕获步骤。通过剪接重叠延伸(SpliceOverlappingExtension)PCR方法SOE-PCR，使用对应的引物产生突变的845VH和VL片段。将每个VH和VL片段克隆至pCR2.1载体中并且转化至10F大肠杆菌细胞中用于测序。用对VH或VL具特异性的一组鉴别的限制酶消化含有正确插入物的pCR2.1质粒。用限制酶EcoRI和SacII消化VH片段，并且与SacII-CH-VL-CL-de-Boug-XhoI片段一起接合至用EcoRI和XhoI预消化的pING3302载体中。用接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。将用限制酶SalI和BsmI消化的VL片段与用相同限制酶预消化的VB6-845/pSP73质粒接合。将接合反应物转化至10F大肠杆菌细胞中，并且在氨苄青霉素(ampicillin)选择之后，从生长过夜的集落中提取VB6-845/pSV73质粒。用ScaI、EcoRI以及XhoI限制酶的组合获得VB6-845插入物，并且接合至用EcoRI和XhoI限制酶预消化的pING3302载体中。然后用VB6-845/3302接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。为了组合突变链，分别用EcoRI-SacII和SacII-XhoI消化VH和VL片段，并且在先前用EcoRI和XhoI消化的pING3302质粒存在下接合。用VB6-845VH+VL/3302接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。VB5-845-DI变体工程改造VB5-845DI由以下表示：具有SEQIDNO:1的氨基酸序列和SEQIDNO:19的核苷酸序列的重链域；以及具有SEQIDNO:2的氨基酸序列和SEQIDNO:20的核苷酸序列的轻链域。使用存在于CLκ链中的独特限制位点BssSI对VB5-845-DI变体进行工程改造。将845EcoRI-VH-CH-VL-CL-BssSI片段与BssSI-CLκ-XhoI片段一起接合至用EcoRI和XhoI预消化的pING3302质粒中。用接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞用于测序和小规模表达。小规模表达将含有VB5-845-DI变体/3302质粒的转化的10F细胞接种至5mL含有25μg/mL四环素的2-YT中，并且在37℃下在以225rpm恒定振荡下孵育。孵育16小时后，将300μL过夜种子培养物接种至30mLTB(1％接种体)中，并且在37℃下在以225rpm恒定振荡下孵育直至达到2.0的OD600。用150μLL-阿拉伯糖(最终0.1％)诱导培养物，并且在25℃下在以225rpm恒定振荡下孵育。在诱导后16小时，收集培养上清液用于通过西方墨点法、ELISA以及流式细胞术分析。在15L规模下表达VB5-845-DI在28℃、分别为10SLPM和1000RPM的气流和搅动下、以及用氢氧化铵维持的pH7.0下，在20L生物反应器中进行转化的E104大肠杆菌细胞于甘油基础培养基(GMM)中的培育。简单地说，在设定于26℃和200RPM的振荡孵育箱中用在含有25μg/mL四环素的GMM中生长的150mL种子培养物接种15LGMM至2.0-2.5的OD600。在20L生物反应器中，溶解氧(DO)至≥90％的尖峰触发在40％DO设定点处经由pO2回路用50％甘油补料，以控制生长速率。在50的OD600下，使用相同的补料策略用含有L-阿拉伯糖的50％甘油补料诱导培养物。在40小时诱导之后，通过离心继之以微滤使含有VB5-845-DI的上清液澄清，浓缩并且针对20mMNaPO4缓冲液(pH7.0)透滤。纯化15L批量所有色谱柱包装于GE医疗集团(GEhealthcare)的可再使用柱外壳中，并且通过使1NNaOH流经这些柱35分钟来脱热原质，并且用WFI洗涤直至柱流出物的pH<pH8.0。脱免疫VB5-845的理论等电点为8.65。将透滤的培养上清液的pH调整至pH6.2用于结合至先前用20mMNaPO4缓冲液、25mMNaCl缓冲液(pH6.2)平衡的弱阳离子交换柱(例如，按照制造商的说明书制备的CM琼脂糖)。在加载之后，用平衡缓冲液将柱洗涤至UV280nm基线，并且通过使平衡缓冲液的pH和NaCl增至20mMNaPO4缓冲液、150mMNaCl缓冲液(pH7.5)来洗脱结合的VB5-845-DI。用20mMNaPO4缓冲液(pH7.0)3倍稀释在先前步骤中收集的产物峰，并且将稀释溶液的最终pH调整至pH7.5，随后施加至以流通模式操作的阴离子交换柱(例如，按照制造商的说明书制备的Q-琼脂糖)上。用20mMNaPO4、50mMNaCl缓冲液(pH7.5)平衡这个柱。