密封蛋白‑6特异性免疫受体和T细胞表位的制作方法

本发明涉及提供对免疫治疗有用的密封蛋白(Claudin)-6特异性免疫受体(T细胞受体和人工T细胞受体(嵌合抗原受体；CAR))和T细胞表位。

发明背景

免疫系统的进化导致脊椎动物在基于两种类型防御：先天性和过继性免疫的高效网络中。

与依赖于识别与病原体有关联的常见分子模式的不变受体的进化的古老先天性免疫系统相比，过继性免疫是基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体和克隆选择。

然而，B细胞通过分泌抗体提高体液免疫反应，T细胞介导导致被识别细胞的破坏的细胞免疫反应。

在人类和动物中，T细胞在细胞介导的免疫中发挥核心作用。特定抗原的识别和结合是由T细胞表面表达的T细胞受体(TCR)介导的。

T细胞的T细胞受体(TCR)能够与结合到主要组织相容性复合体(MHC)分子并且呈现在靶细胞表面的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内部的信号级联，导致增殖和分化为成熟的效应T细胞。为了能够靶向各种各样的抗原，T细胞受体需要具有极大的多样性。

这种多样性是通过对为TCR的不同结构区指定遗传密码的基因的不同不连续片段进行基因重排获得的。TCR是由一条α链和一条β链，或由一条γ链和一条δ链组成。TCR的α/β链是由涉及抗原识别的N末端高度多态性可变区和不变的恒定区组成。在基因水平，这些链被分成几个区：可变(V)区、多样性(D)区(只有β和δ链)、连接(J)区和和恒定(C)区。人β链基因包含超过60个可变(V)片段、2个多样性(D)片段、超过10个连接片段，和2个恒定区片段(C)。人α链基因包含超过50个V片段，和超过60个J片段，但是没有D片段，和一个C片段。小鼠β链基因包含超过30个可变(V)片段、2个多样性(D)片段、超过10个连接片段，和2个恒定区片段(C)。小鼠α链基因包含差不多100个V片段，超过60个J片段，没有D片段，但有一个C片段。在T细胞分化的期间，特异性T细胞受体基因通过对一个V、一个D(只有β和δ链)、一个J和一个C区基因进行重排来产生。TCR的多样性是通过不精确的V-(D)-J重排进一步扩大的，其中在重组位点引进和/或删除随机核苷酸。由于在T细胞成熟期间TCR基因座的重排发生在基因组中，每个成熟T细胞只表达一种特异性α/βTCR或γ/δTCR。

MHC和抗原结合是由TCR的互补决定区1、2和3(CDRl、CDR2、CDR3)介导的。对抗原识别和结合最关键的β链的CDR3，是由重排的TCRβ链基因的V-D-J连接来编码的。TCR是复杂的信号转导机构的一部分，该机构包括TCRα链和β链的异二聚体复合体，共受体CD4或CD8和CD3信号转导模块(图1)。然而，CD3链传递细胞内部的激活信号，TCRα/β异二聚体仅负责抗原识别。因此，TCRα/β链的传递，为重定向T细胞指向任何目标抗原提供了机会。

免疫治疗

抗原特异性免疫治疗旨在增强或诱导患者的特异性免疫反应，以控制传染性或恶性的疾病。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定，导致用于免疫治疗的合适靶标的广泛收集。可以通过主动或被动免疫策略来特异性地靶向呈现来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。

主动免疫趋向于诱导和扩增患者内的抗原特异性T细胞，其能够特异性识别和杀伤病变细胞。相反，被动免疫依赖于T细胞的过继性转移，其在体外扩增并任选地进行基因工程化(过继性T细胞治疗)。

疫苗接种

肿瘤疫苗旨在通过主动免疫诱导内源性肿瘤特异性免疫反应。不同的抗原形式可以用于肿瘤疫苗接种，包括全部癌细胞、蛋白质、肽或诸如RNA、DNA的免疫载体或病毒载体，它们可以通过脉冲刺激DC直接在体内或在体外应用，接着转移到患者内。

由于免疫策略和检测抗原特异性免疫反应的方法的改进，可以鉴定治疗诱导的免疫反应的临床研究数稳定增加(Connerotte,T.et al.(2008).Cancer Res.68.393 1-3940；Schmitt,M.et al.(2008)Blood 1 1 1,1357-1365；Speiser.D.E.et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105,3849-3854；Adams,S.et al.(2008)J.Immunol.181,776-784)。

然而，在大部分情况下，检测到的免疫反应不能系统地与临床结果相关联(Curigliano,G.et al.(2006)Ann.Oncol.17.750-762；Rosenberg.S.A.et al.(2004)Nat.Med.10,909-915)。

因此，源于肿瘤抗原的肽表位的准确确定，可有助于改善接种策略的特异性和效率以及用于免疫监测的方法。

过继性细胞转移(ACT)

基于ACT的免疫治疗可以概括地定义为用预先敏化的T细胞进行被动免疫的形式，所述T细胞经从低前体频率到临床相关细胞数量的体外扩增之后被转移到非免疫受体或到自体宿主。已经用于ACT实验的细胞类型是淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Mule,J.J.et al.(1984)Science 225,1487-1489；Rosenberg,S.A.et al.(1985)N.Engl.J.Med.3 13,1485-1492)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)(Rosenberg,S.A.et al.(1994)J.Natl.Cancer Inst.86,1 159-1 166)、造血干细胞移植后的供体淋巴细胞(HSCT)和肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley,M.E.et al.(2001)J.Immunother.24,363-373；Yee,C,et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99,16168-16173)。过继性T细胞转移已显示出针对诸如CMV的人类病毒感染具有治疗活性。然而在健康对象中，CMV感染和内源性潜伏的病毒的再激活是由免疫系统控制的，这导致在诸如移植受体或AIDS患者的免疫受损对象中显著的发病率和死亡率。

Riddell和同事证明，转移源自HLA匹配的CMV血清反应阳性的移植供体的CD8+CMV特异性T细胞克隆后，通过过继性T细胞治疗来重建免疫抑制患者的抗病毒免疫力(Riddell,S.R.(1992)Science 257,238-241)。

作为可供选择的方法，将源自多克隆供体的CMV或EBV特异性T细胞群转移到移植受体，导致了转移的T细胞增加的持久性(Rooney,CM.et al.(1998)Blood 92,1549-1555；Peggs,K.S.et al.(2003)Lancet362,1375-1377)。

对于黑色素瘤的过继性免疫治疗，Rosenberg和同事建立了依赖于输注体外扩增的分离自切除的肿瘤的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)与非清髓性淋巴排除化疗和高剂量IL2联合的ACT方法。最近公布的临床研究，导致受治疗的转移性黑色素瘤患者～50％的客观反应率(Dudley,M.E.et al.(2005)J.Clin.Oncol.23:2346-2357)。

然而，患者必须满足几个前提以有资格进行ACT免疫治疗。他们必须具有可切除的肿瘤。在细胞培养条件下肿瘤必须形成有生存力的TIL。TIL针对肿瘤抗原必须是反应性的，而且必须在体外扩增到足够的数量。尤其是在非黑色素瘤的其他癌症中，获得此类肿瘤反应性的TIL很困难。此外，对正常人T淋巴细胞进行反复体外刺激和克隆扩增，导致端粒酶活性逐渐降低和端粒缩短，从而导致转移的T细胞的复制性衰老和降低的潜在持久性(Shen,X.et al.(2007)J.tmmunother.30:123-129)。

使用基因工程化的T细胞的ACT

克服ACT局限性的方法是自体T细胞的过继性转移，所述T细胞在短期体外培养期间被重新编程以表达具有确定的特异性的肿瘤反应性免疫受体，随后被输注至患者体内(Kershaw M.FI.et al.(2013)Nature Reviews Cancer 13(8):525-41)。这一策略使得ACT适用于各种各样常见的恶性肿瘤，即使肿瘤反应性T细胞在患者中不存在。由于T细胞的抗原特异性在TCRα-和β-链的异二聚体复合体上是完全静止的，将克隆的TCR基因转移至T细胞提供了将它们重新定向至任何目标抗原的可能性。因此，TCR基因治疗为用自体淋巴细胞发展抗原特异性免疫治疗作为治疗方案提供了有吸引力的策略。TCR基因转移的主要优势是，在几天内产生治疗量的抗原特异性T细胞，以及引进在患者的内源性TCR所有组成成分中不存在的特异性的可能性。

几个团队证明，TCR基因转移是重新定向原始T细胞抗原特异性的有吸引力的策略(Morgan,R.A.et al.(2003)J.Immunol.171,3287-3295；Cooper,L.J.et al.(2000)J.Virol.74,8207-8212；Fujio.K.et al.(2000)J.Immunol.165,528-532:Kessels,H.W.et al.(2001)Nat.Immunol.2,957-961；Dembic,Z.et al.(1986)Nature 320,232-238)。

最近由Rosenberg和他的团队在恶性黑色素瘤治疗的临床试验中证明，在人类中进行TCR基因治疗的可行性。用黑色素瘤/黑色素细胞抗原特异性TCR逆转录病毒转导的自体淋巴细胞进行过继性转移，导致所治疗的黑色素瘤患者的癌症退化多达30％(Morgan,R.A.et al.(2006)Science 314,126-129；Johnson,L.A.et al.(2009)Blood 1 14,535-546)。

嵌合抗原受体

嵌合抗原受体(CAR)是工程化受体，其将单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与包含用于T细胞激活的一种或多种信号转导结构域的细胞内部分联合。CAR以非MHC限制性的方式识别天然抗原，并且可以因此用于所有的对象中，无论他们的HLA类型是什么，并且它们在CD4+T细胞和CD8+T细胞中是功能化的。

在过去的十年里已经报道了大量的CAR，靶向一组不同的细胞表面肿瘤抗原。通过并入共刺激结构域，它们的生物功能显著地改进，而产生了三体受体(scFv,CD28,CD3ζ)，被称为第二代CAR。第三代CAR包含诸如OX40和4-1BB的共刺激分子的其他结构域，以增强改进的T细胞的增殖能力和持久性(图2)。

用于抗原特异性免疫治疗的靶结构

多种肿瘤相关抗原(TAA)的发现，已经为抗原特异性免疫治疗的概念提供了基础(ovellino,L.et al.(2005)Cancer Immunol.Immunother.54,187-207)。由于它们的遗传不稳定性，TAA是在肿瘤细胞上表达的不寻常蛋白质，其在正常细胞中不表达或有限表达。这些TAA可以通过免疫系统引起对恶性细胞的特异性识别。

通过使用自体肿瘤特异性T细胞(van der Bruggen,P.et al.(1991)Science 254,1643-1647)，或循环抗体(Sahin,U.et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92,1 1810-1 1813)，反向免疫学方法、生物化学方法(Hunt,D.F.et al.(1992)Science 256,1817-1820)，基因表达分析或在硅片克隆策略(Helftenbein,G.et al.(2008)Gene 414,76-84)，进行肿瘤来源的cDNA表达库筛选，TAA分子克隆产生了用于免疫治疗策略的相当数量的目标候选物。TAA分为几类，包括分化抗原、过表达抗原、肿瘤特异性剪接变异体、突变基因产物、病毒和癌睾丸抗原(CTA)。癌睾丸家族是TAA非常有希望的类别，因为它们的表达受限于睾丸和大量不同的肿瘤实体(Scanlan,M.J.et al.(2002)Immunol.Rev.188,22-32)。迄今为止，已经描述了超过50CT的基因(Scanlan,M.J.et al.(2004)Cancer Immun.4,1)，并且它们中的一些已经处在临床研究中(Adams,S.et al.(2008)J.Immunol.181,776-784；Atanackovic,D.et al.(2004)J.Immunol.1 72,3289-3296；Chen,Q.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101,9363-9368:Connerotte.T.et al.(2008).Cancer Res.68,3931-3940；Davis.I.D.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101,10697-10702；Jager,E.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97.12198-12203；Marchand,M.et al.(1999)Int.J.Cancer 80,219-230；Schuler-Thurner,B.et al.(2000)J.Immunol.165,3492-3496)。

尽管用于免疫治疗方法的有吸引力的靶结构数目越来越多，确定的HLA限制的特异性T细胞克隆或系只针对它们中的几个存在(Chaux,P.et al.(1999)J.Immunol.163.2928-2936；Zhang.Y.et al.(2002)Tissue Antigens 60,365-371；Zhao,Y.et al.(2005)J.Immunol.174.4415-4423)。

密封蛋白是位于上皮细胞和内皮的紧密连接内的整合膜蛋白。密封蛋白预计具有含有两个胞外环的四个跨膜片段，而且N和C末端位于细胞质内。跨膜蛋白的密封蛋白(CLDN)家族，在维持上皮和内皮紧密连接中发挥着核心作用，而且也可能在维持细胞骨架和信号传导中发挥作用。

密封蛋白-6(CLDN6)是在小鼠和人干细胞以及决定上皮细胞命运的拟胚体中表达的癌胚基因(Turksen,K.et al.(2001)Dev Dyn 222,292-300；Anderson WJ.et al.(2008)Dev Dyn 237,504-12；Turksen K.et al.(2002)Development.129,1775-84；Assou S.et al.(2007)Stem Cells25.961-73)。由于肿瘤相关的抗原在对表皮分化和屏障形成至关重要的表皮形态发生早期表达，将其归类为分化抗原。此外，在舌、皮肤、胃和乳房的上皮组织或新生儿正常上皮组织中也观察到表达(Abuazza G.et al.(2006),Am J Physiol Renal Physiol 291.1 132-1 141；Troy T.C.et al.(2007),Molecular Biotechnology 36.166-74；Zhao L.et al.(2008),Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294,1856-1862)。除此之外，拥有的数据也显示，在人胎盘、膀胱、子宫内膜、前列腺和外周神经中有低或极低的CLDN6表达，以及在不同癌症中有频繁的过表达。已经证明，CLDN6在的肿瘤中过表达，包括儿童脑瘤、胃腺癌和生殖细胞肿瘤以及诸如卵巢癌的内脏瘤(图4)。也已经证明，在胃癌细胞中CLDN6的过表达导致增加的浸润、迁移和增殖，这表明CLDN6是不良预后的标记，而且可能在维持恶性表型中发挥潜在作用。另外，已经显示，CLDN6通过在乳腺癌细胞系中抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡起到癌症抑制作用。

肿瘤上CLDN6的频繁过表达，使这个分子有资格作为高度有吸引力的靶标，用于发展定向针对CLDN6的疗法，诸如疫苗疗法和治疗性抗体。然而，迄今还没有描述过HLA-A*2限制性CLDN6T细胞表位和靶向T细胞受体的CLDN6，并且使用主动或被动免疫方法通过涉及T细胞的免疫治疗，表达CLDN6的癌症细胞是否能够在体内被靶向是未知的。

发明描述

发明概述

本发明涉及对肿瘤相关抗原CLDN6具有特异性的T细胞受体和人工T细胞受体，尤其当出现在诸如病变细胞的细胞表面，或呈现在诸如病变细胞或抗原提呈细胞的细胞表面，以及包含被这些T细胞受体识别的表位(例如CLDN6-T细胞表位)的的肽。

通过过继性转移工程化的T细胞以表达此类T细胞受体或人工T细胞受体，可以特异性靶向表达CLDN6的肿瘤细胞，从而导致选择性破坏癌细胞。此外，根据本发明提供的T细胞表位，对于针对表达CLDN6的癌症设计疫苗是有用的。

一方面，本发明涉及包含选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽。在一实施方案中，所述肽是100或更少、50或更少、20或更少、或10或更少的氨基酸长度。在一实施方案中，可以将所述肽加工以产生由选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成的肽。在一实施方案中，所述肽由选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成。

在一实施方案中，所述肽是MHC I类或II类提呈的肽，优选为MHC I类提呈的肽，或者，如果出现在细胞内，可以被加工以产生其加工产物，其是MHC I类或II类提呈的肽，优选为MHC I类提呈的肽。优选地，所述MHC I类或II类提呈的肽具有与给定的氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体)基本上相一致的序列。优选地，根据本发明的肽能够刺激针对这样的疾病的细胞反应，该疾病涉及以提呈CLDN6和I类MHC为特征的细胞。

在进一步的方面，本发明涉及包含编码本发明肽的核苷酸序列的核酸和包含该核酸的细胞。所述核酸可以是重组核酸。所述核酸可以出现在质粒或表达载体中，并且可以功能地连接到启动子。在一实施方案中，所述核酸是RNA。优选地，所述细胞表达所述肽。所述细胞可以是重组细胞，并且可以分泌所述编码的肽或其加工产物，可以在表面表达它，并且优选地可能还表达能结合所述肽或其加工产物的MHC分子，并且优选地在细胞表面提呈所述肽或其加工产物。在又一实施方案中，细胞内源性地表达MHC分子。在进一步的实施方案中，所述细胞以重组的方式表达MHC分子和/或所述肽。优选地，所述细胞是非增殖的。在一优选实施方案中，所述细胞是抗原提呈细胞，尤其是树状细胞、单核细胞或巨噬细胞。

