一种L-鸟氨酸的分离纯化方法技术领域本发明涉及一种L-鸟氨酸的分离纯化方法，属于生物技术领域。
背景技术：
鸟氨酸是1877年，杰弗在喂养安息香酸的鸟类尿液的水解产物中发现的，因此得名。它是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，可以作为氨基酸输液原料。能促进生长激素的分泌，以协助机体代谢过多的脂肪，与精氨酸配合使用具有很好的减肥效果。在动物体内主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排出有重要作用。鸟氨酸是维持免疫系统和肝功正常不可缺少的，能解毒氨及帮助肝再生，除在医药上作为试剂与注射液外，还通常与精氨酸一起用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。在皮肤和结缔组织中含有高浓度的鸟氨酸对于愈合和修复损伤组织非常有益。鸟氨酸是由体内的精氨酸合成的，反过来，它又是瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前体。鸟氨酸能将氨转化为尿素与谷氨酰氨，因此补充鸟氨酸可为解毒途径提供酶的作用物。当身体制造尿素，精氨酸便会被新陈代谢掉，身体转为制造鸟氨酸。用动物做的实验证明鸟氨酸和精氨酸能令身体生产更多合成代谢的、促进生长的荷尔蒙，包括胰岛素和生长荷尔蒙，来促进肌肉生长。此外，鸟氨酸还用于配制恢复疲劳的发泡饮料。在生物体内，鸟氨酸能在尿素循环(Krebs.Henseleit循环)中起作用。尿素循环分为4步，能够将生物体内天冬氨酸以及氨中的氮元素转化为尿素，因而是生物体内的主要排氨方式。动物利用新陈代谢将体内多余的氮元素转化为尿素的主要器官是肝脏，体内的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，产生尿素和鸟氨酸。精氨酸水解后产生的鸟氨酸，将会与氨甲酰磷酸反应，进而产生瓜氨酸，瓜氨酸会进一步与天冬氨酸反应而生成精氨基琥珀酸，精氨基琥珀酸最终会在酶的催化作用下进一步被分解为延胡索酸以及精氨酸等产物。由于该反应的第一步是将精氨酸转化为尿素，反应到最后又生成了精氨酸，周而复始，所以该反应称为尿素循环。由于目前全世界氨基酸产业的迅速发展，各地的科学家逐渐认识到了L-鸟氨酸的多种生物功能，其中日本最为突出，他们在20世纪40年代就开始对L-鸟氨酸有所研究，在10-20年后就有许多文章发表，且多数是以专利的形式发表的。其中包括鸟氨酸生产菌株、鸟氨酸高产菌株的选育、鸟氨酸的定量分析以及发酵法生产-鸟氨酸的发酵条件优化等，并且以专利文献的形式发表。但是此期间在国内却很少听到对于-鸟氨酸的研究。直至1998年至2000年间，才报道有张克旭、潘韵和陈宁等人曾做过关于L-鸟氨酸的菌种筛选和发酵方面的研究，有几篇论文发表。与国外的研究相比，我国L-鸟氨酸产业还处于起步阶段，所研究的面很窄，而且研究进展较慢，目前仅发展到摇瓶试验阶段，要进行工业化生产还需要我们进行大量的试验和研究。和国外相比，我国对鸟氨酸的研究有很大的差距，研究面窄，进展不大，仅限于摇瓶试验，离工业化生产还有很长的路要走。鸟氨酸是精氨酸的衍生物，在医药、保健、食品和化工等领域具有广泛用途，市场需求逐年增长，国内外尚无大规模生产的报道。鸟氨酸生产方法主要有化学法、微生物发酵法和酶转化法。化学法工艺繁杂，环境污染严重，副产物多且不易分离；微生物发酵法由于缺乏性能优良的生产菌株和生产工艺的系统研究，限制了该方法的发展和应用。酶转化法是精氨酸在精氨酸酶的专一作用下生成鸟氨酸，产品纯度高，是最具开发潜力的鸟氨酸生产方法，优质廉价的精氨酸原料和转化酶的获得是该方法的关键。鸟氨酸的生产方法有4种：发酵法：酶法；化学合成法和蛋白质水解提取法。(1)发酵法发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的质诱变等处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。发酵法包括直接发酵法和添加前体发酵法。氨基酸产生菌是实现发酵法生产氨基酸的前提，在氨基酸发酵的建立和改进中起着非常重要的作用。根据氨基酸产生菌的遗传性状，可将其分为四类：第一类为直接使用野生型菌株由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸；第二类为营养缺陷型变异株；第三类为氨基酸结构类似物抗性变异株；第四类为营养缺陷型(或渗漏型)兼结构类似物抗件变异株。应用发酵法生产鸟氨酸因产酸水平较低实用价值不大。发酵法主要是利用精氨酸(Arg-)或瓜氨酸(Cit-)的营养缺陷型突变株来积累鸟氨酸。Takayasu等在营养缺陷型菌株的基础上筛选到具有霉酚酸抗性的突变株，最高产量可达50g/L；李环等利用混合菌种发酵生产鸟氨酸，产量达40g/L左右。发酵法原料成本低廉，但是发酵液中成分复杂，后续分离困难。(2)化学合成法化学法制备鸟氨酸根据化学反应机理可分为有机合成法和精氨酸水解法两种。该法采用基础化工原料合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低。然而该法经过多步化学反应合成，收率偏低；其原料中的氰化氢为剧毒致癌物，在工业生产中应尽量避免使用。