然后将汇集的柱流通液和洗涤液的pH调整至pH6.0用于施加至第三个柱上。然后使汇集的样品流经先前用20mMNaPO4、50mMNaCl缓冲液(pH6.0)平衡的阳离子交换柱(例如，按照制造商的说明书制备的SP琼脂糖)，并且收集含有产物的流出物。将流出物的pH调整至pH7.5并且过滤灭菌用于在4℃和-20℃下长期储存。通过西方墨点分析估算VB5-845-DI构建体的表达水平。简单地说，将16μL诱导的培养上清液和4μLLDS样品缓冲液加载至NuPAGE10％Bis-Tris凝胶上。然后在40V下将凝胶转移至硝酸纤维素膜，持续1小时。在阻断和洗涤膜之后，在室温下使用抗κ-辣根过氧化物酶抗体(1/1000)检测VB5-845-DI蛋白质2小时。使用DAB使膜显色，并且将VB5-845-DI构建体的表达水平与VB6-845和VB5-845-WT相比较。使用非诱导的大肠杆菌上清液确认检测的色带的特异性。ELISA用于定量存在于诱导的培养上清液中的VB6-845蛋白质。简单地说，用10μg/mL兔抗三角梅蛋白涂布Immunolon1B板并且在4℃下孵育过夜。在洗涤和阻断板之后，将以1/320、1/640和1/1280稀释的VB6-845变体上清液以及从纯化的VB6-845-WT抗体(25ng/mL至0.195ng/mL)制备的标准曲线添加至板中并且在22℃下孵育2小时。在22℃下使用抗κ-辣根过氧化物酶抗体(1/1000)检测结合的VB5-845-DI蛋白质1小时。使用TMB使板显色。VB6-845-WT和pING3302质粒诱导的培养上清液分别用作阳性和阴性对照。实施例3：体外结合试验通过流式细胞术对癌细胞系CAL-27评价脱免疫VB5-845(VB5-845-DI)和非脱免疫VB5-845(VB5-845-WT)抗体片段的结合。将纯化的VB5-845变体(DI和WT)以1μg/mL与0.3×106个肿瘤细胞一起在冰上孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，将生物素化山羊抗人IgG(H&L)抗体(1/200)添加至细胞中并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤细胞并且在冰上添加抗生蛋白链菌素-细胞色素持续30分钟以检测细胞结合的VB5-845蛋白质(图7)。图8示出了VB5-845-DI对EpCAM阳性H&N鳞状细胞癌细胞系Cal-27的剂量依赖性结合。未观测到对EpCAM阴性黑素瘤A375的结合。通过流式细胞术，结合表示为中值荧光超过PBS对照的平均倍数增加。实施例4：结合亲和力流式细胞术用于测量VB5-845-WT和VB5-845-DI的结合亲和力。简单地说，将VB5-845蛋白质以在3.2ng/mL至1000ng/mL的范围内的浓度与0.2×106个CAL27细胞一起在冰上孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，添加生物素化山羊抗人IgG抗体并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤细胞并且在冰上添加抗生蛋白链菌素-细胞色素持续30分钟以检测细胞结合的VB5-845。使用SigmaPlot(JandelScientific,SanRafael,CA)生成值和图形分析。通过莱思威佛-伯克法(Lineweaver-Burkmethod)绘制随着抗体浓度的倒数而变的所测定的中值荧光的倒数以确定KD。生成曲线图并且从曲线的斜率计算KD。通过以下等式确定离解常数KD值：1/F＝1/Fmax+(KD/Fmax)(1/Fab)，其中F＝扣除背景的中值荧光并且Fmax从曲线图(图9)计算。实施例5：竞争试验通过流式细胞术确定VB5-845变体(VB5-845-DI和VB5-845-WT)与VB6-845竞争结合至CAL27肿瘤细胞的能力。VB6-845是附接至脱免疫三角梅蛋白毒素的免疫偶联物并且已经描述于美国专利号7,339,031中，并且以引用的方式并入本文中。将VB5-845变体和VB6-845以150μL与0.2×106个肿瘤细胞一起在冰上孵育2小时。VB6-845的浓度保持恒定处于1μg/mL，而VB5-845变体的浓度从781ng/mL增至25μg/mL。用小鼠抗脱三角梅蛋白抗体继之以偶合至FITC的山羊抗小鼠H&L检测结合的细胞表面VB6-845(图10)。实施例6：野生型相对脱免疫克隆体的EpiScreen分析制备和选择供体PBMC从获自英国国家输血服务中心(UKNationalBloodTransfusionService)(Addenbrooke'sHospital,Cambridge,UK)的健康社区供体血沉棕黄层(来自24小时内抽取的血液)并且根据阿登布鲁克医院当地研究伦理委员会(Addenbrooke'sHospitalLocalResearchEthicsCommittee)授予的批准分离外周血单核细胞(PBMC)。