在进一步的方面，本发明涉及提呈本发明的肽或其加工产物的细胞，其中优选地加工产物是具有给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体)的肽。在一实施方案中，所述细胞是包含含有编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸的细胞。优选地，所述细胞表达所述核酸以便产生所述肽。任选地，所述细胞加工所述肽，以便产生由选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成的肽。所述细胞可以通过它表面的MHC分子提呈所述肽或其加工产物。在一实施方案中，所述细胞内源性地表达MHC分子。在进一步的实施方案中，所述细胞重组表达MHC分子。在一实施方案中，通过添加肽到细胞，使细胞的MHC分子加载(脉冲)有肽。所述细胞可以重组表达所述肽，并且在细胞表面提呈所述肽或其加工产物。优选地，所述细胞是非增殖的。在一优选的实施方案中，所述细胞是诸如树状细胞、单核细胞或巨噬细胞的抗原提呈细胞。

在进一步的方面，本发明涉及与本发明的肽反应的免疫反应性细胞，尤其当提呈在诸如病变细胞的细胞表面时。所述免疫反应性细胞可以是已经体外敏化以识别所述肽的细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选地细胞毒性T细胞。优选地，所述免疫反应性细胞能结合与给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体)基本上相一致的序列，尤其当结合MHC，如在诸如病变细胞的细胞表面上的MHC。

在进一步的方面，本发明涉及能结合本发明的肽的结合剂，任选地所述肽在有MHC分子的复合体中。

在进一步的方面，本发明涉及能结合本发明的肽的T细胞受体或所述T细胞受体的肽链，任选地所述肽在有MHC分子的复合体中，并且优选地所述T细胞受体与所述肽反应。在一实施方案中，所述T细胞受体的肽链是T细胞受体α链或T细胞受体β链。

在进一步的方面，本发明涉及T细胞受体α链或包含所述T细胞受体α链的T细胞受体，

其中所述T细胞受体α链选自：

(i)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28的T细胞受体α链或其变体的CDR序列中的至少一个，优选地两个，更优选地全部三个；和

(ii)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28的T细胞受体α链序列或其片段，或所述序列或片段的变体。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14和16，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:选自SEQ ID NO:18、20、22、24和26，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:是SEQ ID NO:28，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在进一步的方面，本发明涉及T细胞受体β链或包含所述T细胞受体β链的T细胞受体，

其中所述T细胞受体β链选自：

(i)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29的T细胞受体β链或其变体的CDR序列中的至少一个，优选地两个，更优选地全部三个；和

(ii)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29的T细胞受体β链序列或其片段，或所述序列或片段的变体。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15和17，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:选自SEQ ID NO:19、21、23、25和27，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述SEQ ID NO:是SEQ ID NO:29，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在进一步的方面，本发明涉及T细胞受体，其选自：

(I)T细胞受体，包含：

(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO:x的T细胞受体α链或其变体的CDR序列中的至少一个，优选地两个，更优选地全部三个，和

(ii)T细胞受体β链包含SEQ ID NO:x+1的T细胞受体β链或其变体的CDR序列中的至少一个，优选地两个，更优选地全部三个；

其中x选自6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28；和

(II)T细胞受体，包含：

(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO:x的T细胞受体α链序列或其片段，或所述序列或片段的变体，和

(ii)T细胞受体β链包含SEQ ID NO:x+1的T细胞受体β链序列或其片段，或所述序列或片段的变体；

其中x选自6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28。

在一实施方案中，所述x选自6、8、10、12、14和16，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述x选自18、20、22、24和26，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，所述x是28，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的肽反应。

在一实施方案中，当由T细胞表达和/或出现在T细胞上的所述T细胞受体结合如上所述提呈在诸如癌症细胞的细胞上的CLDN6肽表位，则导致所述T细胞的增殖和/或激活，其中所述激活的T细胞优选地释放细胞毒性因子例如穿孔素和颗粒酶，并且引发癌细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡。

在进一步的方面，本发明涉及能结合密封蛋白-6(CLDN6)的人工T细胞受体。在一实施方案中，结合是特异性结合。

在一实施方案中，所述CLDN6在癌细胞中表达。在一实施方案中，所述CLDN6表达在癌细胞表面。在一实施方案中，所述人工T细胞受体能结合胞外结构域或能结合在CLDN6的胞外结构域中的表位。在一实施方案中，所述人工T细胞受体能结合出现在活细胞表面的CLDN6的天然表位。在一实施方案中，所述人工T细胞受体能结合CLDN6的第一胞外环。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或出现在T细胞上的所述人工T细胞受体结合出现在诸如癌症细胞的细胞上的CLDN6，则导致所述T细胞的增殖和/或激活，其中所述激活的T细胞优选地释放细胞毒性因子例如穿孔素和颗粒酶，并且引发癌细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含针对CLDN6的结合域。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域被包含在所述人工T细胞受体的外结构域。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含CLDN6抗体的单链可变区片段(scFv)。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含对CLDN6具有特异性(VH(CLDN6))的免疫球蛋白的重链可变区(VH)和对CLDN6具有特异性(VL(CLDN6))的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)。在一实施方案中，所述重链可变区(VH)和所述相应的轻链可变区(VL)是通过肽接头连接，优选地肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)3。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体的VH(CLDN6)。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含含有SEQ ID NO:33、38或39所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体的VL(CLDN6)。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体的VH(CLDN6)，以及含有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体的VL(CLDN6)。在一实施方案中，针对CLDN6的结合域包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含跨膜结构域。在一实施方案中，所述跨膜结构域是跨膜的疏水α螺旋。在一实施方案中，所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域或其片段。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含T细胞信号转导结构域。在一实施方案中，所述T细胞信号转导结构域位于细胞内。在一实施方案中，所述T细胞信号转导结构域包含CD3-ζ，优选CD3-ζ的胞内结构域，任选地与CD28组合。在一实施方案中，所述T细胞信号转导结构域包含SEQ ID NO:45的序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含指导初生蛋白进入内质网的信号肽。在一实施方案中，所述信号肽领先针对CLDN6的结合域。在一实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:42的序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含将所述针对CLDN6结合域连接至所述跨膜结构域的间隔区。在一实施方案中，所述间隔区允许针对CLDN6的结合域定向不同方向以促进CLDN6的识别。在一实施方案中，所述间隔区包含SEQ ID NO:43的序列或其片段，或所述序列或片段的变体。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含以下结构：

NH2-信号肽-针对CLDN6的结合域-间隔区-跨膜结构域-T细胞信号转导结构域-COOH。

在一实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含SEQ ID NO:46的序列或其片段，或所述序列或片段的变体。

优选地，上述T细胞受体和人工T细胞受体是特异性针对肿瘤相关抗原CLDN6的，尤其当出现在诸如病变细胞的细胞表面时，或当提呈在诸如病变细胞或抗原提呈细胞的细胞表面时。

本发明的T细胞受体和人工T细胞受体，可以由诸如T细胞的细胞表达和/或出现在诸如T细胞的细胞表面。

在进一步的方面，本发明涉及包含编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体或者编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸的核酸。在一实施方案中，所述核酸是重组核酸。在一实施方案中，所述核酸是载体的形式或RNA的形式。

在进一步的方面，本发明涉及包含本发明的T细胞受体链或T细胞受体或本发明的人工T细胞受体和/或包含含有编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸的核酸的细胞。在一实施方案中，所述核酸是RNA，优选地体外转录的RNA。所述细胞可以是表达本发明的T细胞受体链或T细胞受体或本发明的人工T细胞受体的细胞，和/或可以在它的细胞表面具有本发明的T细胞受体链或T细胞受体或本发明的人工T细胞受体。在一实施方案中，所述细胞是对过继性细胞转移有用的细胞。所述细胞可以是效应器或干细胞，优选地免疫反应性细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选地细胞毒性T细胞。在一实施方案中，所述免疫反应性细胞与肿瘤相关抗原CLDN6具有反应性。在一实施方案中，将所述CLDN6提呈在诸如病变细胞的细胞表面。在一实施方案中，将所述CLDN6提呈在诸如病变细胞或抗原提呈细胞的细胞表面，并且所述免疫反应性细胞与本发明的肽具有反应性，尤其当在MHC的背景下被提呈，并且优选地能结合与给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体)基本上相一致的序列。在一实施方案中，所述细胞缺乏内源性TCR的表面表达，或针对CLDN6无关抗原具有特异性。

在一实施方案中，在用于过继性细胞转移之前，使本发明的细胞遭受抗原特异性扩增和再激发(rechallenge)，其中所述抗原特异性扩增和再激发可能受到将细胞暴露于优选地提呈CLDN6或其肽片段的自体抗原提呈细胞的影响。

在进一步的方面，本发明涉及产生免疫反应性细胞的方法，其包括用包含编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的核酸来转导T细胞的步骤。

此外，本发明通常包含通过靶向诸如癌细胞，尤其是表达CLDN6的癌细胞的病变细胞进行疾病治疗。所述方法提供选择性消灭在它们的表面表达和/或提呈肿瘤相关抗原CLDN6的细胞，从而最小化对不表达和/或不提呈CLDN6的正常细胞的不利影响。因此，用于治疗的优选疾病是，诸如癌症疾病的其中表达和任选地提呈CLDN6的那些，尤其是本文描述的那些疾病。

当给予本发明的肽、包含编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸或包含所述核酸的本发明的细胞时，优选地治疗包括主动免疫。优选地，使CLDN6特异性T细胞在患者体内扩增，其能够识别和杀伤病变细胞。当给予本发明的免疫反应性细胞、本发明的T细胞受体、本发明的人工T细胞受体、包含编码本发明的T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸的本发明的核酸、或包含本发明的T细胞受体或人工T细胞受体和/或包含含有编码本发明的T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸的本发明的核酸的细胞时，优选地治疗包括被动免疫。优选地，将能够识别和杀伤病变细胞并且任选地在体外基因工程化和/或扩增的CLDN6特异性T细胞过继性地转移给患者。

在一方面，本发明涉及包含以下一种或多种的药物组合物：

(i)本发明的肽；

(ii)本发明的核酸；

(iii)本发明的细胞；

(iv)本发明的免疫反应性细胞；

(v)本发明的结合剂；

(vi)本发明的T细胞受体；和

(vi)本发明的人工T细胞受体。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体，并且可任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。所述药物组合物可以是治疗性或预防性疫苗的形式。在一实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防诸如本文描述的那些癌症疾病。

如上所述的药物组合物的给予，可以提供能够诱发针对CLDN6的CD4+辅助T细胞反应和/或CD8+T细胞反应的MHC II类提呈的表位(包括在它们的表面表达CLDN6和/或在MHC分子的背景下提呈CLDN6的细胞)。可选地或此外，如上所述药物组合物的给予，可以提供能够诱发针对CLDN6的CD8+T细胞反应的MHC I类提呈的表位。

在进一步的方面，本发明涉及治疗或预防癌症疾病的方法，其包括给予患者本发明的药物组合物。

在进一步的方面，本发明涉及用于治疗、尤其是用于治疗或预防癌症的本发明的肽、本发明的核酸、本发明的细胞、本发明的免疫反应性细胞、本发明的结合剂、本发明的T细胞受体或本发明的人工T细胞受体。

另一方面涉及用于在对象中诱导免疫反应的方法，其包括给予对象本发明的药物组合物。

另一方面涉及用于刺激、启动和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下一种或多种接触：本发明的肽、包含编码本发明的肽的核苷酸序列的本发明的核酸、包含所述核酸的本发明的细胞和/或提呈本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞。在一实施方案中，在MHC分子如细胞(例如抗原提呈细胞)表面上的MHC分子的背景下提呈本发明的肽。

在这一方面，本发明可以涉及用于制备CLDN6特异性T细胞的方法。可以在体内或体外刺激、启动和/或扩增所述T细胞。优选地，所述T细胞存在于从对象获得的样品中。可以将刺激的、启动的和/或扩增的所述T细胞给予对象，并且对对象可以是自体的、同种异体的、同基因的。

在上述方面本发明的用于在对象中诱导免疫反应的方法，或用于刺激、启动和/或扩增T细胞的方法，可以涉及用于治疗对象中癌症疾病的方法。

另一方面涉及杀伤对象中的癌细胞的方法，其包括向对象提供治疗有效量的本发明的肽、本发明的核酸、本发明的细胞、本发明的免疫反应性细胞、本发明的结合剂、本发明的T细胞受体、或本发明的人工T细胞受体的步骤。

优选地，本文描述的组合物和试剂能够诱导或促进针对以表达CLDN6和/或提呈CLDN6和I类MHC为特征的疾病(例如癌症疾病)的细胞反应，优选地，细胞毒性T细胞活性。

在一方面，本发明提供用于本文描述的治疗方法的本文描述的试剂和组合物。

可以将本文描述的癌症疾病治疗与外科手术和/或辐射和/或传统的化疗结合。

在另一方面，本发明涉及用于确定对象中免疫反应的方法，其包含在分离自所述对象的生物样品中确定与本发明的肽或提呈本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞具有反应性的T细胞。所述方法可以包含以下步骤：

(a)将包含分离自对象的T细胞的样品与以下一种或多种一起孵育：

(i)本发明的肽；

(ii)包含编码本发明的肽的核苷酸序列的本发明的核酸；和

(iii)包含所述核酸的本发明的细胞，或提呈本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞；

以及

(b)检测T细胞的特异性激活，由此确定在所述对象中存在或不存在免疫反应。

在上述方面本发明的用于确定在对象中免疫反应的方法，可以涉及用于诊断对象中癌症疾病的方法。

在用于诊断的方法的一个实施方案中，生物样品来自于组织或器官，其中当组织或器官是无病状态时，细胞基本上不表达CLDN6。

通常，将在生物样品中的T细胞水平与参考水平比较，其中从所述参考水平的偏差指示对象中疾病的存在和/或阶段。参考水平可以是在对照样品中确定的水平(例如：从健康组织或对象)或来自健康对象的中值水平。从所述参考水平的“偏差”指明任何显著的变化，诸如至少10％、20％或30％，优选地至少40％或50％，或更多的增加。优选地，相对于参考水平，在所述生物样品中T细胞的出现，或在生物样品中T细胞的量的增加，表明疾病的存在。

T细胞可以分离自患者外周血、淋巴结、诸如来源于活组织检查和切除术或其他来源的组织样品。反应性分析可以在原始T细胞或其他合适的派生物上进行。例如，可以将T细胞融合以形成杂交瘤。用于测量T细胞反应性的分析是本领域已知的，并且包括增殖分析和细胞因子释放分析。

用于检测反应性T细胞的分析和指标，包括但不限于采用IFNγELISPOT和IFNγ胞内细胞因子染色。其他多种用于确定T细胞克隆是否将对特定肽应答的方法是本领域已知的。通常，在一到三天时间内将肽加入到T细胞悬浮液中。T细胞应答可以通过增殖如标记的胸苷的摄取，或通过细胞因子如IL-2的释放来测量。多种分析可用于检测释放的细胞因子的存在。T细胞的细胞毒性分析，可用于检测对抗原具有特异性的细胞毒性T细胞。在一实施方案中，测试细胞毒性T细胞杀伤用MHC I类分子提呈抗原的靶细胞的能力。可以将提呈抗原的靶细胞标记，并且加到来自患者样品的T细胞悬浮液中。可以通过定量来自溶解细胞的标签的释放来测量细胞毒性。在分析中可以包括自发的和总释放的对照。

在本发明的一实施方案中，本文描述的癌症包含表达C LDN6和/或在MHC分子的背景下提呈CLDN6的癌细胞。在本发明的一实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一实施方案中，诸如癌细胞的病变细胞是表达CLDN6和/或在MHC分子的背景下提呈CLDN6的细胞。在一实施方案中，CLDN6的表达是在病变细胞的表面上。

在本发明的一实施方案中，癌症选自：膀胱癌；卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移行细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠的癌症，尤其是小肠腺癌和回肠的腺癌；睾丸胚胎性癌；胎盘绒毛膜癌；宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；子宫癌，；生殖细胞肿瘤如畸胎瘤或胚胎性癌，尤其是睾丸的生殖细胞肿瘤；以及它们的转移性形式。

在本发明的一实施方案中，癌细胞是选自下述癌症的癌细胞：膀胱癌；卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移行细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠的癌症，尤其是小肠腺癌和回肠的腺癌；睾丸胚胎性癌；胎盘绒毛膜癌；宫颈癌；睾丸癌，尤其睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；子宫癌；生殖细胞肿瘤如畸胎瘤或胚胎性癌，尤其是睾丸的生殖细胞肿瘤；以及它们的转移性形式。

根据本发明，优选地，CLDN6具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列。

本发明的其他特征和优势，将从下面的详细描述和权利要求中显示出来。

发明详述

尽管下面详细描述本发明，但应理解本发明并不局限于本发明描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。也要理解的是，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不是为了限定本发明的范围，其只能通过所附的权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员的常规理解相同的意思。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素用特定的实施方案列出，然而应理解的是，它们可以以任何方式和任何数量结合以产生另外的实施方案。不应将各种描述的实施例和优选实施方案视为是将本发明仅限于明确描述的实施方案。应将这一描述理解为支持和包含那些将明确描述的实施方案与任何数量公开的和/或优选的要素结合的实施方案。此外，除非上下文另有指出，本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应被看做是通过本申请的描述被公开。

优选地，将本文使用的术语依照以下文献中的描述来定义："A multilingual glossar of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)(多语言生物技术术语词汇表：(IUPAC推荐))",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Kolbl,Eds.,(1995)Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland。

除非另有指出，本发明的实践将使用在本领域的文献中解释的生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法。(cf,e.g..Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(分子克隆：实验手册，第二版),J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