化学法合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本，这些方面都成为该法的主要缺陷所在。化学法是利用弱碱水解精氨酸得到鸟氨酸和少量瓜氨酸。化学法生产鸟氨酸产物为DL-型外消旋体，分离困难，生产过程不易控制，现已被淘汰。(3)蛋白质水解提取法以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种氨基酸的方法称为水解法。随着氨基酸生产技术的进步。由蛋白质水解法提取氨基酸这一古老的生产方法受到很大的冲击，传统的水解法生产谷氨酸已失去其存在的价值。(4)酶法酶法生产鸟氨酸就是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素；酶法生产氨基酸具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高等特点。L-精氨酸酶广泛存在于动物的肝脏、植物、酵母和细菌中传统的酶法制备鸟氨酸方法，采用以牛肝为酶源，从牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸为合成底物转化鸟氨酸。酶法生产鸟氨酸专一性强，反应条件温和，避免采用氰化氢等有毒化学品，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但是精氨酸酶的来源不易，底物精氨酸的成本也较高。如何获得廉价的合成底物和酶源是这一方法能否成功应用的关键。本技术采用发酵法生产的精氨酸纯化液为原料，采用假单胞菌产生的精氨酸酶转化生产鸟氨酸，原料易得，酶成本低廉，结合固定化酶技术，可节约鸟氨酸生产成本，制造出高质量的产品。申请人多年来致力于发酵法生产精氨酸及其衍生物关键技术的研究，拥有年产500吨的精氨酸生产线。鉴于国内外市场需求强劲的现状，申请人对鸟氨酸高效生物制造技术及产业化进行研究，创造性的提出了微生物酶法生产鸟氨。依托现有精氨酸技术和原料优势，选育了生产鸟氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸为原料通过酶转化获得鸟氨酸。本发明产品纯度高易分离，同时克服了原料和酶昂贵不易获取的劣势，具有规模化生产的前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株产精氨酸酶的菌株MQO-154，本发明经过对苏云金芽孢杆菌(土壤分离)进行紫外诱变和化学诱变，筛选到一株精氨酸酶活性较高的菌株，经分离纯化后获得菌株MQO-154，其保藏编号为：CGMCCNo.10728；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2015年4月21日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌株MQO-154的生物特性为：该菌株在斜面培养基上培养24h，成乳白色菌落，湿润，表面无光泽，菌苔厚且不透明，菌落较大，边缘不规则菌体呈杆状，细胞长约3-4μm，直径1-2μm，具有内生芽孢，不能运动，好氧或兼性厌氧。菌株MQO-154的分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis)。利用菌株MQO-154制备精氨酸酶的方法，步骤如下：(1)斜面培养：将菌株MQO-154在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为33℃，培养时间为24h；斜面培养基：葡萄糖25g，鱼蛋白胨15g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.5g，琼脂16g，加纯净水至1L，用NaOH调pH至为7.0，灭菌温度115℃，15min。(2)种子扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为24h，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-24h，摇床转速100r/min。种子培养基：葡萄糖25g，乙酸铵9g，KH2P040.59g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H200.5g，FeSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，琼脂16g，加纯净水至1L，用NaOH调pH至7.0，灭菌温度115℃，15min。(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，于30℃，170r/min的摇床上发酵24h，得到含精氨酸激酶的发酵培养液；发酵培养基：葡萄糖25g，鱼蛋白胨15g，玉米浆10g，酵母膏1g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，用自来水配成1L溶液，用NaOH调pH至7.0，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，控制罐压强为0.05MPa，在33℃条件下培养28小时，搅拌转速为600-800rpm，风量为1：0.8，控制溶氧量为30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH为6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得含有精氨酸酶的菌体。