通过Lymphoprep(Axis-shield,Dundee,UK)密度离心从血沉棕黄层分离PBMC，并且使用CD8+RosetteSepTM(StemCellTechnologiesInc,London,UK)耗尽CD8+T细胞。通过使用基于HLASSP-PCR的组织分型试剂盒(Biotest,Solihull,UK)鉴别HLA-DR单倍型来表征供体。还测定对对照抗原(钥孔戚血蓝蛋白(KeyholeLimpetHaemocyanin，KLH)，[Pierce(Perbio),Cramlington,UK])以及来源于A型流感病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒(EpsteinBarrvirus)的肽的T细胞反应。然后冷冻PBMC并且储存于液氮中直至需要。选择51个供体的群组以最佳地代表在世界群体中表达的HLA-DR同种异型的数目和频率。在群组中表达的同种异型相对于在世界群体中表达的那些的分析将揭示达成>80％的覆盖率并且充分地代表所有主要的HLA-DR同种异型(在世界群体中以>5％的频率表达的个别同种异型)。EpiScreenTM时程T细胞增殖试验使来自每个供体的PBMC解冻，计数并且评估生存力。在室温AIM-VR培养基中使细胞复苏，洗涤并且再悬浮于AIM-VR中至4-6×106PBMC/ml。对于每个供体，确立大批培养物，其中将1mL增殖细胞储备液添加至24孔板的适当孔中。将0.5mL培养基和0.5mL每个稀释样品添加至PBMC中以得到0.3μM的最终浓度。对于每个供体，还包括再现性对照(与100μg/mlKLH一起孵育的细胞)、阳性对照(与2.5μg/mlPHA一起孵育的细胞)以及仅培养基。在37℃与5％CO2下孵育培养物总共8天。在第5天、第6天、第7天以及第8天，使每个孔中的细胞缓缓地再悬浮，并且将3×100μl等分试样转移至圆底96孔板的每个孔。在100μlAIM-VR培养基中用0.75μCi[3H]-胸苷(PerkinElmerR,Beaconsfield,UK)对培养物进行脉冲并且再孵育18小时，随后使用SkatronMicro96S-10056细胞收集器收集至过滤器垫(PerkinElmerR)上。通过MeltilexTM(PerkinElmerR)闪烁计数在1450MicrobetaWallacTrilux液体闪烁计数器(PerkinElmerR)上以帕勒克斯(paralux)低背景计数来测定每个孔的每分钟计数(cpm)。EpiScreenTMIL-2ELISpot试验与增殖试验中所用的那些相同的供体也用于IL-2ELISpot试验。如上文所描述使细胞解冻并复苏。预润湿ELISpot板(Millipore,Watford,UK)并且用含100微升/孔IL-2捕获样品(R&DSystems,Abingdon,UK)的PBS涂布过夜。然后在PBS中洗涤板3次，在阻断缓冲液(含1％BSA的PBS)中孵育过夜，并且在AIM-VR培养基中洗涤。在AIM-VR培养基中将每个供体的细胞密度调整至4-6×106PBMC/ml，并且将100μL细胞添加至每个孔中。将50μL样品和对照添加至适当孔以及50μLAIMV中以使总体积达到200微升/孔。在一式六份培养物中测试样品，并且对于每个供体，在每个板上还包括阴性对照(单独的AIMVR培养基)、无细胞对照以及有丝分裂原阳性对照(2.5μg/mlPHA-用作ELISpot功能和细胞生存力的内部测试)。在8天孵育期之后，通过在dH2O和PBS(×3)中依序洗涤，随后添加100μL含过滤的生物素化检测样品(R&DSystems)的PBS/1％BSA使ELISpot板显色。在37℃下孵育1.5小时后，在PBS(×3)中进一步洗涤板，并且添加100μL含过滤的抗生蛋白链菌素-AP(R&DSystems)的PBS/1％BSA持续1.5小时(在室温下孵育)。弃去抗生蛋白链菌素-AP并且在PBS(×4)中洗涤板。将100μLBCIP/NBT底物(R&DSystems)添加至每个孔中并且在室温下孵育30分钟。通过用dH2O洗涤孔和孔的背面三次来终止斑点显色。在ImmunoscanR分析仪上扫描干燥的板，并且使用ImmunoscanR第4版软件测定每孔斑点数(spw)。EpiScreenTM数据分析对于增殖和IL-2ELISpot试验，先前已经确立了刺激指数(SI)等于或大于2(SI≥2.00)的经验临界值，借此诱导高于这个临界值的反应的样品被视为阳性(还突出强调边界线SI≥1.90)。广泛的试验开发和先前的研究已经显示，这是在不检测大量的假阳性反应或省略微小免疫原性事件的情况下允许最大灵敏度的最小信噪比临界值。