除非上下文另有要求，贯穿这一说明书和其所附的权利要求，词语“包含”("comprise")和其变化如“包含”("comprises")和“包含”("comprising")，将理解成意味着包含所述的成员、整体或步骤或者成员、整体或步骤的组，但不排除任何其他的成员、整体或步骤或者成员、整体或步骤的组，尽管在一些实施方案中可以将该其他的成员、整体或步骤或者成员、整体或步骤的组排除，即该主题由所述的成员、整体或步骤或者成员、整体、步骤或组所含的内容组成。除非本文另有指出，或上下文明显矛盾，将在描述本发明的上下文中(特别在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”("a/an")和"the"以及类似的参考，视为覆盖单数和复数。本文数值范围的详述，仅仅是作为单独提及落入范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另有指出，将每个单独的数值并入说明书，犹如将它在本文单独例举。

除非本文另有指出，或另有上下文明显矛盾，可以以任何合适的顺序执行本文描述的所有方法。本文提供的任何和所有的实施例或典型性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅是为了更好地阐明本发明并且不造成对本发明范围的限制，否则会声明。不应将说明书中的语言视为是表明，任何非权利要求的要素对本发明的实践是必不可少的。

几篇文献贯穿这一说明书文本被引用。本文引用的每一文献(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、生产商的说明书、说明等)，无论在前文或下文，通过引用将其全部内容在此并入。本文没有被视为承认本发明无权凭借先前发明先于此类公开。

在本发明背景下的术语“重组”，意思是“通过基因工程产生”。优选地，在本发明背景下的“重组对象”如重组细胞，不是自然发生的。

本文使用的术语“自然发生”，指的是在自然中能够找到的对象的事实。例如，在有机体中存在(包括病毒)并且能够从自然中的来源分离，并且还没有在实验室中有意地人为修改的肽或核酸是自然发生的。

术语“免疫反应”指的是对抗原的综合身体反应，优选地指的是细胞免疫反应或细胞和体液的免疫反应。免疫反应可以是防护的/预防的/预防疾病的和/或治疗的。

“诱导免疫反应”意思可以是在诱导之前针对特定抗原没有免疫反应，但是意思也可以是在诱导前针对特定抗原有一定水平的免疫反应并且在诱导后所述免疫反应增强。因此，“诱导免疫反应”也包括“增强免疫反应”。优选地，在对象中诱导免疫反应后，所述对象免受发展诸如癌症疾病的疾病，或通过诱导免疫反应改善疾病状况。例如，可以在具有癌症疾病的患者或有发展成癌症疾病风险的对象中，诱导针对肿瘤相关抗原如CLDN6的免疫反应。在这种情况下诱导免疫反应意思可以是改善对象的疾病状况，对象不发展成转移，或有发展成癌症疾病风险的对象不发展成癌症疾病。

“细胞免疫反应”、“细胞反应”、“针对抗原的细胞反应”或类似的术语，意思是包括指向以用MHC I类或II类提呈抗原为特征的细胞的细胞反应。细胞反应涉及叫做T细胞或充当“辅助对象”或“杀手”的T淋巴细胞。辅助T细胞(也叫做CD4⁺T细胞)通过调节免疫反应发挥核心作用，而杀伤细胞(也叫做细胞毒性T细胞、细胞溶解T细胞、CD8⁺T细胞或CTL)杀伤诸如癌细胞的病变细胞，防止产生更多病变细胞。

术语“抗原”涉及包含表位的试剂，针对表位能产生和/或指导免疫反应。优选地，在本发明背景下，抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子，优选地该免疫反应针对所述抗原或表达和/或提呈抗原的细胞具有特异性。术语“抗原”尤其包括蛋白质和肽。优选地，抗原相当于或来源于自然发生的抗原的产物。此类自然发生的抗原可以包括或可以来源于肿瘤相关的抗原。

具体地，抗原或其肽片段应该能被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别，抗原或肽能够在合适的共刺激信号存在时，诱导携带有识别抗原或肽的T细胞受体的T细胞进行克隆扩增。在本发明的实施方案的背景下，优选地，抗原由细胞提呈，优选地由抗原提呈细胞和/或病变细胞提呈，在MHC分子的背景下，其可以导致针对抗原(或提呈抗原的细胞)的免疫反应。

在优选的实施方案中，抗原可以是肿瘤相关抗原，即癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核，尤其是那些优选地大量产生的、细胞内的或作为癌细胞表面抗原的抗原。

在本发明的背景下，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”涉及正常情况下在有限数目的组织和/或器官或在特定的发展阶段特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤相关抗原正常情况下可在胃组织，优选地胃黏膜特异性表达，在生殖器官例如睾丸，在滋养层组织例如胎盘，或在生殖细胞系细胞，并且在一种或多种肿瘤或癌组织表达或异常表达。关于这点，优选地，“有限数目”意思是不超过3，更优选地不超过2。在本发明的背景下，肿瘤相关抗原包括，例如，分化抗原，优选地细胞类型特异性分化抗原，即正常情况下在某一细胞类型的某一分化阶段特异性表达的蛋白质，癌症/睾丸抗原，即正常情况下在睾丸和有时在胎盘特异性表达的蛋白质，以及生殖细胞系特异性抗原。在本发明的背景下，肿瘤相关抗原优选地与癌细胞的细胞表面相关，并且优选地在正常组织不表达或只很少地表达。优选地，肿瘤相关抗原或异常表达的肿瘤相关抗原能识别癌细胞。在本发明的背景下，由对象例如患有癌症疾病的患者中的癌细胞表达的肿瘤相关抗原，优选地是在所述对象中的自蛋白。在优选的实施方案中，在本发明的背景下的肿瘤相关抗原正常情况下特异性地在非必要的组织或器官(即当被免疫系统破坏时不会导致对象死亡的组织或器官)，或在免疫系统不能或仅很难进入的身体器官或结构中表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤相关抗原和癌组织中表达的肿瘤相关抗原之间，肿瘤相关抗原的氨基酸序列是完全相同的。优选地，肿瘤相关抗原由在其中表达它的癌细胞提呈。

本发明的多个方面包含肿瘤相关抗原CLDN6，并且本发明可以包含针对表达所述肿瘤相关抗原，以及优选地用I类MHC提呈所述肿瘤相关抗原的癌细胞的抗肿瘤CTL反应的刺激和提供。

密封蛋白是作为紧密连接的非常重要成分的蛋白质家族，在那它们建立控制上皮细胞之间细胞间隙中分子流动的细胞旁路屏障。密封蛋白是N末端和C末端的末端都位于细胞质中的跨越膜4次的跨膜蛋白。第一个细胞外环，叫做EC1或ECL1，平均包含53个氨基酸，并且第二个细胞外环，叫做EC2或ECL2，大约包含24个氨基酸。密封蛋白家族的细胞表面蛋白如CLDN6，在各种来源的肿瘤中表达，并且由于它们的选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)和定位在质膜，特别适合作为与抗体介导的癌症免疫治疗相关的靶结构。

已经鉴定CLDN6在肿瘤组织中区别表达，唯一表达CLDN6的正常组织是胎盘。

已经发现CLDN6在例如，卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌中表达。CLDN6是特别优选的用于预防和/或治疗以下疾病的靶标：卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱的癌症，尤其是移行细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠的癌症，尤其是小肠腺癌和回肠的腺癌；睾丸胚胎性癌；胎盘绒毛膜癌；宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；子宫癌；生殖细胞肿瘤如畸胎瘤或胚胎性癌，尤其是睾丸的生殖细胞肿瘤；以及它们的转移性形式。在一实施方案中，与CLDN6表达相关的癌症疾病选自：卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，卵巢癌是癌或腺癌。优选地，肺癌是癌或腺癌，并且优选地是支气管癌症，如支气管癌或支气管腺癌。

本文使用的术语“CLDN”意思是密封蛋白，并且包括CLDN6。优选地，密封蛋白是人密封蛋白。术语“CLDN6”涉及密封蛋白6，并且包括其任何变体。

优选地术语“CLDN6”涉及人CLDN6，并且，尤其涉及包含，优选地由序列表的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成的蛋白质。优选地，CLDN6的第一个细胞外环包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸或SEQ ID NO:2所示的氨基酸的氨基酸28-80，更优选地氨基酸28-76。优选地，CLDN6的第二个细胞外环包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸或SEQ ID NO:2所示的氨基酸的氨基酸138-160，优选地氨基酸141-159，更优选地氨基酸,145-157。优选地，所述第一和第二细胞外环形成CLDN6的细胞外部分。

根据本发明的术语“变体”，尤其涉及突变体、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、种变体和种同系物，尤其是自然存在的那些。等位基因变体涉及在基因正常序列中的改变，其意义常常不清楚。全基因测序常常为所给基因鉴定出许多等位基因变体。种同系物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同种的来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”将包含任何翻译后修改的变体和构象变体。

根据本发明的多个方面，目的是优选地诱导或确定针对表达CLDN6和优选地以提呈CLDN6为特征的癌细胞的免疫反应，并且诊断、治疗或预防包含表达CLDN6的细胞的癌症疾病。优选地，所述免疫反应包含针对表达CLDN6和优选地用I类MHC提呈CLDN6的癌细胞的抗CLDN6CTL反应的刺激。

根据本发明，术语“CLDN6阳性癌症”或类似的术语，意思是包含表达CLDN6的癌细胞(优选地在所述癌细胞的表面上)的癌症。可选地或此外，所述表达CLDN6的癌细胞在MHC分子背景下提呈CLDN6。在MHC分子背景下提呈CLDN6的癌细胞能被携带有T细胞受体的免疫反应性细胞作为目标，而在表面表达CLDN6的癌细胞能被携带有人工T细胞受体的的免疫反应性细胞作为目标。

“细胞表面”按照在本领域中正常的意思使用，并且因此包括可以接近以由蛋白质和其他分子结合的细胞外面。

CLDN6表达在细胞表面，如果它位于所述细胞的表面，并且可以接近以由加到细胞上的CLDN 6特异性抗体结合。

在本发明背景下的术语“细胞外部分”或“外结构域”，涉及诸如面向细胞的细胞外间隙的蛋白质的分子的一部分，且优选地例如通过抗原结合分子如位于细胞外的抗体可从所述细胞外面接近。优选地，该术语涉及一个或多个细胞外环或结构域或其片段。

术语“部分”("portion")涉及片段(fraction)。针对特定结构如氨基酸序列或蛋白质术语其“部分”可以指定所述结构的连续或不连续片段。优选地，氨基酸序列的部分包含至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％，优选地至少40％，优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，和最优选地至少90％的所述氨基酸序列的氨基酸。优选地，如果所述部分是不连续的片段，所述不连续的片段由结构的2、3、4、5、6、7、8或更多部分组成，每一部分是所述结构的连续元件(element)。例如，氨基酸序列的不连续片段可以由2、3、4、5、6、7、8或更多，优选地不超过所述氨基酸序列的4部分组成，优选地其中每一部分包含氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸，至少10个连续的氨基酸，优选地至少20个连续的氨基酸，优选地至少30个连续的氨基酸。

本文中术语“部分”("part")和“片段”("fragment")可互换使用，并且涉及连续的元件。例如，诸如氨基酸或蛋白质的结构的部分，涉及所述结构的连续元件。优选地，结构的部分(A portion)、部分(a part)或片段包含所述结构的一种或多种功能性能。例如，优选地，表位、肽或蛋白质的部分(A portion)、部分(a part)或片段与它来源的表位、肽或蛋白质在免疫上是等效的。在本发明的背景下，优选地，结构的“部分”如氨基酸序列包含，优选地由全部结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％组成。优选地蛋白质序列的部分或片段包含该蛋白质序列的至少6个、尤其至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、或至少100个连续氨基酸的序列。本文使用的术语“变体”包含上述讨论的部分(portion)、部分(part)或片段。

根据本发明，如果表达水平比胎盘细胞或胎盘组织中的表达更低，则CLDN6在细胞中基本上不表达。优选地，表达水平少于10％，优选地少于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％的胎盘细胞或胎盘组织中的表达或甚至更低。优选地，如果表达水平超过在除胎盘以外的非癌组织中表达水平至多2倍，优选地1.5倍，并且优选地不超过在所述非癌组织中的表达水平，则CLDN6在细胞中基本上不表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低以至不能被加到细胞上的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6在细胞中基本上不表达。

根据本发明，优选地如果表达水平超过在除胎盘以外的非癌组织中表达水平多于2倍，优选地10倍、100倍、1000倍或10000倍，则CLDN6在细胞中表达。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平对于允许加到细胞上的CLDN6特异性抗体的结合来说足够高，则CLDN6在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN6是表达或暴露在所述细胞表面上的。

“靶细胞”意思是作为免疫反应如细胞免疫反应的靶标的细胞。靶细胞包括提呈抗原或抗原表位(来自抗原的肽片段)的细胞，和包括任何不良细胞如癌细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是表达优选地出现在细胞表面和/或用I类MHC提呈的CLDN6的细胞。

术语“表位”涉及在诸如抗原的分子中的抗原决定簇，即涉及被免疫系统识别的该分子中的部分或片段，例如，尤其当在MHC分子背景下被提呈的时候，其被T细胞识别。蛋白如肿瘤相关抗原的表位，优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且优选地是在5和100之间，优选地在5和50之间，更优选地在8和30之间，最优选地在10和25之间的氨基酸长度，例如，优选地表位可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的长度。在本发明的背景下，特别优选的表位是T细胞表位。

本文中术语如“表位”、“抗原片段”、“抗原肽”或“免疫原性肽”可互换使用，并且优选地涉及抗原的不完整表示，其优选地能够诱发针对抗原或针对表达或包含和优选地提呈抗原的细胞的免疫反应。优选地，术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，它是被T细胞受体，尤其如果在MHC分子背景下被提呈时，识别(特异性结合)的抗原的部分。某些优选的免疫原性部分能结合诸如在细胞表面上的MHC I类或II类分子，并且因此是MHC结合肽。如本文所使用的，如果此类结合是使用本领域已知的任何分析可检测的，就说肽“能结合”MHC I类或II类分子。

优选地，包含选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体的本文公开的肽，能够刺激免疫反应，优选地针对CLDN6、或以CLDN6的表达为特征以及优选地以CLDN6的提呈为特征的细胞的细胞反应。优选地，此类肽能够刺激针对以用MHC I类提呈CLDN6为特征的细胞的细胞反应，并且优选地能够刺激CLDN6应答性CTL。优选地，根据本发明的肽是MHC I类和/或II类提呈的肽，或能够被加工以产生MHC I类和/或II类提呈的肽。优选地，能结合MHC分子的序列选自SEQ ID NO:3、4和5。

如果直接提呈抗原肽，即没有加工，尤其是没有剪切，它具有适于结合MHC分子，尤其是I类MHC分子的长度，并且优选地是7～20个氨基酸的长度，更优选地7～12个氨基酸的长度，更优选地8～11个氨基酸的长度，尤其9或10个氨基酸的长度。优选地，直接提呈的抗原肽序列大体上对应于和优选地完全等同于选自SEQ ID NO:3、4和5的序列。

如果在加工后，尤其在剪切后提呈抗原肽，该加工产生的肽具有适合于结合MHC分子，尤其I类MHC分子的长度，并且优选地是7～20个氨基酸的长度，更优选地7～12个氨基酸的长度，更优选地8～11个氨基酸的长度，尤其9或10个氨基酸的长度。优选地，加工后提呈的肽序列大体上对应于和优选地完全等同于选自SEQ ID NO:3、4和5的序列。因此，在一实施方案中，根据本发明的抗原肽包含选自SEQ ID NO:3、4和5的序列，以及加工后的抗原肽构成选自SEQ ID NO:3、4和5的序列。

具有大体上对应于由MHC分子提呈的肽的序列的氨基酸序列的肽，可以在对于由MHC提呈的肽的TCR识别或对于结合MHC的肽不是必要的一个或多个残基处不同。优选地，此类大体上对应的肽也能够刺激抗原特异性细胞反应，如抗原特异性CTL。在不影响TCR识别但是提高结合MHC的稳定性的残基处具有不同于提呈的肽的氨基酸序列的肽，可以提高该抗原肽的免疫原性，并且在本文可能称为“优化的肽”。使用关于这些残基的已有知识，可以更有可能地影响结合MHC或结合TCR，可以使用推理研究法设计大体上对应的肽。将产生的有功能的肽看作抗原肽。本文使用的术语“变体”包含上述讨论的序列。

“抗原加工”指将抗原降解成加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解成肽)，以及这些片段的一个或多个与MHC分子的联合(例如，通过结合)，以用于由细胞，优选地抗原提呈细胞来提呈到特异性T细胞。

抗原提呈细胞(APC)是在主要组织相容性复合体(MHC)的背景下将抗原展示在其表面上的细胞。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)来识别这一复合体。抗原提呈细胞加工抗原并将它们提呈到T细胞。

专职的抗原提呈细胞，在通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用来内化抗原，以及然后在它们的膜上展示抗原片段、结合II类MHC分子方面，是非常有效的。所述T细胞识别并与在抗原提呈细胞膜上的抗原II类MHC分子复合体相互作用。然后抗原提呈细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞的激活。共刺激分子的表达是专职的抗原提呈细胞的基本特征。抗原提呈细胞包括专职的抗原提呈细胞和非专职的抗原提呈细胞。