本发明利用精氨酸酶，以精氨酸纯化液为原料制备L-鸟氨酸，步骤如下：(1)转化底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经711氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液(2)将含有精氨酸酶的菌体,用生理盐水洗涤1次,离心后收集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0.3mol/L碳酸盐缓冲液(Na2CO4与NaHCO4体积比为7:3)和0.1mg/ml的Mn2+，加入5％的L-精氨酸纯化液,反应24h(30℃，200r/min)；转化率可达98％。(3)分离纯化：离子交换：将转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达到95％；纳滤：采用800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到鸟氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液(纳滤清液)后，弃去浓缩液，收集含L-鸟氨酸产品的纳滤透析液，，收率达到98％；调pH、脱色：用盐酸调节鸟氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为鸟氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99％，收率达到99％；反渗透浓缩：将鸟氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到鸟氨酸脱氨后的预浓缩液，收率达到99％；浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到鸟氨酸结晶；鸟氨酸盐酸盐的获得：将结晶的鸟氨酸经抽滤后用无水乙醇洗涤3次得到鸟氨酸盐酸盐湿品，收率达到85％；干燥：将鸟氨酸盐酸盐湿品放入55℃真空干燥箱在≥-0.098真空度下干燥6h得到鸟氨酸盐酸盐成品。本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)筛选到了一株MQO-154，解决了酶转化工艺酶来源和酶成本高的限制；(2)利用精氨酸酶，以精氨酸纯化液为原料制备L-鸟氨酸，产品纯度高，易分离，产成品成本低；(3)采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1一株产精氨酸酶的菌株MQO-154，本发明经过对苏云金芽孢杆菌进行紫外诱变和化学诱变，筛选到一株酶活性较高的菌株，经分离纯化后获得菌株MQO-154，其保藏编号为：CGMCCNo.10728；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2015年4月21日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌株MQO-154的生物特性为：菌株MQO-154接种到斜面培养基上进行培养24h，成乳白色菌落，湿润，表面无光泽，菌苔厚且不透明，菌落较大，边缘不规则菌体呈杆状，细胞长约3-4μm，直径1-2μm，具有内生芽孢，不能运动，好氧或兼性厌氧。实施例2利用菌株MQO-154制备精氨酸酶的方法，步骤如下：(1)斜面培养：将菌株MQO-154在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为33℃，培养时间为24h；斜面培养基：葡萄糖25g，鱼蛋白胨15g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H200.5g，K2HPO41.5g，琼脂16g，加纯净水至1L，用NaOH调pH至为7.0，灭菌温度115℃，15min。(2)种子扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为24h，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-24h，摇床转速100r/min。种子培养基：葡萄糖25g，乙酸铵9g，KH2PO40.59g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H200.5g，FeSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，琼脂16g，加纯净水至1L，用NaOH调pH至7.0，灭菌温度115℃，15min。