对于增殖(n＝3)与IL-2ELISpot数据(n＝6)组，由如下统计和经验临界值定义阳性反应：(1)通过使用未配对双样品司徒顿氏t检验(student'st-test)比较测试孔相对于培养基对照孔的cpm或spw所得的反应显著性(p<0.05)；(2)刺激指数大于或等于2(SI≥2.00)，其中SI＝测试孔的平均值(cpm或spw)/基线(cpm或spw)。以这种方式呈现的数据指示为SI≥2.00，p<0.05。另外，通过计算来自重复培养物的原始数据的变异系数和标准偏差(SD)来评估试验内变化。实施例7：脱免疫VB6-845(Algo克隆体)的分子工程改造和表达实验设计VB6-845变体工程改造通过剪接重叠延伸PCR方法SOE-PCR产生突变的845VH和VL片段。将每个VH和VL片段克隆至pCR2.1载体中并且转化至10F大肠杆菌细胞中用于测序。用对VH或VL具特异性的一组鉴别的限制酶消化含有正确插入物的pCR2.1质粒。用限制酶EcoRI和SacII消化VH片段，并且与SacII-CH-VL-CL-de-Boug-XhoI片段一起接合至用EcoRI和XhoI预消化的pING3302载体中。用接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。将用限制酶SalI和BsmI消化的VL片段与用相同限制酶预消化的VB6-845pSP73质粒接合。将接合反应物转化至10F大肠杆菌细胞中，并且在氨苄青霉素选择之后，从生长过夜的集落中提取VB6-845/pSV73质粒。用ScaI、EcoRI以及XhoI限制酶的组合获得VB6-845插入物，并且接合至用EcoRI和XhoI限制酶预消化的pING3302载体中。然后用VB6-845/3302接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。为了组合突变链，分别用EcoRI-SacII和SacII-XhoI消化VH和VL片段，并且在先前用EcoRI和XhoI消化的pING3302质粒存在下接合。用VB6-845VH+VL/3302接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞，并且使转化的集落生长用于小规模表达。VB5-845Algo工程改造VB5-845-AlgoFab由以下表示：具有SEQIDNO:11的氨基酸序列和SEQIDNO:23的核苷酸序列的重链域；以及具有SEQIDNO:12的氨基酸序列和SEQIDNO:24的核苷酸序列的轻链域。使用存在于CLκ链中的独特限制位点BssSI对VB5-845-Algo进行工程改造。将845EcoRI-VH-CH-VL-CL-BssSI片段与BssSI-CLκ-XhoI片段一起接合至用EcoRI和XhoI预消化的pING3302质粒中。用接合反应物转化化学感受态10F大肠杆菌细胞用于测序和小规模表达。小规模表达将含有VB6-845-Algo/3302质粒或VB5-845-Algo/3302质粒的转化的10F细胞接种至5mL含有25μg/mL四环素的2-YT中，并且在37℃下在以225rpm恒定振荡下孵育。孵育16小时后，将300μL过夜种子培养物接种至30mLTB(1％接种体)中，并且在37℃下在以225rpm恒定振荡下孵育直至达到2.0的OD600。用150μLL-阿拉伯糖(最终0.1％)诱导培养物，并且在25℃下在以225rpm恒定振荡下孵育。在诱导后16小时，收集培养上清液用于通过西方墨点法、ELISA以及流式细胞术分析。西方墨点分析通过西方墨点分析估算VB6-845和VB5-845-Algo的表达水平。简单地说，将16μL诱导的培养上清液和4μLLDS样品缓冲液加载至NuPAGE10％Bis-Tris凝胶上。然后在40V下将凝胶转移至硝酸纤维素膜，持续1小时。在阻断和洗涤膜之后，在室温下使用抗κ-辣根过氧化物酶抗体(1/1000)检测VB6/VB5-845-Algo蛋白质2小时。使用DAB使膜显色，并且将VB6/VB5-845-Algo的表达水平分别与VB6/VB5-845野生型(WT)相比较。使用非诱导的大肠杆菌上清液确认检测的色带的特异性。通过ELISA定量ELISA用于定量存在于诱导的培养上清液中的VB6-845蛋白质。简单地说，用10μg/mL兔抗三角梅蛋白涂布Immunolon1B板并且在4℃下孵育过夜。在洗涤和阻断板之后，将以1/320、1/640和1/1280稀释的VB6-845上清液以及从纯化的VB6-845抗体(25ng/mL至0.195ng/mL)制备的标准曲线添加至板中并且在22℃下孵育2小时。在22℃下使用抗κ-辣根过氧化物酶抗体(1/1000)检测结合的VB6-845蛋白质1小时。使用TMB使板显色。VB6-845-WT和pING3302质粒诱导的培养上清液分别用作阳性和阴性对照。