专职的抗原提呈细胞的主要类型是树状细胞(其具有最广泛范围的抗原提呈，并可能是最重要的抗原提呈细胞)、巨噬细胞、B细胞和某些激活的上皮细胞。

非专职的抗原提呈细胞不会组成性地表达与初始T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白质；只有在通过某些细胞因子如IFNγ来刺激非专职抗原提呈细胞时，这些蛋白才被表达。

树状细胞(DC)是通过MHC II类和I类抗原提呈途径，将在外周组织捕获的抗原提呈给T细胞的白细胞群。众所周知的是，树状细胞是有效的免疫反应的诱导物，并且这些细胞的激活对于抗肿瘤免疫的诱导是关键步骤。

树状细胞和祖细胞可以从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、癌周组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或任何其他适合的组织或体液中获得。例如，通过将诸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的细胞因子组合，加入到从外周血收获的单核细胞培养物中，可以将树状细胞体外分化。可选地，通过将GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树状细胞分化、成熟和增殖的其他化合物的组合加入到培养基中，可以将从外周血、脐带血或骨髓收获的CD34阳性细胞分化成树状细胞。

方便地将树状细胞归类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可用作在两种很好地表征的表型之间进行区分的简单方法。然而，这一命名法不应被视为是排除所有可能的中间阶段的分化。

未成熟的树状细胞的特点是，对抗原摄取和加工具有高容量的抗原提呈细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是，这些标记的较低表达，但是负责T细胞激活的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD1 1)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表达。

树状细胞的成熟被称为树状细胞激活的状态，此时此类抗原提呈树状细胞导致T细胞的启动，然而通过未成熟树状细胞的提呈导致耐受。树状细胞的成熟主要由具有微生物特征的生物分子引起，所述特征通过先天受体(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎性细胞因子(TNF、IL-1、IFNs)、在树状细胞表面由CD40L连接的CD40和从经受压力细胞死亡的细胞中释放的物质来检测。可以通过用细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α在体外培养骨髓细胞得到树状细胞。

诸如抗原提呈细胞或靶细胞的细胞，通过用所述肽暴露即脉冲所述细胞，或用编码包含待提呈的肽的肽或蛋白的核酸(优选地RNA)，例如编码抗原的核酸来转导细胞，可以加载MHC I类提呈的肽。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含加载有抗原肽的抗原提呈细胞。在这方面，方案可以依赖于以它们人工地提呈抗原肽的此类方法来操作的树状细胞体外培养/分化。基因工程的树状细胞的生产，可以包含将编码抗原或抗原肽的核酸引入到树状细胞。用mRNA转染树状细胞是刺激强的抗肿瘤免疫力的有前途的抗原加载技术。此类转染可以发生在体外，并且然后包含此类转染细胞的药物组合物可以用于治疗目的。可选地，靶向树状细胞或其他抗原提呈细胞的基因递送载体可以给予患者，导致转染在体内发生。例如，一般可以使用本领域任何已知的方法，如在WO 97/24447中描述的那些或由Mahvi等免疫和细胞生物学75：456-460,1997描述的基因枪方法，进行树状细胞的体内和体外转染。树状细胞的抗原加载，可以通过与抗原、DNA(裸的或在质粒载体中)或RNA，或与抗原表达重组细菌或病毒(例如，牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒载体)一起培养树状细胞或祖细胞实现。

术语“免疫原性”涉及诱导免疫反应的抗原的相对效率。

在本发明背景下的术语“免疫效应功能”，包括任何由免疫系统的组分介导的功能，该组分导致例如肿瘤细胞的杀伤或肿瘤生长的抑制，和/或肿瘤发展的抑制，包括肿瘤传播和转移的抑制。优选地，在本发明背景下免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。此类功能包含在辅助T细胞(CD4⁺T细胞)的情况下，在MHC II类分子的背景下由T细胞受体识别抗原或来源于抗原的抗原肽，细胞因子的释放和/或CD8⁺淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活，以及在CTL的情况下，在MHC I类分子的背景下由T细胞受体识别抗原或来源于抗原的抗原肽，在MHC I类分子的背景下消除提呈的细胞，即以用I类MHC提呈抗原为特征的细胞，例如，通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解，诸如IFN-γ和TNF-α的细胞因子的产生，以及特异性细胞溶解杀伤表达抗原的靶细胞。

在本发明背景下的术语“免疫反应性细胞”或“免疫效应细胞”，涉及在免疫反应期间发挥效应器功能的细胞。优选地，“免疫反应性细胞”能够结合抗原如表达在细胞表面上的抗原，或以提呈抗原或来源于抗原的抗原肽为特征的细胞，并且介导免疫反应。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，杀伤微生物，分泌抗体，识别被感染的细胞或癌细胞，以及任选地消除此类细胞。例如，免疫反应性细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树状细胞。优选地，在本发明的背景下，“免疫反应性细胞”是T细胞，优选地CD4⁺和/或CD8⁺T细胞。

优选地，“免疫反应性细胞”识别具有一定程度特异性的抗原或来源于抗原的抗原肽，尤其如果在MHC分子背景下，如在抗原提呈细胞或诸如癌细胞的病变细胞的表面上被提呈。优选地，所述识别能够使识别抗原或来源于所述抗原的抗原肽的细胞应答或反应。如果该细胞是具有在MHC II类分子的背景下能识别抗原或来源于抗原的抗原肽的受体的辅助T细胞(CD4⁺T细胞)，则此类应答或反应性可以包含细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活。如果细胞是CTL，则此类应答或反应性可以包含在MHC I类分子的背景下消除提呈的细胞，即以用I类MHC提呈抗原为特征的细胞，例如，通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解。根据本发明，CTL应答可以包括持续的钙流出，细胞分裂，诸如IFN-γ和TNF-α的细胞因子的产生，诸如CD44和CD69的激活标记物的上调，和特异性细胞溶解杀伤表达抗原的靶细胞。也可以使用精确指示CTL应答的人工报道分子来确定CTL应答。此类能识别抗原或来源于抗原的抗原肽并且是应答或反应的CTL，在本文也叫做“抗原应答性CTL”。如果细胞是B细胞，此类应答可以包括免疫球蛋白的释放。

根据本发明，术语“免疫反应性细胞”也包括经适当的刺激能成熟为免疫细胞(诸如T细胞，尤其是T辅助细胞，或细胞溶解性T细胞)的细胞。免疫反应性细胞包含CD34⁺造血干细胞、未成熟的和成熟的T细胞，以及未成熟的和成熟的B细胞。如果期望产生识别抗原的细胞溶解性细胞或T辅助细胞，则在支持细胞溶解性T细胞和T辅助细胞的产生、分化和/或选择的情况下，将免疫反应性细胞与提呈抗原或抗原肽的细胞接触。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为细胞溶解性T细胞，类似于免疫系统的克隆选择。

“淋巴样细胞”是任选地在适当的修改后(例如T细胞受体转移后)，能够产生免疫反应如细胞免疫反应的细胞，或此类细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞，优选地T淋巴细胞、成淋巴细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是本文描述的免疫反应性细胞。优选的淋巴样细胞是缺乏内源性表达T细胞受体并且可以将其修改成在细胞表面上表达此类T细胞受体的T细胞。

在本文术语“T细胞”和“T淋巴细胞”可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4⁺T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL,CD8⁺T细胞)，所述细胞毒性T细胞包括细胞溶解性T细胞。

T细胞属于被称为淋巴细胞的白血球组，并且在细胞介导的免疫中发挥核心作用。它们可以通过在其细胞表面上存在叫做T细胞受体(TCR)的特异性受体与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。胸腺是负责T细胞的T细胞成熟的主要器官。已经发现几种不同的T细胞亚单位，每种都具有不同功能。

除其他功能外，T辅助细胞还在免疫过程中帮助其他白血球，包括使B细胞成熟为浆细胞以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。因为它们在其表面上表达CD4蛋白，也将这些细胞称为CD4⁺T细胞。当由在抗原提呈细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子将它们与肽抗原一起提呈时，辅助T细胞变得被激活。一旦激活，它们很快地分开，并且分泌在主动免疫反应进行调节或帮助的叫做细胞因子的小蛋白。

细胞毒性T细胞破坏病毒性感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。由于它们在其表面表达CD8糖蛋白，也将这些细胞称为CD8⁺T细胞。通过结合与MHC I类(其出现在几乎身体每个细胞表面上)有关的抗原，这些细胞识别它们的靶标。

大多数T细胞具有作为几个蛋白质的复合体而存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两个单独的肽链组成，其由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且叫做α-和β-TCR链，γδT细胞(γδT细胞)代表在其表面上具有不同的T细胞受体(TCR)的T细胞小亚单位。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链组成。这一组T细胞远不及αβT细胞普遍(总T细胞的2％)。

T细胞受体的结构非常类似于免疫球蛋白Fab片段，其是定义为抗体臂的组合的轻链和重链的区域。TCR的每一条链是免疫球蛋白超家族的成员，并且拥有一个N末端免疫球蛋白(Ig)-可变(V)结构域，一个Ig-恒定(C)结构域，跨膜/细胞膜-横跨区和在C末端的短的胞质尾。

根据本发明，术语“T细胞受体的可变区”涉及TCR链的可变结构域。

TCRα链和β链的可变区具有三个高变的或互补决定区(CDR)，然而β链的可变区具有不通常接触抗原的高变性(HV4)补充区，并且因此不被看做是CDR。CDR3是负责识别加工的抗原的主要CDR，尽管也已经显示α链的CDR1与抗原肽的N末端部分相互作用，然而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。据认为CDR2识别MHC。不认为β链的CDR4参加抗原识别，但是已经显示与超抗原相互作用。

根据本发明，优选地，术语“至少一个CDR序列”意思是至少CDR3序列。优选地，术语“T细胞受体链的CDR序列”涉及T细胞受体的α链或β链的CDR 1、CDR2和CDR3。

TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成在两条链之间形成连接的二硫键。

所有T细胞发源于骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞通过细胞分裂移入胸腺并扩增，以产生大量的未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并且因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。当它们通过其发育而进步时，它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)淋巴细胞，其然后从胸腺释放到外周组织。

在T细胞激活中的第一个信号，是通过T细胞受体结合由在另一个细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)提呈的短肽来提供的。这确保只有对所述肽具有TCR特异性的T细胞是激活的。伴侣细胞通常是专职的抗原提呈细胞(APC)，通常是在初始反应情况下的树状细胞，尽管B细胞和巨噬细胞可以是重要的APC。由MHC I类分子提呈给CD8+T细胞的肽是8-10个氨基酸的长度；因为MHC II类分子的结合裂口的末端是开着的，由MHC II类分子提呈给CD4+T细胞的肽更长些。

通常可以使用标准程序在体外或离体地制备T细胞。例如，使用商购的细胞分离系统，T细胞可以在诸如患者的哺乳动物的骨髓、外周血、或者骨髓或外周血的部分的内部出现(或分离自其中)。可选地，T细胞可以来源于相关的或不相关的人类、非人类的动物、细胞系或培养物。“包含T细胞的样品”例如可以是外周血单核细胞(PBMC)。

可以用抗原、肽、核酸和/或表达抗原的抗原提呈细胞(APC)来刺激T细胞。此类刺激在足以允许产生针对抗原、肽和/或提呈抗原或肽的细胞具有特异性的T细胞的条件和时间下执行。

可以用多种方法检测CD4+或CD 8+T细胞的特异性激活。用于检测特异性T细胞激活的方法包括，检测T细胞的增殖、细胞因子(例如，淋巴因子)的产生、或细胞溶解活性的产生。对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞激活的优选方法是，检测T细胞的增殖。对于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞激活的优选方法是，检测细胞溶解活性的产生。

为了产生CD8+T细胞系，可以将用产生抗原的核酸转染的抗原提呈细胞(优选自体的抗原提呈细胞)作为刺激器(stimulator)细胞。

可以将核酸如编码T细胞受体(TCR)链的RNA引入到淋巴样细胞，如T细胞或具有促使细胞溶解潜能的其他细胞。在一个合适的实施方案中，从抗原特异性T细胞系中克隆出TCRα链和β链，并且用于过继性T细胞治疗。在这方面，本发明提供针对本文公开的CLDN6或CLDN6肽具有特异性的T细胞受体。通常，本发明的这一方面涉及识别或结合在MHC背景下提呈的CLDN6肽的T细胞受体。可以将编码T细胞受体(例如根据本发明提供的T细胞受体)的α和β链的核酸，包含在单独的核酸分子如表达载体上，或可选地，在单核酸分子上。因此，术语“编码T细胞受体的核酸”或类似的术语，涉及在相同或优选地在不同的核酸分子上编码T细胞受体的核酸分子。

术语“与肽反应的免疫反应性细胞”涉及这样的免疫反应性细胞，当它识别所述肽，尤其如果在MHC分子的背景下诸如在抗原提呈细胞或病变细胞如癌细胞的表面上提呈所述肽时，发挥上述的免疫反应性细胞的效应器功能。

术语“与肽反应的T细胞受体”涉及这样的T细胞受体，当其出现在免疫反应性细胞上时识别实施肽，尤其如果在MHC分子的背景下诸如在抗原提呈细胞或病变细胞如癌细胞的表面上提呈所述肽时，使得所述免疫反应性细胞发挥上述的免疫反应性细胞的效应器功能。

术语“抗原反应性T细胞”或类似的术语涉及识别抗原的T细胞，如果在MHC分子的背景下诸如在抗原提呈细胞或病变细胞如癌细胞的表面上提呈所述抗原，并且发挥上述T细胞的效应器功能。

术语“抗原特异性淋巴样细胞”涉及这样的淋巴样细胞，尤其当与抗原特异性T细胞受体一起提供时，其识别所述抗原，如果在MHC分子的背景下诸如在抗原提呈细胞或病变细胞如癌细胞的表面上提呈所述抗原，并且发挥上述T细胞的效应器功能。如果所述细胞杀伤表达抗原和/或提呈抗原肽的靶细胞，则认为T细胞和其他淋巴样细胞针对抗原具有特异性。可以使用多种标准技术例如铬释放测定或增殖分析中的任一种来评估T细胞特异性。可选择地，可以测量淋巴因子(诸如干扰素γ)的合成。

术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”，包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及在所有脊椎动物中发生的基因复合体。在免疫反应中，MHC蛋白或分子对于在淋巴细胞和抗原提呈细胞或病变细胞中的信号转导很重要，其中为了被T细胞受体识别，MHC蛋白或分子结合肽并且提呈它们。由MHC编码的蛋白表达在细胞表面上，并且向T细胞显示自体抗原(来自细胞自己的肽片段)和非自体抗原(例如，入侵的微生物的片段)。

将MHC区分为三个亚组，I类、II类和III类。MHC I类蛋白包含α链和β2微球蛋白(不是由15号染色体编码的MHC的部分)。它们将抗原片段提呈到细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，特别在抗原提呈细胞上，MHC II类蛋白包含α和β链，并且它们将抗原片段提呈到T辅助细胞。MHC III类区编码其他免疫组分如补体组分，以及编码一些其他细胞因子。

在人类中，编码在细胞表面上的抗原提呈蛋白的MHC区中的基因被称为人白细胞抗原(HLA)的基因。然而，常常使用缩写MHC来指HLA基因产物。HLA基因包括9种所谓的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQBl、HLA-DRA和HLA-DRB1。

在一本发明的所有方面的优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。

通过“以抗原的提呈为特征的细胞”、“提呈抗原的细胞”、“被细胞提呈的抗原”、“提呈的抗原”或类似的表达，表示诸如病变细胞如癌细胞的细胞，或在MHC分子尤其在MHC I类分子的背景下，提呈它表达的抗原或来源于所述抗原的片段(例如通过加工所述抗原)的抗原提呈细胞。同样地，术语“以提呈抗原为特征的疾病”表示包含尤其是用MHC I类提呈抗原为特征的细胞的疾病。通过用核酸如编码抗原的RNA转染细胞，可以影响通过细胞来提呈抗原。

通过“提呈的抗原的片段”或类似的表达，表示可以由MHC I类或II类，优选地MHC I类提呈的片段，例如，当直接加到抗原提呈细胞时。在一实施方案中，所述片段是被表达抗原的细胞自然提呈的片段。

一些治疗方法是基于患者的免疫系统反应的，其导致用MHC I类提呈抗原的病变细胞的细胞溶解。在这一点上，例如，可以将针对抗原肽和MHC分子的复合体具有特异性的自体细胞毒性T淋巴细胞给予有疾病的患者。在体外生产此类细胞毒性T淋巴细胞是已知的。可以在WO-A-9633265中找到分化T细胞的方法的实例。通常，从患者采取包含细胞如血细胞的样品，并且将所述细胞与提呈复合体的细胞接触，并且其能够引起细胞毒性T淋巴细胞(例如，树状细胞)的增殖。靶细胞可以是转染的细胞如COS细胞。这些转染的细胞在它们的表面上提呈期望的复合体并且，当与细胞毒性T淋巴细胞接触时，刺激后者的增殖。然后，将克隆扩增的自体细胞毒性T淋巴细胞给予患者。

在选择细胞毒性T淋巴细胞的另一方法中，将MHC I类分子/肽复合体的荧光四聚体用于获得细胞毒性T淋巴细胞的特异性克隆(Altman et al.(l 996),Science 274:94-96；Dunbar et al.(1998),Curr.Biol.5:413-416,1998)。