(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，于30℃，170r/min的摇床上发酵24h，得到含精氨酸激酶的发酵培养液；发酵培养基：葡萄糖25g，鱼蛋白胨15g，玉米浆10g，酵母膏1g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，用自来水配成1L溶液，用NaOH调pH至7.0，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，控制罐压强为0.05MPa，在35℃条件下培养28小时，搅拌转速为600-800rpm，风量为1：0.8，控制溶氧量为30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH为6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得含有精氨酸酶的菌体。实施例3本发明利用精氨酸酶，以精氨酸纯化液为原料制备L-鸟氨酸，步骤如下：(1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经711氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；(2)转化培养：将含有精氨酸酶的菌体,用生理盐水洗涤1次,离心后收集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0.3mol/L碳酸盐缓冲液(Na2CO4与NaHCO4体积比为7:3)和0.1mg/ml的Mn2+，加入5％的L-精氨酸纯化液,反应24h(30℃，200r/min)；转化率可达98％。实施例4本发明制备的L-鸟氨酸的分离纯化(1)离子交换：将实施例3获得的L-鸟氨酸转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达到95％；(2)纳滤：采用800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到鸟氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液(纳滤清液)后，弃去浓缩液，收集含L-鸟氨酸产品的纳滤透析液，，收率达到98％；(3)调pH、脱色：用盐酸调节鸟氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为鸟氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99％，收率达到99％；(4)反渗透浓缩：将鸟氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到鸟氨酸脱氨后的预浓缩液，收率达到99％；(5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到鸟氨酸结晶。试验例1本发明中转化条件的确定(1)pH值的确定，当其它条件不变，反应pH为9.0-10.0时，精氨酸完全反应，pH为10.0时精氨酸摩尔转化率明显提高。(2)转化时间的确定，当其它条件不变，反应为10h时坂口实验颜色为深玫瑰红色，表明尚有大量的L-精氨酸盐酸盐，反应不完全；随着反应时间的延长，坂口实验颜色在变浅，15h时L-精氨酸盐酸盐已经反应完全，但还没有完全转化为L-鸟氨酸，产率仍然很低；24h时坂口实验已经检验不出L-精氨酸盐酸盐的存在，且产率很高。然而随着时间的进一步延长，L-鸟氨酸的产率没有发生明显变化，说明24h时反应已经完全，因此24h是较佳反应时间。(3)反应温度的确定，当其它条件不变，反应温度为36℃时，产率最高，说明36℃能使L-精氨酸酶的催化活性最好地发挥。(4)不同底物浓度的确定，当初始底物精氨酸浓度为5％时，经过24h左右的转化精氨酸摩尔转化率仍然可以保持在一个比较高的水平；但当初始底物精氨酸的浓度达到7％和10％的时候，初始精氨酸浓度为5％的转化液，其转化液中产物鸟氨酸的浓度仅有很小的提高。通过上述系列实验得出精氨酸酶转化鸟氨酸最佳酶转化条件如下：反应pH为9.5，反应温度36℃，反应时间24h，底物精氨酸浓度5％。试验例2本发明中鸟氨酸浓度、精氨酸摩尔转化率的测定(1)鸟氨酸浓度的测定鸟氨酸和茚三酮在pH为11的条件下能反应生成红色物质，该物质在515nm处有最大光吸收，通过配制不同已知浓度的鸟氨酸与酸性茚三酮反应，测定其515nm处的吸光值绘制标准曲线。由标准曲线可计算鸟氨酸浓度(mol/mL)。(2)精氨酸摩尔转化率的测定将菌体接种到50mL液体培养基中于33℃培养24h。培养好的发酵液4℃下4000r/min离心30min，弃去上清液。将菌体转移至10mL碳酸盐缓冲液中，加入0.15g精氨酸，在30℃下转化24h。6000r/min离心10min，测定上清液中的鸟氨酸浓度，并计算底物精氨酸的摩尔转化率y，以此表示精氨酸酶的活力。本发明测得精氨酸摩尔转化率为98％。y＝nA/nB其中nA为转化液中鸟氨酸的物质的量(mol)；nB为转化液中原始的精氨酸的物质的量(mol)。试验例4本发明中获得的鸟氨酸盐酸盐的检验中试产品经青岛谱尼测试有限公司的第三方检验，各项指标符合美国联邦通讯委员会，L-鸟氨酸盐酸盐USP标准，主要性能指标见表1所示：表1