通过流式细胞术测量的结合反应性VB6-845诱导的培养上清液：通过流式细胞术使用EpCAM阳性人类鳞状细胞癌CAL27评估VB6-845构建体的反应性。使用ELISA定量，将VB6-845诱导的上清液的体积调整至最低浓度并且在冰上与0.2×106个肿瘤细胞一起孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，将兔抗三角梅蛋白抗体(1/100)添加至细胞中并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤细胞，并且在冰上添加偶合至FITC(1/100)的山羊抗兔抗体持续30分钟以检测细胞结合的VB6蛋白质。VB6-845-WT和pING3302质粒诱导的培养上清液分别用作阳性和阴性对照。纯化的VB5-845：通过流式细胞术测量纯化的VB5-845变体对肿瘤细胞系CAL27的结合反应性。将纯化的VB5-845变体以1μg/mL与0.3×106个肿瘤细胞一起在冰上孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，将生物素化山羊抗人IgG(H&L)抗体(1/200)添加至细胞中并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤细胞并且在冰上添加抗生蛋白链菌素-细胞色素持续30分钟以检测细胞结合的VB5蛋白质。VB5-845-WT用作阳性对照。纯化的VB6-845：如先前所描述测量100ng/mL的纯化的VB6-845-Algo的结合反应性。通过MTS试验使用EpCAM阳性和阴性细胞系测量细胞毒性。VB6-845-WT用作阳性对照。结合亲和力流式细胞术用于测量VB5-845-Algo的结合亲和力。简单地说，将VB5-845-Algo以在3.2ng/mL至1000ng/mL的范围内的浓度与0.2×106个CAL27细胞一起在冰上孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，添加生物素化山羊抗人IgG抗体(1/200)并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤细胞并且在冰上添加抗生蛋白链菌素-细胞色素(1/120)持续30分钟以检测细胞结合的VB5-845-Algo。使用SigmaPlot(JandelScientific,SanRafael,CA)生成值和图形分析。通过莱思威佛-伯克法绘制随着抗体浓度的倒数而变的所测定的中值荧光的倒数以确定KD。生成曲线图并且从曲线的斜率计算KD。通过以下等式确定离解常数KD值：1/F＝1/Fmax+(KD/Fmax)(1/Fab)，其中F＝扣除背景的中值荧光并且Fmax从曲线图计算。与VB6-845或VB5-845-WT的竞争试验通过流式细胞术确定VB5-845-Algo与VB6-845竞争结合至CAL27肿瘤细胞的能力。将VB5-845-Algo和VB6-845以150μL与0.3×106个肿瘤细胞一起在冰上孵育2小时。VB6-845的浓度保持恒定处于1μg/mL，而VB5-845-Algo的浓度从17.8μg/mL增至71μg/mL。用PBS-5％FBS洗涤细胞，并且将兔抗三角梅蛋白抗体(1/100)添加至细胞中并且在冰上孵育1小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，在冰上添加偶合至FITC(1/100)的山羊抗兔抗体持续30分钟以检测细胞结合的VB6蛋白质。VB4-845用作阳性对照以与VB6-845竞争结合至肿瘤细胞系CAL27。血清稳定性通过西方墨点分析来测定VB5-845和VB6-845变体的血清稳定性。简单地说，将变体以80μg/mL的浓度添加至500μL人类血清中并且在37℃、5％CO2下孵育24小时。在0小时、3小时、6小时以及24小时，使样品涡旋并且移出45μL等分试样并且在-20℃下在15μLLDS存在下储存。如上进行西方墨点法，加载200纳克/孔的变体。在室温下使用兔抗4D5抗体(1/1000)检测VB5-845或VB6-845蛋白质45分钟，继而在室温下使用抗兔辣根过氧化物酶抗体(1/2000)检测45分钟。用DAB使膜显色。纯化的VB5-845或VB6-845用作阳性对照。热稳定性流式细胞术用于测定VB5-845和VB6-845变体的热稳定性。将VB5-845和VB6-845变体以80μg/mL的浓度添加至PBS中并且在37℃、5％CO2下孵育24小时。在0小时、3小时、6小时以及24小时，移出25μL等分试样并且在-20℃下储存用于通过流式细胞术分析。为了测试，将VB5-845和VB6-845变体样品在150μLPBS-5％FBS中分别稀释至1μg/mL和100ng/mL，并且在冰上与0.3×106个细胞一起孵育2小时。