此外，可以将提呈期望的复合体的细胞(例如，树状细胞)与健康对象或其他种类(例如小鼠)的细胞毒性T淋巴细胞联合，这样可以导致具有高亲和力的特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。可以将这些增殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体克隆，并且任选地人源化至不同的程度，并且因此获得的T细胞受体，然后将通过例如使用逆转录病毒载体的基因转移，被转导入患者的T细胞。然后可以使用这些基因改变的T淋巴细胞来进行过继性转移(Stanislawski et al.(2001),Nat Immunol.2:962-70；Kessels et al.(2001),Nat Immunol.2:957-61)。

也可以用自身已知的方式在体内产生细胞毒性T淋巴细胞。一种方法使用表达MHC I类/肽复合体的非增殖细胞。这里使用的细胞将是那些通常表达所述复合体的细胞，如辐射的肿瘤细胞或用提呈复合体(例如，抗原肽和提呈MHC分子)必需的一种或两种基因转染的细胞。另一种优选的形式是以重组RNA的形式引入抗原，例如，所述RNA可以通过脂质体转移或通过电穿孔引入至细胞。产生的细胞能提呈目标复合体，并且被然后增殖的自体细胞毒性T淋巴细胞识别。

为了使在体内并入抗原提呈细胞成为可能，可以通过联合抗原或抗原肽与佐剂来取得相似的效果。可以将抗原或抗原肽表征为蛋白质、DNA(例如，在载体内部)或RNA。可以将抗原加工以产生MHC分子的肽伴侣，然而其片段不需要进一步加工就可被提呈。后者尤其是，如果这些能结合MHC分子的情况。将优先权给予在体内由树状细胞加工完整抗原的给予形式，因为这也可以产生有效免疫应答需要的T辅助细胞应答(Ossendorp et al.,Immunol Lett.(2000),74:75-9；Ossendorp et al.(1998),J.Exp.Med.757:693-702)。通常，例如，通过皮内注射将有效量的肿瘤相关抗原给予患者是可能的。然而，也可以通过经鼻进入淋巴结来完成注射(Maloy et al.(2001),Proc Natl Acad Sci USA 95:3299-303)。

根据本发明，术语“人工T细胞受体”与术语“嵌合T细胞受体”以及“嵌合抗原受体(CAR)”是同义的。

这些术语涉及工程受体，它们赋予免疫效应细胞如T细胞任意特异性如单克隆抗体的特异性。用这种方法，可以产生大量的用于过继性细胞转移的癌症特异性T细胞。因此，人工T细胞受体可以出现在T细胞上，例如，代替T细胞自己的T细胞受体，或作为除此以外的T细胞受体。对于靶细胞的识别，此类T细胞不一定需要抗原的加工和提呈，而是优选地可以特异性地识别出现在靶细胞上的任何抗原。优选地，所述人工T细胞受体被表达在细胞的表面上。为了本发明的目的，本文使用的术语“T细胞”涵盖包含人工T细胞受体的T细胞。

在一实施方案中，将来源于单克隆抗体的单链可变区片段(scFv)融合到CD3ζ跨膜和内结构域。此类分子导致ζ信号的传递，以响应在靶细胞上其抗原目标的scFv的识别和表达目标抗原的靶细胞的杀伤。也可以使用的抗原识别结构域包括T细胞受体(TCR)α和β单链等。事实上，可以将以高亲和力结合给定目标的几乎任何物质用作抗原识别结构域。

随着抗原识别，受体聚集，且信号被传送到细胞。在这方面，“T细胞信号转导结构域”是这样的结构域，优选内结构域，其在结合抗原后将激活信号传送到T细胞。最常用的内结构域组分是CD3ζ。

因为可以将CAR-修改的T细胞工程化以靶向几乎任何的肿瘤抗原，用表达嵌合抗原受体的CAR-工程化的T细胞进行过继性细胞转移治疗是有前途抗癌治疗。例如，可以将患者的T细胞基因工程化以表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后灌输回患者体内。

根据本发明，人工T细胞受体可以取代上述的T细胞受体的功能并且，尤其可以赋予细胞(如上述T细胞)反应性，如细胞溶解活性。然而，与T细胞受体结合上述抗原肽-MHC复合体形成对照，人工T细胞受体可以结合抗原，尤其是表达在细胞表面的抗原。

T细胞表面糖蛋白CD3ζ链是在人类中由CD 247基因编码的蛋白。CD3ζ连同T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体和CD3-γ、-δ和-ε形成T细胞受体-CD3复合体。在偶联抗原识别到几个细胞内信号转导通路中，ζ链发挥重要作用。优选地，术语“CD3ζ”涉及人CD3ζ，并且尤其涉及包含，优选地由序列表中SEQ ID NO:45的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成的蛋白质。

CD28(分化群28)是一种表达在提供T细胞活化所需的共刺激信号的T细胞上的分子。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。通过除了T细胞受体(TCR)之外的CD28的刺激，能够提供有效的共刺激信号给T细胞以用于各种白细胞介素(尤其是IL-6)的生产。优选地术语“CD28”涉及人CD28，并且尤其涉及包含，优选地由序列表中SEQ ID NO:44的氨基酸序列或所述氨基酸序列变体组成的蛋白质。

根据本发明，通常CAR可以包含三个结构域。

第一个结构域是识别和结合CLDN6的结合域。

第二个结构域是共刺激结构域。共刺激结构域在CAR结合目标部分时能够提高细胞毒性淋巴细胞的增殖和存活。当CAR结合目标部分时，共刺激结构域的确认仅限与其有能力提高细胞增殖和存活。合适的共刺激结构域包括：CD28、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员CD137(4-I BB)、受体TNFR超家族成员CD134(OX40)，以及表达在激活的T细胞上的CD28超家族共刺激分子CD278(ICOS)。本领域技术人员将会理解，可以使用这些指出的共刺激结构域的序列变体而不会不利地影响本发明，其中所述变体具有与被模仿的结构域相同或相似的活性。此类变体将与它们源自的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，所述CAR构建体包含两个共刺激结构域。然而特定组合包括四种指出的结构域所有可能的变体，具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。

第三个结构域是激活信号转导结构域(或T细胞信号转导结构域)。激活信号转导结构域能够在CAR结合CLDN6时激活细胞毒性淋巴细胞。当CAR结合CLDN6时，激活信号转导结构域的确认仅限于其有能力诱导所选细胞毒性淋巴细胞的激活。合适的激活信号转导结构域包括T细胞CD3ζ链和Fc受体γ。本领域技术人员将会理解，可以使用这些指出的激活信号转导结构域的序列变体，而不会不利地影响本发明，其中变体具有与被模仿的结构域相同或相似的活性。此类变体将与它们来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。

本发明的CAR可以包括以融合蛋白的形式在一起的三个结构域。通常此类融合蛋白将包括从N末端到C末端方向连接的结合域、一种或多种共刺激结构域和激活信号转导结构域。然而，本发明的CAR不局限于这一排列，其他排列是可接受的，并且包括结合域、激活信号转导结构域和一种或多种共刺激结构域。应理解的是，因为结合域必须是自由结合CLDN6的，通常在融合蛋白中结合域的布置将是实现将该区域显示在细胞外部。同样地，因为共刺激和激活信号转导结构域能够诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖，通常融合蛋白在细胞内部显示这两个结构域。CAR可以包括其他元件，如信号肽，以确保融合蛋白适当的输出到细胞表面；跨膜结构域，以确保将融合蛋白维持为完整的膜蛋白；以及铰链结构域(或间隔区域)，其赋予结合域灵活性并允许牢固结合到CLDN6。

优选地，用于与本发明的CAR系统连接的细胞是T细胞，尤其是细胞毒性淋巴细胞，优选地选自：细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴样激活的杀伤(LAK)细胞。一旦激活，每种这些细胞毒性淋巴细胞会引发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过下述方法的任一种或两者引发靶细胞的破坏。第一，一旦激活，T细胞释放细胞毒素，如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，颗粒酶进入细胞，并且引发诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)的在细胞质中半胱天冬酶级联反应。第二，通过T细胞和靶肿瘤细胞之间的Fas-Fas配体相互作用可以诱导凋亡。优选地，细胞毒性淋巴细胞将是自体的细胞，尽管可以使用异源性细胞或同种异体细胞。

根据本发明，诸如参考样品或参考有机体的“参考”，可以用于关联和比较来自测试样品或测试有机体的用本发明方法获得的结果。通常，参考有机体是健康的有机体，尤其是没有患疾病如癌症疾病的有机体。可以通过测量足够大量的参考数据(references)，从参考数据经验性地确定“参考值”或“参考水平”。优选地，通过测量至少2份，优选地至少3份，优选地至少5份，优选地至少8份，优选地至少12份，优选地至少20份，优选地至少30份，优选地至少50份，或优选地至少100份参考数据来确定参考值。

根据本发明，术语“结合剂”包括对目标具有结合能力的任何化合物。优选地，此类结合剂包含至少一种针对目标的结合域。该术语包括这样的分子，如抗体和抗体片段、双特异性或多特异性分子、嵌合抗原受体(CAR)和所有对目标具有结合能力的人工结合分子(支架)，其包括但不限于：纳米抗体、亲和体(affibodies)、Anticalins、DARPins、单抗体、高亲和性多聚体和微体。在一实施方案中，所述结合是特异性结合。

术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选地涉及抗原受体，如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白是以具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域(例如免疫球蛋白结构域)为特征的。该术语包含膜结合免疫球蛋白和可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也叫表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的部分。通常将可溶性免疫球蛋白叫做抗体。通常免疫球蛋白包含几条链，通常为通过二硫键连接的两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域组成，如VL(轻链可变区)结构域、CL(轻链恒定区)结构域，以及CH(重链恒定区)结构域CH 1、CH2、CH3和CH4。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，它们负责不同种类的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在它们的羧基末端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白不同的同种型中是基本上保守的，其中可变区是高度变化的，并且负责抗原的识别。

术语“抗体”涉及包含由二硫键进行链内连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化的抗体和嵌合抗体。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为超变区，叫做互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，叫做骨架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下述顺序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

本文使用的术语“单克隆抗体”，涉及制备单个分子构成的抗体分子。单克隆抗体展示单一的结合特异性和亲和力。在一实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从非人动物如小鼠中获得的融合到永生化细胞的B细胞。

本文使用的术语“重组抗体”，包括所有通过重组方法制备的、表达的、产生的或分离的抗体，诸如(a)从关于免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由此制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)例如从转染瘤的从转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，(c)从重组的、组合的抗体库分离的抗体和(d)通过包含剪接免疫球蛋白的基因序列到其他DNA序列的任何其他方法制备的、表达的、产生的或分离的抗体。

本文使用的术语“人抗体”，意在包括具有来源于人种系(germline)免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引进的突变)。

术语“人源化的抗体”，涉及具有大体上来源于非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域的完整的可变结构域，或仅包含嫁接到在可变结构域中的骨架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或通过一个或多个氨基酸替换进行修改的，例如经修改以便更像人免疫球蛋白。一些人源化抗体的形式保存了所有的CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或多个根据原抗体改变的CDR。

术语“嵌合抗体”涉及那样的抗体，其中每一重链和轻链的氨基酸序列一部分与在来源于特定物种或属于特定类的抗体中相应序列是同源的，而链的剩余部分与在另一个中的相应序列是同源。通常，轻链和重链的可变区都模拟来源于哺乳动物一物种的抗体的可变区，而恒定区部分与来源于另一抗体的序列是同源的。此类嵌合形式的一明显优势是，使用容易获得的来自非人宿主生物体的B细胞或杂交瘤联合来源于例如人细胞制备物的恒定区，可变区可以便利地来源于目前已知的来源。同时，可变区具有容易制备的优势，并且其特异性不受来源的影响，当注射抗体的时候，人源的恒定区比来自非人来源的恒定区较少可能引起来自人对象的免疫反应。然而，该定义并不限定于这一特定的实例。

抗体可以来源于不同的物种，包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和人。

本文描述的抗体包括IgA(如IgAl或IgA2)、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在不同的实施方案中，抗体是IgGl抗体，更具体地是IgGl，κ或IgGl，λ同种型(例如，IgGl、κ、λ)，IgG2a抗体(例如，IgG2a、κ、λ)，IgG2b抗体(例如，IgG2b、κ、λ)，IgG3抗体(例如，IgG3、κ、λ)或IgG4抗体(例如，IgG4、κ、λ)。

优选地本文描述的抗体是分离的。本文使用的“分离的抗体”(isolated antibody)意指这样的抗体，其基本上没有其他具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合CLDN6的分离的抗体，是基本上没有那些特异性结合除CLDN6外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人CLDN6的表位、同种型或变体的分离的抗体，可以与例如来自其他物种(例如，CLDN6物种同系物)的其他相关抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以是基本上没有其他细胞材料和/或化学品。在本发明的一实施方案中，“分离的”单克隆抗体的联合，涉及具有不同特异性并且被组合在良好定义的组合物或混合物中的抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“结合部分”)、或抗体的“抗原结合片段”(或简单地“结合片段”)、或类似的术语，涉及保持特异性结合到抗原的能力的抗体一个或多个片段。已经显示，可以通过全长抗体的片段来执行抗体的抗原结合功能。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)，和(vii)两个或更多个分离的可以任选地通过合成的接头连接的CDR的联合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码，可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，这能将它们制成其中VL和VH区成对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；见例如，Bird et al.(1988)Science 242:423-426；and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)的单个蛋白链。此类单链抗体也意在包含于术语抗体的“抗原结合片段”中。进一步的实例是结合域免疫球蛋白融合蛋白，其包含：(i)融合到免疫球蛋白铰链区肽的结合域肽，(ii)融合到铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合到CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。在US 2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开了结合域免疫球蛋白融合蛋白。使用本领域技术人员已知的常规技术获得了这些抗体片段，并且为了实用而用相同的方式筛选的片段是完整的抗体。

根据本发明，术语“针对CLDN6的结合域”包括并且优选地涉及CLDN6抗体的抗原结合部分，即定向针对CLDN6且优选地特异性针对CLDN6的抗体。

术语“结合域”的特征与本发明的例如抗体的结构相关，其与给定的目标结构/抗原/表位，进行结合/相互作用。因此，根据本发明的结合域定名为“抗原相互作用位点”。

为了本发明的目的，术语“抗体”包含本文描述的所有抗体和抗体衍生物如抗体片段。

可以通过多样化的技术生产抗体，包括常规的单克隆抗体方法学，例如，Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术，Nature 256:495(1975)。尽管体细胞杂交程序是优选的，原则上，也可以使用生产单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化或使用抗体基因库的噬菌体展示技术。

用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠科动物系统。在小鼠中的杂交瘤生产是非常好的已建立的程序。分离用于融合的免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。

其他用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是大鼠和兔子系统(例如，描述于Spieker-Polet等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)，也参见Rossi等,Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005))。

为了产生抗体，如前所述，可以使用来源于抗原序列(即抗体要指向针对的序列)的载体-缀合的肽、重组表达抗原或其片段和/或表达抗原的细胞的浓缩制备物来免疫小鼠。可选地，可以用编码抗原或其片段的DNA免疫小鼠。在使用纯化的或浓缩抗原制备物进行免疫不能产生抗体的事件中，也可以使用表达抗原的细胞(如细胞系)来免疫小鼠以促进免疫反应。

用通过尾静脉或眶后出血获得的血浆和血清样品，可以在免疫方案从头到尾的过程中监控免疫反应。可以将有足够免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。可以在处死并移除脾脏3天前，通过腹腔或静脉推进给小鼠注射抗原表达细胞，以提高分泌特异性抗体的杂交瘤的速度。

为了形成生产单克隆抗体的杂交瘤，可以将来自免疫的小鼠的脾细胞和淋巴结细胞分离，并且融合到合适的永生化细胞系如小鼠骨髓瘤细胞系。然后可以筛选产生的杂交瘤，以用于生产抗原特异性抗体。然后，针对分泌抗体的杂交瘤可以通过ELISA来筛选单个孔。通过使用抗原表达细胞进行免疫荧光和FACS分析，可以鉴定针对抗原具有特异性的抗体。可以重新接种(replated)抗体分泌杂交瘤，再次筛选，并且如果对单克隆抗体任然是阳性，可以通过有限稀释进行亚克隆。然后，可以在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生抗体用于表征。

可以使用标准的结合测定(例如，ELISA、Western Blot、免疫荧光和流式细胞检测分析)，确定抗体和其他结合剂结合抗原的能力。

抗体和抗体衍生物可用于提供结合域如抗体片段，尤其是提供VL和VH区。

可以出现在人工T细胞受体中的针对CLDN6的结合域，具有结合CLDN6的能力，即结合到在CLDN6中出现的表位的能力，优选地位于CLDN6的胞外结构域的表位，尤其是第一胞外环，优选地CLDN6的氨基酸位置28至76，或第二胞外环，优选地CLDN6的氨基酸位置141至159。在特定的实施方案中，针对CLDN6的结合域结合到在CLDN6上而不在CLDN9上出现的表位。优选地，针对CLDN6的结合域结合到在CLDN6上而不在CLDN4和/或CLDN3上出现的表位。最优选地，针对CLDN6的结合域结合到在CLDN6上而不在除了CLDN6的CLDN蛋白上出现的表位。

针对CLDN6的结合域，优选地结合CLDN6但是不结合CLDN9，并且优选地不结合CLDN4和/或CLDN3。优选地，针对CLDN6的结合域是CLDN6特异性的。优选地，针对CLDN6的结合域结合到在细胞表面上表达的CLDN6。在特别优选的实施方案中，针对CLDN6的结合域，结合到出现在活细胞表面上的CLDN6的天然表位。

在优选的实施方案中，针对CLDN6的结合域包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO:30、32、34和36的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。

在优选的实施方案中，针对CLDN6的结合域包含的轻链可变区(VL)，所述VL包含选自SEQ ID NO:31、32、35和37的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。

在某些优选的实施方案中，针对CLDN6的结合域包含选自下述(i)至(xi)可能性的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的联合：

(i)VH包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其片段，

(ii)VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其片段，

(iii)VH包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其片段，

(iv)VH包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其片段，

(v)VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其片段，

(vi)VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其片段，

(vii)VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其片段。

在特别优选的实施方案中，针对CLDN6的结合域包含下述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的联合：VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段，以及VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其片段。

术语“片段”尤其涉及一个或多个互补决定区(CDR)，优选地至少重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的CDR3可变区。在一实施方案中，所述一个或多个互补决定区(CDR)选自一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。在特别优选的实施方案中，术语“片段”涉及重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

在一实施方案中，包含本文描述的一个或多个CDR、一组CDR或几组CDR的联合的针对CLDN6的结合域，包含所述CDR连同其介入的骨架区。优选地，该部分也将包括至少50％的第一和第四骨架区的其一或两者，50％是第一骨架区的C末端50％和第四骨架区的N末端50％。通过重组DNA技术构建的结合结构域，可以导致将残基N或C末端引进到由连接子(其被引进以便于克隆或其他操作步骤)编码的可变区，包括引进连接子以将本发明的可变区连接至进一步的蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双体生产中)或蛋白标签。

在一实施方案中，包含本文描述的一个或多个CDR、一组CDR或几组CDR的联合的结合域，包含在人源抗体骨架中的所述CDR。

根据本发明，优选地术语“结合”涉及特异性结合。

根据本发明，如果试剂对预定目标具有显著的亲和力并且在标准测定中结合到所述预定的目标，则该试剂如T细胞受体或抗体能够结合到所述预定目标。常常通过平衡解离常数(K_D)来测量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著的亲和力”涉及能结合预定目标，其解离常数为10^-5M或更低、10^-6M或更低、10^-7M或更低、10^-8M或更低、10^-9M或更低、10^-10M或更低、10^-11M或更低、或10^-12M或更低。

如果试剂对目标不具有显著的亲和力，并且不能显著地结合，尤其不能可检测地结合到所述目标，则在标准测定中所述试剂(基本上)不能结合到所述目标。优选地，如果以多达2，优选地10，更优选地20，尤其50或100ng/ml或更高的浓度中出现，试剂不能可检测地结合到所述目标。优选地，如果试剂结合到目标的K_D，是试剂能够结合的预定目标的K_D的至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍高，试剂对所述目标不具有显著的亲和力。例如，如果试剂结合到该试剂能够结合的目标的K_D是10^-7M，结合到该试剂不具有显著亲和力的目标的K_D应至少为10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

如果试剂能够结合到所述预定目标而(基本上)不能结合到其他目标，即在标准分析中对其他目标没有显著的亲和力并且不能显著地结合到其他目标，则该试剂是特异性针对预定目标的。根据本发明，如果试剂能够结合到CLDN6但是(基本上)不能结合到其他目标，则该试剂是特异性针对CLDN6的。优选地，如果针对此类其他目标的亲和力和结合，没有显著地超过针对CLDN6不相关蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(USA)或非密封蛋白跨膜蛋白如MHC分子或转铁蛋白受体或任何其他特异性肽的亲和力和结合，则该试剂是特异性针对CLDN6的。优选地，如果试剂结合到所述目标的K_D至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的低于结合到它不特异性针对的目标的K_D，则该试剂是特异性针对预定目标的。例如，如果试剂结合到它特异性针对的目标的K_D是10^-7M，则结合到试剂不特异性针对的目标的K_D应至少为10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

可以使用任何合适的方法通过实验确定试剂结合到目标；参见，例如，Berzofsky等，"Antibody-Antigen Interactions"In Fundamental Immunology(在基础免疫学中的“抗体-抗原相互作用”)，Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company New York.N Y(1992)，以及本文描述的方法。可以使用诸如通过平衡透析的常规技术；通过使用由制造商概述的通用程序并采用BIAcore 2000仪器；通过使用放射性标记目标抗原进行放射免疫分析；或通过本领域技术人员已知的其他方法容易地确定亲和力。可以分析亲和力数据，例如，通过Scatchard等人的方法，Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)。如果在不同的条件，例如盐浓度、pH的情况下测量，特定抗体抗原相互作用所测量的亲和力可以改变。因此，优选地，亲和力和其他抗原结合参数如K_D、IC₅₀的测量，用抗体和抗原的标准溶液和标准缓冲液进行。

应理解的是，可以在体外或体内以核酸如编码试剂的RNA的形式，和/或以包含核酸如编码试剂的RNA的宿主细胞的形式，提供本文描述的肽或蛋白质试剂。具体地，可以使用各种各样的方法来将CAR构建体引入到T细胞，所述方法包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低的插入诱变风险。基于转座子的系统相比不包含整合元件的质粒，能够更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ逆转录酶病毒和慢病毒载体。γ逆转录酶病毒相对容易生产、能有效地和永久地转导T细胞，并且在原始人T细胞中从整合立场上具有初步证明的安全性。慢病毒载体也能有效地和永久地转导T细胞，但是制备更昂贵。它们也潜在地比基于逆转酶病毒的系统安全些。

可以将本文描述的肽和蛋白质，通过给予核酸如编码试剂的RNA，和/或通过给予包含核酸如编码试剂的RNA的宿主细胞，递送给患者。当给予患者核酸时，该核酸可以以裸露的形式存在或在合适的递送载体中如以脂质体或病毒颗粒的形式，或在宿主细胞中。提供的核酸可以在延长的时间内生产至少部分地针对治疗蛋白观察的以持续方式降低不稳定性的试剂。如果给予患者的核酸不是在宿主细胞中出现的，优选地其由患者的细胞摄取，以用于表达由该核酸编码的试剂。如果当给予患者的核酸是在宿主细胞中出现，优选地，其由在患者中的宿主细胞表达，以便生产由该核酸编码的试剂。

如本文使用的术语“核酸”，意在包括DNA和RNA，如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链的或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，优选地，核酸是分离的核酸。

核酸可以包含在载体中。如本文使用的术语“载体”，包括任何本领域技术人员已知的载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、病毒载体如腺病毒或杆状病毒(baculoviral)载体、或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母菌人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体和克隆载体。表达载体包含质粒和病毒载体，并且通常包含期望的编码序列和合适的DNA序列，所述合适的DNA序列为在特定宿主有机体(例如，细菌、酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物)或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的。通常使用克隆载体来工程化和扩增某些期望的DNA片段，并且可以缺乏用于期望的DNA片段表达所必需的功能序列。

在本发明的背景下，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选地全部或大体上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基团的2'位置有羟基基团的核酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA)、合成的RNA、重组产生的RNA和修改的RNA(其通过添加、删除、置换和/或变更一个或多个核苷酸而不同于自然发生的RNA)。此类改变可以包括添加非核苷酸材料到诸如RNA的末端，或在例如RNA的一个或多个核苷酸的内部。在RNA分子中的核苷酸，也可以包含非标准核苷酸，如非自然发生的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。可以将这些改变的RNA归类为类似物或自然发生的RNA的类似物。

根据本发明，术语“RNA”包括并且优选地涉及意思是“信使RNA”的"mRNA"，并且涉及可使用DNA作为模板产生的“转录物”，并且编码肽或蛋白质。mRNA通常包含5'非翻译区(5'-UTR)、蛋白质或肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。mRNA在细胞中和体外具有有限的半衰期。优选地，mRNA通过在体外使用DNA模板转录来产生。在本发明的一实施方案中，通过在体外转录或化学合成获得RNA。体外转录方法学对本领域技术人员是已知的。例如，有多种商售的体外转录试剂盒。

在本发明的一实施方案中，RNA是自我复制的RNA，如单链自我复制的RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是正义的单链RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是病毒性RNA，或来源于病毒性RNA的RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是α病毒性基因组RNA，或来源于α病毒性基因组RNA。在一实施方案中，病毒是塞姆利基(Semliki)森林病毒。在一实施方案中，自我复制的RNA包含一个或多个转基因，其中至少一个转基因编码本文描述的试剂。在一实施方案中，如果RNA是病毒性RNA或来源于病毒性RNA，转基因可以部分地或完全地取代病毒性序列，如编码结构蛋白的病毒性序列。在一实施方案中，自我复制的RNA是体外转录的RNA。

为了增加本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可以修饰它，优选地，不改变表达的肽或蛋白质的序列。

根据本发明使用的RNA背景下，术语“修饰”包括不在所述RNA中自然存在的任何RNA修饰。

在本发明的一实施方案中，本发明使用的RNA不具有不加帽的5'-三磷酸。可以通过用磷酸酶处理RNA来实现此类不加帽5'-三磷酸的去除。

为了增加它的稳定性和/或减少细胞毒性，本发明的RNA可以具有修饰的自然发生的或合成的核糖核苷酸。例如，在一实施方案中，在本发明使用的RNA中，部分地或完全地，优选地完全地用胞嘧啶核苷代替5-甲基胞苷。可选地或此外，在一实施方案中，在本发明使用的RNA中，部分地或完全地，优选地完全地用尿嘧啶核苷代替假尿苷。

在一实施方案中，术语“修饰”涉及给RNA提供5'-帽或5'-帽类似物。术语“5'-帽”涉及在mRNA分子5'末端发现的帽结构，并且通常由通过不寻常5'到5'的三磷酸键连接到mRNA的鸟嘌呤核苷酸组成。在一实施方案中，将该鸟嘌呤核苷在第7号位置甲基化。术语“常规5'-帽”涉及自然发生的RNA5'-帽，优选地涉及7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的背景下，术语“5'-帽”包括类似于RNA帽结构的5'-帽类似物，并且被修饰以拥有稳定RNA(如果附加于其上)的能力，优选地在体内和/或在细胞中。

可以通过在存在所述5'-帽或5'-帽类似物下体外转录DNA模板，以实现提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA，其中所述5'-帽通过共转录并入到产生的RNA单链中，或例如可以通过在体外转录产生RNA，并且可以转录后使用加帽酶如牛痘病毒的加帽酶将5'-帽附加到RNA。

RNA可以包含进一步的修饰。例如，本发明使用的RNA的进一步修饰，可以是自然发生的聚(A)尾巴的延长或截断，或5'-或3'-非翻译区(UTR)的改变如引进与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如，插入一个或多个，优选地两拷贝的来源于球蛋白基因如α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白，优选地β球蛋白，更优选地人β球蛋白的3'-UTR。

因此，为了增加本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可以将其修饰以便与聚A序列连接出现，所述聚A序列优选地为具有10到500个，更优选地30到300个，甚至更优选地65到200个，并且特别地100到150个腺苷酸残基的长度。在特别优选的实施方案中，聚A序列具有大约120个腺苷酸残基的长度。此外，将两个或更多个3'-非翻译区(UTR)并入到RNA分子的3'-非翻译区，可以导致翻译效率的增加。在一特定的实施方案中，3'-UTR来源于人β球蛋白基因。

术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及清除分子的活性、总量或总数的一半所需要的时间周期。在本发明的背景下，RNA的半衰期是所述RNA稳定性的指示。RNA的半衰期可以影响RNA的“表达持续时间”。可以预期的是具有长半衰期的RNA将在延长的时间周期中表达。

在本发明的背景下，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，可以将RNA翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包含“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA尤其mRNA，优选地使用合适的细胞提取物在无细胞体系中体外合成的过程。优选地，将克隆载体应用于转录物的产生。通常将这些克隆载体指定为转录载体，并且根据本发明包含在术语“载体”中。

本发明的术语“翻译”涉及在细胞核糖体中的过程，通过其一条信使RNA链指导氨基酸序列的组装以形成肽或蛋白质。

根据本发明，核酸可以是单独存在或与其他可以是同源的或异源的核酸联合存在。在优选的实施方案中，将核酸功能性地连接到针对所述氨基酸可以是同源的或异源的表达控制序列上。术语“同源的”意思是核酸也是功能上自然连接的，并且术语“异源的”意思是核酸不是功能上自然连接的。

核酸和表达控制序列是“功能地”一个链接到另一个的，如果它们是以此类方式共价地一个链接到另一个的，则所述核酸的表达或转录是在所述表达控制序列的控制或影响下。如果核酸是要转录成功能蛋白，然后，表达控制序列功能地连接到编码序列，引进所述表达控制序列导致所述核酸的转录，不会引起在编码序列中的移码或所述编码序列不能被转录成期望的蛋白质或肽。

术语“表达控制序列”或“表达控制元件”根据本发明包含启动子、核糖体结合位点、增强子和其他调控基因转录或mRNA翻译的控制元件。在本发明的特定的实施方案中，可以调控表达控制序列。由于物种的功能或细胞类型，表达控制序列的精确结构可以变化，但是通常包含分别涉及转录和翻译启动的5'-非转录以及5'-和3'-非翻译序列，如TATA盒子、加帽序列、CAAT序列等。更具体地说，5'-非转录表达控制序列包含启动子区，其包含用于功能性连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达控制序列也可以包含增强子序列或上游激活序列。

根据本发明术语“表达”是按它最通常的意思使用的，并且包含例如通过转录和/或翻译来产生RNA和/或肽或蛋白质。至于RNA，术语“表达”或“翻译”，尤其涉及肽或蛋白质的产生。它也包含核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达也包括“异常表达”("aberrant expression")或“反常表达”("abnormal expression")。

根据本发明，“异常表达”或“反常表达”意思是相对于参考(例如在不具有与异常或反常表达某些蛋白如肿瘤抗原相关的疾病的对象中状态)，表达是改变的，优选地是增加的。表达的增加涉及增加了至少10％、尤其至少20％、至少50％或至少100％或更多。在一实施方案中，表达只在病变的组织中发现，而在健康组织中表达是被抑制的。

术语“特异性表达”意思是蛋白基本上只在特定的组织或器官中表达。例如，在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原，意思是所述蛋白质主要表达在胃黏膜，并且不在其他组织表达或在其他组织或器官类型中不能表达至显著的程度。因此，仅在胃黏膜的细胞中表达，并且极少程度在其他组织如睾丸中的蛋白质，是在胃黏膜的细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原也可以在正常情况下在超过一种的组织类型或器官，如2或3种组织类型或器官中特异性表达，但是优选地不超过3种不同的组织或器官类型。在这种情况下，然后肿瘤抗原在这些器官中特异性表达。例如，如果在正常情况下，优选地肿瘤抗原在肺和胃里表达大约相等的程度，所述肿瘤抗原是在肺和胃里特异性表达。

根据本发明，术语“核酸编码的”意思是，如果在合适的环境中优选地在细胞中出现，可以将核酸表达以生产其编码的蛋白质或肽。

本发明的一些方面依赖于宿主细胞的过继性转移，所述宿主细胞是用核酸如编码本文描述的试剂的RNA在体外转染的，并且优选地在体外从低前提频率扩增至临床相关的细胞数后转移至接受者如患者。本发明的用于治疗的宿主细胞相对于受治疗的接受者可以是自体的、同种异体的或同基因的。

术语“自体的”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”涉及来源同一对象的组织或器官的移植。因为它们克服了免疫屏障(否则其会导致排斥)，此类程序是有益的。

术语“同种异体的”用于描述来源于同一物种的不同对象的任何事物。当在一个或多个基因座的基因不是完全相同时，将两个或更多个对象说成彼此是同种异体。

术语“同基因的”用于描述来源于具有完全相同基因型的个体或组织的任何事物，即完全相同的双胞胎或相同的近交品系的动物，或它们的组织。

术语“异源的”用于描述由多个不同元件组成的一些事物。作为实例，将一个体的骨髓转移到不同的个体中构成异源的移植。异源的基因是源自除对象以外的来源的基因。

术语“转染”涉及将核酸尤其RNA引入至细胞中。为了本发明的目的，术语“转染”也包括将核酸引入至细胞，或由此类细胞摄取核酸，其中细胞可以存在于对象(例如患者)中。因此，根据本发明，用于转染本文描述的核酸的细胞，可以在体外或体内存在，例如所述细胞可以形成患者的器官、组织和/或有机体的部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。为了一些转染的应用，如果被转染的基因材料仅仅是瞬时表达的，它是足够的。因为在转染过程中引进的核酸通常不能并入到细胞核的基因组，这些外来的核酸将通过有丝分裂被稀释或被降解。允许核酸的游离基因扩增的细胞，大大地降低了稀释率。如果期望转染的核酸实际上保持在细胞及其子代细胞的基因组中，稳定转染必须发生。可以将RNA转染入细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。

根据本发明，可以使用任何对将核酸引入，即转移或转染至细胞有用的技术。优选地，可以通过标准的技术将RNA转染入细胞。此类技术包括电穿孔、脂质转染和显微注射。在一个本发明的特别优选的实施方案中，通过电穿孔将RNA引入至细胞。