用PBS-5％FBS洗涤之后，添加山羊抗人IgG(H+L)生物素化抗体(1/200)并且在冰上孵育1小时。洗涤之后，添加PE-Cy5抗生蛋白链菌素荧光色素(1/120)以检测VB5-845细胞表面结合。纯化的VB5-845-WT和VB6-845-WT用作阳性对照。VB5-845-Algo的T细胞增殖通过流式细胞术在CD3+CD4+上门控来测量VB5-845-Algo和VB5-845诱导T细胞增殖的能力。由DNA合并标志物EdU-A488的荧光强度分析在存在或不存在Fab蛋白质的情况下的增殖。数据表示为刺激指数(SI值)，其对应于Fab处理孔相对未处理孔中活化的CD3+CD4+T淋巴细胞数目的比率。结果分析鉴别存在于重链和轻链中的潜在T细胞表位。建议的变化是对应于种系序列并且归类为“安全或危险突变”的氨基酸。归因于变化的数目，评价单点突变对表达和生物活性的影响是不可行的。因此，将安全突变分组并且使用连续两轮SOE-PCR引入。然而，归因于位置VH38和VL50的不确定性，形成含有突变或野生型残基的链。一旦确认序列，将突变链克隆至VB6-845双顺反子单位中并且在其相应的野生型配对物存在下表达。如果表达和生物活性的水平与WT相当，那么将突变的重链和轻链组合并测试。对于“危险突变”，首先作为单点突变评价VH53、VH93以及VH98。如果确定是适合的，那么将其引入最终VH构建体内。VB6-845第一代的分子工程改造1)“安全突变”的VB6-845第一型的工程改造和测试：VH-algo：需要连续两轮SOE-PCR以引入所有突变。如表3中所见，VH-Ir克隆体含有FR1和一部分FR3突变。然后在下一个SOE-PCR反应中采用VH-Ir模板以形成VH-IIr，其含有所有突变并且在VH-IIr-K38的情况下，位置38无变化。对最终SOE-PCR反应物进行的测序反应还揭示，测序的克隆体之一，名为IIr-CDR1，除了CDR1和FR2区以外含有所有突变的氨基酸。在WT轻链存在下突变重链的表达水平类似于WT。另外，通过流式细胞术测量的生物活性与WT相比无变化。值得注意的是，使用一些变体获得的更高中值荧光可能是通过ELISA获得的浓度低估的结果。表3：VH-algo突变和生物活性加粗的氨基酸对应于突变的残基。报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。VL-Algo：通过第一个SOE-PCR反应引入含有CDR1/A50-CDR2/FR4或CDR1/Q50-CDR2/FR4突变的轻链。与VH策略成对比，对仅含有FR2突变的构建体进行工程改造并且独立地测试。Ir-A50克隆体的生物活性显著降低，这展示A50突变对于VB6-845结合至EpCAM是有害的。因此，仅将FR2突变添加至Ir-Q50轻链中。当测试时，IIr-Q50的表达和生物活性的水平分别比WT低70％和44％。值得注意的是，通过使位置41逆转为WT氨基酸仅部分恢复表达水平和生物活性。表4：VL-algo突变和生物活性加粗的氨基酸对应于突变的残基。报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。VH-VL-algo：基于上文所描述的结果，选择VH-IIr和VL-Ir-Q50，组合并且作为VB6-845重组融合蛋白质表达。如表5中所见，超过66％的生物活性损失，这表明一些突变已经影响VH-VL界面。为了定点有问题的区域，在VL-Ir-Q50存在下也对VH-Ir和VH-IIr-CDR1进行工程改造并测试。部分恢复VB6-845-(VH-IIr-CDR1/VL-Ir-Q50)的生物活性，这表明CDR1区内的突变可能已经部分改变VH-VL界面。表5：VH-VLAlgo测试VHVLELISA(μg/mL)MFWTWT1.56100IIrIr-Q501.234IrIr-Q501.4682IIr-CDR1Ir-Q502.0578报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。2)VB6-845“危险突变”的工程改造和测试通过SOE-PCR对含有单一“危险”点突变的VB6-845构建体进行工程改造并测试。如表6中所见，仅位置K98Q不影响生物活性。表6：VHAlgo的“危险突变”和生物活性报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。3)VB6-845第二型的工程改造和测试基于上文所描述的结果，作出一些调整。对于VH域，使位置35逆转为WT。对于VL域，使FR2和位置50突变的困难得到FR2和CDR2区的一组不同突变。VH-algo第二型：在SOE-PCR反应中使用IIr插入物作为模板使位置35逆转为天冬酰胺残基。如预期，当用野生型轻链工程改造时未观测到表达水平或生物活性的差异(表7)。类似地，添加CDR3突变Q98至IIr-N35中并不改变表达或生物活性。表7：VH-algo第二型的突变和生物活性加粗的氨基酸对应于突变的残基。报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。VL-algo第二型：含有FR2(H39-S42)或CDR2(E51-H53-Q55)突变的两个轻链当作为VB6-845分子测试时显示减少的结合。当与CDR1和FR4突变组合作为最终VL构建体(IIr/FR2/CDR2)时这种效应进一步放大。值得注意的是，也有可能轻链突变将只有在突变的VH存在下是功能性的。然而，作为偶然情况，也对仅含有将对耗尽T细胞表位具有最大影响的少数突变的轻链(IIr-KSHI)进行工程改造并且发现生物活性类似于VB6-845WT。表8：VLalgo第二型的突变和生物活性加粗的氨基酸对应于突变的残基。报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。VH-VL-algo第二型：将最终VH链IIr-N35-Q98与VL-Ir-CDR2、VL-IIr-FR2-CDR2以及VL-IIr-KSHI组合。如表7中所见，仅含有组合的VH-IIr-N35-Q98和VL-IIr-KSHI的VB6-845构建体具有与WT类似的表达水平和生物活性并且称作VB6-845-Algo。其它组合产生表达和结合至EpCAM的显著损失。表9：VH-VLAlgo第二型测试VHVLELISA(μg/mL)MFWTWT1.2100IIr-N35-Q98Ir-CDR20.7645IIr-N35-Q98IIr-FR2-CDR20.3438IIr-N35-Q98IIr-KSHI0.994报道的中值荧光MF是两个独立实验的平均值并且表示为WT％。按照Kabat命名编号。VB5-845-Algo的生物活性为了防止脱三角梅蛋白干扰T细胞增殖试验，形成VB6-845-Algo的VB5-845Fab型式，表达并纯化。对纯化的VB5-845-AlgoFab蛋白质进行各种生物测试并且将数据与VB5-845-WT相比较。竞争试验为了确保特异性未改变，测试VB5-845-Algo与VB6-845竞争结合至EpCAM阳性CAL-27细胞的能力。如图13中所示，VB5-845-Algo(开放圆圈)竞争VB6-845结合。VB4-845和VB5-845-WT用作阳性对照。人类血清稳定性为了展示突变并不形成蛋白水解位点，在37℃下在人类血清中孵育VB5-845-Algo和VB5-845-WT长达最多24小时。通过西方墨点分析评估VB5蛋白质的稳定性。如图14中所示，分析揭示强度无变化，这表明两个VB5-845蛋白质在人类血清中都保持完整。热稳定性为了确保突变并不影响VH-VL界面的热稳定性，在37℃下在1×PBS中孵育0、3、6以及24小时后通过流式细胞术评估VB5-845-Algo的生物活性。数据表示为在0小时获得的中值荧光的百分比(图15)。VB5-845-Algo显示超过0小时对照的略微增加，这表明Fab部分是热稳定的。结合亲和力通过流式细胞术使用CAL-27肿瘤细胞测量结合亲和力。使用滴定曲线，如实验设计中所描述测定KD(表10)。表10克隆体KD(nM)VB5-845-WT1.56VB5-845-Algo1.31VB6-845-Algo的生物活性为了评估生物活性，纯化VB6-845-Algo(含有脱三角梅蛋白)并且通过流式细胞术和MTS试验使用CAL-27、HT-29、MCF-7以及OVCAR-3EpCAM阳性细胞系测试。还包括A-375和COLO-320EpCAM阴性细胞系以确保VB6-845-Algo特异性未改变。如表11中所示，VB6-845-Algo与EpCAM阳性细胞系的结合比VB6-845-WT(用作阳性对照)低53％至32％。因此，VB6-845-Algo与WT相比效力低7至9倍。如预期，使用EpCAM阴性细胞系测得无结合或IC50。表11两个独立实验的代表性数值。倍数增加(FI)是两个独立测量的平均值。免疫原性由CD3+CD4+T细胞的增殖测量VB5-845-Algo的免疫原性型态并且与VB5-845-WT相比较。如预期，53个中的12个供体对VB5-845-WT起反应，这代表几乎23％(图16)。相比之下，仅2个供体对VB5-845-Algo产生反应(几乎4％)，这展示引入的突变已经显著降低Fab部分的免疫原性潜力。