电穿孔或电通透作用涉及由外部施加电场所引起的细胞质膜的导电性和渗透性明显增加。通常用在分子生物学中作为将一些物质引入至细胞的方法。

根据本发明，优选的是，将编码蛋白质或肽的核酸引入至细胞导致所述蛋白质或肽的表达。

根据本发明的术语“肽”包含寡肽和多肽，并且涉及包含通过肽键共价连接的两个或更多，优选地3个或更多，优选地4个或更多，优选地6个或更多，优选地8个或更多，优选地9个或更多，优选地10个或更多，优选地13个或更多，优选地16个或更多，优选地21个或更多，以及多达优选地8、10、20、30、40或50个，尤其是100个氨基酸的物质。术语“蛋白质”涉及大的肽，优选地涉及具有超过100个氨基酸残基的肽，但是通常术语“肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文可互换使用。

根据本发明，肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。在一实施方案中，肽仅仅包括天然氨基酸。

根据本发明，术语“非天然氨基酸”涉及其结构具有不同于20个天然氨基酸种类的结构的氨基酸。因为非天然氨基酸具有的结构类似于天然氨基酸的结构，可以将非天然氨基酸归类为给定天然氨基酸的衍生物或类似物。

优选地，根据本发明描述的蛋白质或肽已经被分离。术语“分离的蛋白质”或“分离的肽”意思是，所述蛋白质或肽已经从它的天然环境中分离。分离的蛋白质或肽可以是基本上纯净的状态。术语“基本上纯净的”意思是在自然或在体内，蛋白质或肽基本上没有与它相关的其他物质。

本文给出的关于特定氨基酸序列(例如那些在序列表中显示的序列)的教导应解释为使得其也涉及所述特定序列的变体，其导致与所述特定序列功能上等同的序列，例如展示的特性与特定氨基酸序列的特性完全相同或相似的氨基酸序列。一重要特性是，保持肽结合到MHC分子和/或到T细胞受体，或T细胞受体结合到其靶标，或是维持T细胞效应功能。优选地，针对特定序列进行修改的序列，当它取代在T细胞受体中的该特定序列时，保持了所述T细胞受体结合到靶标，并且优选地所述T细胞受体或携带如本文所述T细胞受体的T细胞的功能。

例如，可以修改序列表中显示的序列，以便移除一个或多个，优选地所有游离的半胱氨酸残基，尤其通过由不是半胱氨酸的氨基酸，优选地丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸，最优选地丙氨酸或丝氨酸来取代半胱氨酸残基。例如，可以用这种方法修改在序列表的SEQ ID NO:33中显示的序列中第45位置半胱氨酸，或在包含所述序列的序列中的相应半胱氨酸。

本领域技术人员将领会，可以修改尤其是CDR序列的序列、高变区和可变区，而不失去结合到靶标的能力。例如，CDR区将与本文指定的抗体的区完全相同或高度同源。通过“高度同源的”，预期可以在CDR中进行1到5个，优选地1到4个如1到3个、或1个、或2个的置换。此外，可以修改高变和可变区使得它们与本文具体公开的区域显示大量的同源性。

肽“变体”可以保持给定肽的免疫原性(例如，相对于给定肽，变体与T细胞系或克隆的反应能力基本上没有减弱)。换句话说，相对于给定肽，可以提高或不改变变体与T细胞系或克隆的反应能力，或者，相对于给定肽，可以减弱少于50％，并且优选地少于20％的变体与T细胞系或克隆的反应能力。

可以通过评估它结合到MHC分子的能力来鉴定变体。在一优选的实施方案中，变体肽具有修改，使得相对于给定肽，变体肽结合到MHC分子的能力是增加的。相对于给定肽，变体肽结合到MHC分子的能力可以增加至少2倍，优选地至少3倍、4倍或5倍。因此，在某些优选的实施方案中，肽包含这样的变体，其中在免疫原性部分中的1至3个氨基酸残基被替代，使得与T细胞系或克隆的反应能力在统计学意义上大于未修改的肽。优选地，此类置换位于肽的MHC结合位点中。优选的置换允许增加与MHC I类或II类分子的结合。某些变体包含保守的置换。

根据本发明的术语“变体”，也包括突变体、剪接变体、构象、亚型、等位基因变体、物种变体和物种同系物，尤其是自然存在的那些。等位基因变体涉及基因的正常序列的改变，其意义经常是不清楚的。全基因测序经常为给定基因鉴定许多等位基因变体。物种同系物是具有与给定核酸或氨基酸序列不同的物种起源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”将包含任何翻译后修改的变体和构象变体。

为了本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸置换变体。在蛋白质的N末端和/或C末端包含缺失的氨基酸缺失变体，也叫做N末端和/或C末端截断变体。

氨基酸插入变体包含在具体氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，尽管将所得产物适当筛选后的随机插入也是可能的，一个或更多个氨基酸残基是插入在氨基酸序列的具体位点的。

氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸，如1、2、3、5、10、20、30、50或更多氨基酸的氨基末端和/或羧基末端融合。

氨基酸缺失变体的特征是，从序列中除去一个或多个氨基酸，如除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。

氨基酸置换变体的特征是，在序列中将至少一个残基移除并在其位置插入其他残基。将优先权给予这样的修改，其在氨基酸序列中的位置在同源蛋白或肽之间不是保守的，和/或用其他具有相似性质的氨基酸替换氨基酸。优选地，在蛋白质变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即类似的带电荷或不带电荷氨基酸的置换。保守的氨基酸改变包括置换在它们的侧链中有关联的氨基酸家族中的一个氨基酸。通常将天然存在的氨基酸分成四个家族：酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和不带电的极性(甘氨酸、天冬氨酰、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归类为芳香族氨基酸。

在给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间，优选地相似性的程度，优选地同一性将为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地给予氨基酸区域的相似性或同一性的程度是，参考氨基酸序列全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选地给予的相似性或同一性的程度为至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选地连续的氨基酸。在优选的实施方案中，给予的相似性或同一性的程度是参考氨基酸序列的全长。可以使用本领域已知的工具来完成确定序列相似性，优选地同一性的比对，优选地使用最好的序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选地凸点(EMBOSS)::针(needle),矩阵(Matrix):矩阵62(Blosum62),间隙打开10.0(Gap Open 10.0)，间隙延伸0.5(Gap Extend 0.5)。

“序列相似性”表明完全相同的或代表保守的氨基酸置换的氨基酸的百分比。在两条氨基酸序列之间的“序列同一性”，表明在序列之间完全相同的氨基酸的百分比。

术语“百分比同一性”意在表示在最好的比对之后获得的，在要比较的两序列之间完全相同的氨基酸残基的百分比，这一百分比是纯粹统计学的，并且在两序列之间的差异是随机分布并贯穿它们的全长。照惯例在已经最佳比对它们之后，通过比较这些序列来进行两条氨基酸序列之间的序列比较，为了鉴定和比较局部区域的序列相似性，通过节段或通过“窗口比较”进行所述比较。除了手动比较以产生用于比较的序列的最佳比对，还可以通过Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法的手段，通过eddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法的手段，通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性搜索方法的手段，或通过使用这些算法的计算机程序的手段(在威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group.575Science Drive,Madison,Wis.)。

通过确定在被比较的两序列之间完全相同的位置数，用被比较的位置数除以这一数并且用100乘以获得的结果，以便获得这两序列之间的百分比同一性来计算百分比同一性。

根据本发明，同源氨基酸序列展示至少40％，尤其至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％和优选地至少95％，至少98％或至少99％的氨基酸残基同一性。

由本领域技术人员例如通过重组DNA操作可以容易地制备本文描述的氨基酸序列变体。例如，在Sambrook等(1989)中详细地描述了用于制备具有置换、添加、插入或缺失的蛋白质和肽的DNA序列操作。此外，借助已知的肽合成技术，例如通过固相合成和类似的方法，可以容易地制备本文描述的肽和氨基酸变体。

本发明包括由术语“肽”和“蛋白质”包含的本文描述的肽或蛋白质衍生物。根据本发明，蛋白质和肽的“衍生物”是蛋白质和肽的修饰形式。此类修饰包括任何化学的修饰，并且包含任何与蛋白质或肽相关的分子如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽的单个或多个置换、缺失和/或添加。在一实施方案中，蛋白质或肽的“衍生物”包括那些由以下手段产生的修饰的类似物：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、保护/封阻基团的引进、蛋白水解裂解、或者结合到抗体或另外的细胞配体。术语“衍生物”也扩展到所述蛋白质和肽的所有功能性化学等同物。优选地，修饰肽具有增加的稳定性和/或增加的免疫原性。

也包括的是肽的模拟物。此类模拟物可以包含连接到一个或多个氨基酸模拟物上的氨基酸(即，可以由氨基酸模拟物取代的在所述肽中的一个或多个氨基酸)，或可以全部是非肽模拟物。氨基酸模拟物是构象上与氨基酸相似的化合物，例如，以便可以将其用于氨基酸的替代而不大幅度削弱与T细胞系或克隆反应的能力。非肽模拟物是不含有氨基酸并具有类似于肽的整体构象的化合物，例如，以便相对于给定肽的能力，模拟物与T细胞系或克隆反应的能力没有大幅度地削弱。

根据本发明，优选地，氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分(part)或部分(portion)，分别具有它已经衍生自的氨基酸序列、肽或蛋白质的功能性质，即它是功能化的等价物。在一实施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分(part)或部分(portion)，分别与它已经衍生自的氨基酸序列、肽或蛋白质是免疫等价的。在一实施方案中，功能性质是免疫性质。

具体性质是与MHC分子形成复合体，并且(如适当)优选地通过刺激细胞毒性细胞或T辅助细胞来产生免疫反应的能力。

术语“免疫等价”意思是免疫等价的分子如免疫等价的氨基酸序列，展示相同或基本上相同的免疫性质，和/或发挥相同或基本上相同的免疫作用，例如，关于免疫作用的类型如诱导体液和/或细胞免疫应答，诱导的免疫反应的强度和/或持续时间，或诱导的免疫反应的特异性。在本发明的背景下，优选地术语“免疫等价”用于针对用来免疫的肽或肽变体的免疫作用或性质。例如，如果当氨基酸序列暴露于对象免疫系统时能诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列是免疫等价于参考氨基酸序列的。

根据本发明，术语“衍生”意思是具体实体，尤其是存在于其衍生来的客体中的序列，尤其是有机体或分子。在氨基酸序列，尤其是具体序列区域的情况下，“衍生”尤其是指相关氨基酸序列来源于它存在于其中的氨基酸序列。

优选地，术语“细胞”或“宿主细胞”涉及完整的细胞，即有完整膜，其没有释放自己的正常细胞内成分，如酶、细胞器或遗传物质。优选地，完整的细胞是活细胞，即能够执行其正常新陈代谢功能的活细胞。根据本发明，优选地，所述术语涉及任何可以用外源核酸转染的细胞。优选地，当用外源核酸转染并且转移到接受者时，细胞可以在接受者体内表达所述核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；其他有用的细胞是酵母菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括，来自革兰氏阴性细菌菌株如大肠杆菌、变形杆菌属和假单胞菌属菌株的细胞，和来自革兰氏阳性细菌菌株如芽孢杆菌属、链霉菌属、葡萄球菌属和乳球菌属菌株的细胞。合适的真菌细胞包括，来自木霉属、脉孢菌属和曲霉属种类的细胞。合适的酵母菌细胞包括，来自酵母属(例如，酿酒酵母)、裂殖酵母属(例如非洲粟酒裂殖酵母)、毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母和甲醇毕赤酵母)和汉逊酵母属种类的细胞。合适的哺乳动物细胞包括，例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HE等。然而，也可以使用在本领域中用于异源蛋白质表达的两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和任何其他细胞。哺乳动物细胞特别优选地用于过继性转移，诸如来自人类、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。细胞可以来源于很多组织类型，并且包括原始细胞和细胞系如免疫系统细胞，尤其是抗原提呈细胞如树状细胞和T细胞，干细胞如造血干细胞和间充质干细胞，以及其他细胞类型。抗原提呈细胞是在主要组织相容性复合体的背景下在其表面展示抗原的细胞。T细胞可使用它们的T细胞受体(TCR)识别该复合体。

优选地，包含核酸分子的细胞表达由核酸编码的肽或蛋白质。

所述细胞可以是重组细胞，并且可以分泌编码的肽或蛋白质，可在表面上表达它，并且优选地还可表达结合到所述肽或蛋白质的MHC分子或其加工产物。在一实施方案中，所述细胞内源性地表达MHC分子。在进一步的实施方案中，所述细胞以重组的方式表达MHC分子和/或肽或蛋白质或其加工产物。优选地，所述细胞是非增殖的。在优选的实施方案中，所述细胞是抗原提呈细胞，尤其树状细胞、单核细胞或巨噬细胞。

术语“克隆扩增”涉及其中特定实体被增殖的过程。在本发明的背景下，优选地将该术语用于在免疫应答的背景下，其中淋巴细胞由抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特定淋巴细胞得到扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。

可以基于在生物样品中存在特异性与肽反应的T细胞来检测与抗原表达相关的疾病。在某些方法中，将包含分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与本发明的肽、编码此类肽的核酸、和/或表达和/或提呈此类肽的至少免疫原性的部分的抗原提呈细胞一起培养，以及检测所述T细胞的特异性激活与否出现。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可以通过常规技术从患者分离T细胞(诸如通过Ficoll/Hypaque外周血淋巴细胞密度梯度离心)。对于CD4+T细胞，优选地通过评估T细胞的增殖来检测激活。对于CD8+T细胞，优选地通过评估细胞溶解活性来检测激活。相比在无病对象中，增殖水平是至少两倍大，和/或溶解细胞的活性水平更大至少20％，表明在对象中存在与抗原表达相关的疾病。

本文使用的“降低”或“抑制”，意思是引起在水平上整体减少的能力，优选地5％或更大，10％或更大，20％或更大，更优选地50％或更大，和最优选地75％或更大。术语“抑制”或类似的短语，包括完全的或基本上完全的抑制，即降低到零或基本上到零。

术语如“增加”或“增强”，优选地涉及增加或增强约至少10％，优选地至少20％，优选地至少30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少80％，和最优选地至少100％。

可以使用本文描述的试剂、组合物和方法治疗患有如下疾病的对象，例如，以存在表达CLDN6的病变细胞和优选地在MHC分子背景下提呈CLDN6为特征的疾病。可以治疗和/或预防的疾病的实例包括所有表达CLDN6的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。

本文描述的试剂、组合物和方法，也可以用于免疫或接种疫苗以预防本文描述的疾病。

术语“正常组织”或“正常状态”涉及健康组织或在健康对象中的状态，即非病理状态，其中“健康”优选地意思是非癌的。

术语“疾病”涉及影响个体身体的异常状态。常常将疾病解释成与特定症状和病症有关的医疗状况。疾病可以由最初来自外源的因素引起，诸如传染疾病，或它可以由内部功能紊乱引起，诸如自身免疫疾病。在人类中，常常更广泛地使用“疾病”提及引起疼痛、功能紊乱、悲痛、社会问题或死亡到个人折磨，或与个体有关联的那些类似的问题的任何状况。在更广泛的意义上，它有时包括受伤、残疾、失调、综合征、传染病、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下以及为了其他目的，可以将这些认为是可区分的类别。通常，疾病不仅在生理上也在感情上影响个体，因为感染并在生活中患有许多疾病可以改变一个人的生活观点和个性。根据本发明，术语“疾病”包括癌症，尤其是本文描述的那些癌症形式。本文对癌症或癌症具体形式的任何提及，也包括其癌症转移。在优选的实施方案中，根据本发明要治疗的疾病，涉及表达CLDN6和任选地在MHC分子背景下提呈CLDN6的细胞。

根据本发明，“涉及表达CLDN6的细胞的疾病”或类似的表达，意思是在病变组织或器官的细胞中表达CLDN6。在一实施方案中，相对于在健康组织或器官中的状态，在病变组织或器官的细胞中CLDN6的表达是增加。增加是指增加至少10％、尤其至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一实施方案中，只在病变组织中发现表达，而在健康组织中表达是受抑制的。根据本发明，涉及表达CLDN6的细胞的疾病，包括癌症疾病。此外，根据本发明，优选地癌症疾病是其中癌症细胞表达CLDN6的那些。

术语“癌症疾病”或“癌症”涉及或描述通常以未受调控的细胞生长为特征的个体中的生理状态。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，此类癌症的实例包括：骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部的癌症、皮肤或眼内的黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性和生殖器官的癌、何杰金氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、神经外胚层癌、脊髓轴肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明，术语“癌症”也包含癌症转移。优选地，“癌症疾病”是以表达CLDN6的细胞为特征的，并且癌细胞表达CLDN6。

优选地，病变细胞是表达CLDN6的细胞，优选地所述CLDN6出现在所述细胞的表面上作为跨膜蛋白，和/或在MHC如MHC I的背景下由所述细胞提呈。优选地，表达CLDN6的细胞是癌细胞，优选地本文描述的癌症。

在一实施方案中，癌症疾病是以间变、侵袭性和转移的性质为特征的恶性疾病。可以将恶性肿瘤与非癌的良性肿瘤比较，因为恶性在其生长中不是自限性的，是能够侵入到周围组织的，并且可能扩散到远的组织(转移的)，而良性肿瘤不具有那些性质。