序列表SEQIDNO:1(脱免疫VH-CH或DIVH-CH)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTAYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSEQIDNO:2(脱免疫VL-CL或DIVL-CL)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGTGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO:3(ET毒素252-608)EGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLlGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPSEQIDNO:4(修饰的三角梅蛋白)YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSKSEQIDNO:5(野生型VH-CH或WTVH-CH)EVQLVQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSEQIDNO:6(野生型VL-CL或WTVL-CL)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO:7(脱免疫VB5-845的DNA序列)CTGCAGGTCTATGGAACGATAAATGCCCATGAAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgctgcccaaccagcgatggcgGAAGTACAGCTGGTCgaaTCCGGTggtGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCctgCGTctgAGCTGCGCGGCGAGCGGTTACACCTTCACCgcgTACGGTATGAACTGGGTTcgtCAGGCTCCGGGTAAAGGTTTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTATACCGGTGAGTCTACCTACGCTGATAGCgttAAAGGCCGTTTCACCatcAGCgctGACACTAGCaaaaacaccGCGTACCTGCAGatgAACTCTCTGCGTGCTGAGGACACTGCGGTTTACTACTGCGCTCGTTTCGCGATCAAAGGTGACTATTGGGGTCAGGGTACTCTGgttACCGTTAGCAGCGCTAGCACTAAgGGcCCGTCCGTTTTCCCACTGGCTCCGTCTTCTAAAAGCACTTCTGGTGGTACCGCGGCTCTGGGTTGCCTTGTTAAAGACTACTTCCCTGAACCGGTCACCGTTAGCTGGAACTCCGGTGCGTTGACCTCTGGTGTTCACACCTTCCCAGCGGTTCTGCAGTCTAGCGGTCTGTATAGCCTGAGCTCTGTAGTTACCGTTCCGTCTTCTAGCCTGGGTACGCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAACCGAGCAACACTAAAGTGGATAAAAAAGTTGAACCGAAGTCTTGCTAGTAATCTAGAGTCGACCTGCAGGTCTATGGAACGATAAATGCCCATGAAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATACCTTCTGCCGACCGCTGCCGCTGGTCTGCTGCTGTTGGCTGCTCAACCGGCTATGGCAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCTAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGACCGTGTGACCATCACCTGCCGTAGCACTAAATCCCTGCTGCACTCTAACGGCATCACCTACCTGTATTGGTACCAACAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAACTGCTGATCTACCAGATGTCTAACCTGGCTAGCGGCGTTCCTTCTCGTTTTTCTTCTAGCGGTAGCGGTACTGACTTCACCCTGACCATTAGCTCTCTGCAGCCTGAAGACTTTGCGACCTACTATTGCGCTCAGAACCTTGAAATCCCGCGTACCTTCGGCaccGGTACCAAAGTTGAAatcAAGCGTACCGTTGCGGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAACAGCTTAAATCTGGTACTGCTAGCGTAGTTTGCCTGCTTAACAACTTCTACCCTCGTGAAGCT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