根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”涉及由细胞(叫做瘤细胞或肿瘤细胞)异常生长形成的膨胀或损害。“肿瘤细胞”意思是通过快速、不受控制的细胞增殖进行生长并在启动新生长的刺激停止后继续生长的异常细胞。肿瘤显示部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，并且经常形成可能是良性的、变恶性肿瘤前的或恶性的明显组织块。

根据本发明，“癌”是来源于上皮细胞的恶性肿瘤。这组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。

“腺癌”是起源于腺状组织的癌症。该组织也是称作上皮组织的更大组织类别的部分。上皮组织包括皮肤、腺体和多种使身体的腔和器官呈线性的其他组织。上皮细胞在胚胎学上来源于外胚层、内胚层和中胚层。被归类为腺癌的细胞，不一定需要是腺体的部分，只要它们具有分泌的性质。癌的这一形式可以在包括人类的一些较高级哺乳动物中发生。高度分化的腺癌倾向于类似于它们来源的腺状组织，而低分化的可以不是。通过从活组织切片检查给细胞染色，病理学家将确定肿瘤是否为腺癌或一些其他类型的癌症。由于在身体内腺体无处不在的性质，腺癌可以出现在身体的许多组织。虽然每一腺体可能不分泌相同的物质，只要对细胞有外分泌功能，就被认为是腺体的并且因此将它的恶性形式命名为腺癌。如给定足够时间来这样做，恶性腺癌侵入其他组织并且常常转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌，透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。

淋巴瘤和白血病是来源于造血(血液形式)细胞的恶性肿瘤。

再结晶的肿瘤或胚细胞瘤是类似于未成熟的组织或胚胎组织的肿瘤(经常为恶性的)。这些肿瘤中的许多在儿童中最常见。

“转移”意思是癌细胞从它最初的位置扩散到身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，并且依赖于从原发性肿瘤分离恶性细胞、胞外基质的入侵、内皮基底膜渗透进入体腔和血管，并且然后在通过血液运输后浸润到目标器官。最后，在目标位置的新肿瘤生长依赖于血管生成。肿瘤转移经常发生，甚至在移除原发性肿瘤之后，因为肿瘤细胞或成分可以保持并且发展转移潜能。在一实施方案中，根据本发明，术语“转移”是指“远距离转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域淋巴结系统的转移。在一实施方案中，根据本发明，术语“转移”涉及淋巴结转移。

二次或转移性肿瘤的细胞如同最初肿瘤中的那些细胞。这个意思是，例如，如果卵巢癌转移到肝，二次肿瘤由不正常的卵巢细胞组成，而不是不正常的肝细胞。然后将在肝脏中的肿瘤叫做转移性卵巢癌，不是肝癌。

当人又受到过去影响他们的情况影响时，发生了复发或再发生。例如，如果患者已患有肿瘤疾病，已经接受所述疾病的成功的治疗并且再次发展所述疾病，可以将所述新发展的疾病认为是复发或再发生。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发生可能但不一定发生在最初肿瘤的位置。因此，例如，如果患者已患有卵巢肿瘤并且已经接收成功的治疗，复发或再发生可以是卵巢肿瘤的发生，或在不同于卵巢位置的肿瘤发生。肿瘤的复发或再发生也包括，其中肿瘤发生在不同于最初肿瘤部位的位置以及在最初肿瘤位置的状况。优选地，对患者已经接受治疗的最初肿瘤是原发性肿瘤，并且在不同于最初肿瘤位置的肿瘤是二次或转移性肿瘤。

术语“治疗”或“治疗的处理”涉及改善健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病，阻止或减慢个体中疾病的发展，抑制或减慢个体中疾病的发展，减小个体中症状的频率或严重性，和/或减少目前患有或先前已患疾病的个体中的再发生。

术语“预防性治疗”("prophylactic treatment")或“预防治疗”("preventive treatment")涉及意在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”("prophylactic treatment")或“预防治疗”("preventive treatment")在本文可互换使用。

术语“个体”("individual")和“对象”("subject")在本文可互换使用。它们涉及可能受到疾病或失调(例如，癌症)折磨或者对疾病或失调(例如，癌症)是易感的但可能患有或未患有疾病或失调的人类、非人类的灵长类动物或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、犬、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中，个体是人类。除非另规定，术语“个体”("individual")和“对象”("subject")不表示特别的年龄，并且因此包含成年人、上了年纪的人、儿童和新生儿。在本发明的优选实施方案中，“个体”和“对象”是“患者”。根据本发明，术语“患者”意思是需要治疗的对象，尤其患病的对象。

“存在风险”意思是，对象即患者被认为是相对于一般人群，具有比正常更高的发展疾病，尤其癌症的机会。此外，已经患有或目前患有疾病，尤其癌症的对象具有增加的发展疾病的风险，因为此类对象可以连续发展疾病。目前患有或已患有癌症的对象也具有增加的癌症转移的风险。

术语“免疫治疗”是指涉及特异性免疫反应的治疗。

在本发明的背景下，术语如“保护”、“预防”、“预防疾病的”、“预防的”或“防护的”，涉及对象中疾病发生和/或传播的预防或治疗或两者都有并且，尤其涉及将对象发展疾病的机会最小化，或涉及延迟疾病的发展。例如，如上所述的有肿瘤风险的人，将是用于治疗以预防肿瘤的候选人。

免疫治疗的预防性给予，例如本发明试剂或组合物的预防性给予，优选地保护接受者免于疾病的发展。免疫治疗的预防性给予，例如本发明试剂或组合物的治疗性给予，可以导致抑制疾病的进展/发展。这包含疾病的进展/发展的减速，尤其疾病进展的破坏，优选地导致疾病的消除。

可以使用多种技术中的任一种进行免疫治疗，其中优选地本文提供的试剂作用是从患者中移除表达CLDN6的细胞。此类移除可以作为增强或诱导患者体内的特异性针对CLDN6或表达CLDN6和/或在MHC分子的背景下提呈CLDN6的细胞的免疫反应结果而发生。

在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于对内源性宿主免疫系统进行体内刺激，以通过免疫应答修饰性试剂(诸如本文提供的肽和核酸)的给予来针对病变细胞起反应。

在其他的实施方案中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中治疗涉及递送具有已建立的肿瘤免疫反应性的试剂(诸如效应细胞)，其可以直接或间接地介导抗肿瘤作用，并且不一定依赖于完整的宿主免疫系统。效应细胞的实例包括：T淋巴细胞(诸如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助淋巴细胞)，和抗原提呈细胞(诸如树状细胞和巨噬细胞)。可以将本文叙述的特异性针对CLDN6肽的T细胞受体和特异性针对CLDN6的人工T细胞受体，转移入效应细胞用于过继性免疫治疗。

如上述指出的，为了产生足够数量用于免疫治疗的细胞，可以将本文提供的免疫反应性肽用于快速地扩增抗原特异性T细胞培养物。尤其，可采用本领域众所周知的标准技术，用免疫反应性肽脉冲或用一种或多种核酸转染抗原提呈细胞，如树状细胞、巨噬细胞、单核细胞、纤维母细胞和/或B细胞。在治疗中使用的培养的效应细胞必须能够生长和广泛地分布，并且能在体内长期存活。研究已经显示，通过用辅以IL-2的抗原进行反复刺激，可以诱导培养的效应细胞在体内生长，并且以大量的数目长期存活(参见，例如，Cheever等(1997)，Immunological Reviews 157,177)。

可选地，可以将表达本文叙述的肽的核酸引入至取自患者的抗原提呈细胞，并且在体外克隆繁殖以用于移植回入相同的患者。

可以使用本领域已知的任何方法，优选地以无菌形式通过静脉、冠状动脉、腹膜或瘤内给予，将转染的细胞重引入至患者。

本文公开的方法可涉及给予在对肽或表达肽的抗原提呈细胞的应答中已被激活的自体T细胞。此类T细胞可以是CD4+和/或CD8+，并且可以如上所述进行增殖。可以以有效抑制疾病发展的量将T细胞给予对象。

术语“免疫”或“接种疫苗”描述治疗对象的过程，具有为治疗或预防疾病的原因诱导免疫应答的目的。

术语“在体内”涉及在对象中的情况。

根据本发明，“样品”可以是根据本发明的任何有用的样品，尤其生物样品如组织样品，包括体液、和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，诸如，通过组织活检，包括钻取活组织检查，以及通过获取血、支气管抽出物、痰、尿、排泄物或其他体液。根据本发明，术语“样品”也包括处理的样品，如生物样品的片段或分离物，例如，核酸和肽/蛋白质分离物。

可以将本文描述的化合物和试剂以任何合适的药物组合物的形式给予。

优选地，本发明的药物组合物是无菌的，并且包含有效量的本文描述的试剂，以及任选地如本文讨论的其他试剂，以产生期望的反应或期望的效果。

通常，以统一的剂型提供并且可以以自身已知的方式制备本发明的药物组合物。药物组合物可以，例如为溶液或悬浮液的形式。

药物组合物可以包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，优选地，它们中所有的均是药学上可接受的。术语“药学上可接受的”涉及材料的无毒性，所述材料不与药物组合物的活性成分的作用相互影响。

可以将不是药学上可接受的盐用于制备药学上可接受的盐，并且包括在本发明。这种药学上可接受的盐以非限定性方式包含由下述酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、顺丁烯酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、丁二酸等。也可以将药学上可接受的盐制备成碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。

用在药物组合物中的合适缓冲物质，包括醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。

用在药物组合物中的合适防腐剂，包括苯扎氯铵、氯丁醇、尼泊金和硫柳汞。

注射剂型可以包含药学上可接受的赋形剂，如乳酸林格氏液。

术语“载体”涉及天然的或合成的有机或无机成分，其中为了促进、增强或使能够应用，将活性成分联合。

根据本发明，术语“载体”也包括一种或多种适合给予患者的兼容的固体或液体填充料、稀释剂或封装用物质。

用于肠胃外给药的可能的载体物质是，例如无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、聚二醇、氢化萘和，尤其，生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。

当在本文使用时，术语“赋形剂”意在表明，可以出现在药物组合物中并且不是有效成分的所有物质，例如载体、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、增味剂或着色剂。

可以通过任何常规途径如，包括通过注射或输注来给予本文描述的试剂和组合物。优选地，给药是肠胃外给药，如通过静脉、动脉、皮下、皮内或肌内注射给药。

适于肠胃外给药的组合物，通常包含活性化合物的无菌水溶液或非水溶液制备物，优选地与接受者的血液等渗。兼容的载体和溶剂的实例是林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，通常将无菌的固定油用作溶液或悬浮媒介。

以有效的量给予本文描述的试剂和组合物。“有效量”涉及单独或与其他剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病或特定状况的情况下，优选地期望的反应涉及疾病进程的抑制。这包含减慢疾病的进行和，尤其，中断或逆转疾病的进行。在疾病或状况的治疗中，期望的反应也可以是发作的延期，或者所述疾病或状况发作的阻止。

本文描述的试剂或组合物的有效量将依赖于要治疗的状况，疾病的严重性，患者的个体参数(包括年龄、生理状态、体积和重量)，治疗的持续时间，伴随治疗的类型(如果存在)，给药的特定途径和类似的因素。因此，本文描述的试剂的给予剂量，可依赖于多种此类参数。在用初始剂量在患者体内的反应是不足的情况下，可以使用更高剂量(通过不同的、更局部给予途径实现有效的更高剂量)。

可以将本文描述的试剂和组合物，例如体内给予患者以治疗或预防多种诸如本文描述的那些的失调。优选的患者包括患有可以通过给予本文描述的试剂和组合物来纠正和改善的失调的人类患者。这包括涉及以表达CLDN6为特征的细胞的失调。

例如，在一实施方案中，可以将本文描述的试剂用于治疗患有癌症疾病的患者，例如本文描述的以存在表达CLDN6的癌细胞为特征的癌症疾病。

也可以将根据本发明描述的药物组合物和治疗方法用于免疫或接种疫苗，以预防本文描述的疾病。

可以将本发明的药物组合物与补充免疫增强物质如一种或多种佐剂一起给予，并且可以包含一种或多种免疫增强物质以进一步增加它的效力，优选地实现免疫刺激协同作用效果。术语“佐剂”涉及延长或增强或促进免疫应答的化合物。在这方面各种机制是可能的，取决于佐剂的不同类型。例如，允许DC成熟的化合物，例如脂多糖和CD40配体形成第一类合适的佐剂。通常，影响“危险信号”(LPS,GP96,dsRNA等)类型的免疫系统的任何试剂或诸如GM-CSF的细胞因子，可以用作能够以可控制的方式使免疫应答被增强和/或被影响的佐剂。CpG寡脱氧核苷酸也可任选地用在这个背景下，尽管它们在某些情况下发生副作用，如上解释的，也将被考虑。特别优选的佐剂是细胞因子如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα,IFNγ,GM-CSF,LT-α，或生长因子例如hGH。进一步已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如最优选 ISA51。酯肽如Pam3Cys也适合用作本发明的药物组合物中的佐剂。

可以局部地或全身地，优选地全身地给予药物组合物。

术语“全身给药”涉及试剂的给予，使得试剂以显著的量在对象的身体中变得广泛分布，并且发挥期望的作用。例如，试剂可以在血液中发挥期望的作用，和/或通过血管系统到达它期望的作用部位。代表性的全身给药途径包括通过将试剂直接引入血管系统或经口、经肺部的或肌肉内给药，其中试剂是吸附的，进入血管系统，并且通过血管运送到一个或多个期望的作用部位。

根据本发明，优选的全身给药是通过肠胃外给药。术语“肠胃外给药”涉及试剂的给予，使得试剂不能通过肠。术语“肠胃外给药”包括静脉内给药、皮下给药、皮内给药或动脉内给药，但不限于这些。

给药也可以例如，经口、经腹膜内或经肌内实施。

本文提供的试剂和组合物可以单独地或与常规治疗方案如外科手术、辐照、化疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或无关的)联合使用。

下面通过附图和实施例详细地描述本发明，其仅仅用于说明的目的，并且不限制于此。由于说明书和实施例，同样包括在本发明中的其他实施方案对本领域技术人员来说是可获取的。

附图说明

图1：TCR-CD3复合体的示意图。将胞浆内CD3免疫受体基于酪氨酸的激活模式(ITAM)表示为圆柱体(改编自“T细胞受体资料手册”，MP Lefranc,G Lefranc,2001)。

图2：CAR的连续子代的设计。不同子代的CAR的示意图(1G，第一代，2G，第二代，3G，第三代)。第一代包含细胞外scFv和介导细胞毒性的细胞质的CD3ζ链/ZAP70，第二代还有促进增殖的CD28/PI3K，以及第三代还有维持细胞存活的4-IBB或OX40/TRAF(Casucci,M.et al.(201 1)2:378-382)。

图3：用于针对CLDN6的T细胞重定向的不同受体形式的示意图。左边：第二代CAR，其包含CLDN6特异性scFv片段、IgGl衍生的间隔区结构域、CD28共刺激和CD3ζ信号转导结构域(CAR-28ζ)；中间：新CAR形式，其基于scFv与鼠科动物TCRβ链的恒定结构域连接以及鼠科动物TCRα链(CAR/Cα)的恒定结构域的共表达；右边：鼠科动物TCR，其由TCRα/β链组成(mu，鼠科动物TCR)；

图4：在正常组织和不同癌症中的密封蛋白-6表达。用qRT-PCR分析，在不同正常组织和47个卵巢癌样本中的CLDN6mRNA表达。

图5：用于TCR分离和验证的技术平台。该方法整合了从抗原特异性T细胞分离(顶部)到TCR克隆(中间)和TCR验证(底部)的所有步骤。用编码肿瘤抗原的mRNA免疫HLA-A2/DR1转基因小鼠。通过IFNγ-ELISPOT分析这些小鼠的脾脏细胞针对各自抗原的体外反应性，并且在基于激活诱导的CD137表达的体外再刺激后，通过流式细胞术分离抗原特异性鼠科动物CD8+T细胞(顶部)。在多孔板中收获单个细胞，并且经受第一链cDNA合成，以及通过总体PCR扩增步骤进行富集。将TCRα/β可变区克隆到包含恒定区基因盒的用于体外转录(IVT)的载体中(中间)。将TCRα/β链RNA转移到人CD8+T细胞中，与表达合适抗原和HLA分子的APC共培养，以及测试工程化T细胞的功能性重编程(底部)。

图6：通过IFNγ-ELISPOT测定分析来自免疫的HLA-A*02转基因小鼠的脾脏细胞针对CLDN6衍生肽的离体反应性。应用特异性算法(Rammensee H.等人(1999)Immunogenetics(免疫遗传学)50,213-9)预测了HLA-A*02CLDN6特异性结合肽。分析脾脏细胞针对CLDN6肽池或预测的结合HLA-A*02的CLDN6衍生肽A2-1-6的反应性。阳性对照：PMA处理的脾脏细胞；阴性对照：不相干肽池(HIV-gag)、不相干九聚物肽(PLAC 1-31-39)。

图7：在体外再刺激后，用流式细胞术分选来自HLA-A*02转基因小鼠的CLDN6特异性鼠科动物CD8+T细胞。用CLDN6重叠肽池重刺激脾脏细胞后，通过流式细胞术分离单个CD8+/CD137+T细胞，并且在多孔板中收获以用于TCR克隆。对照：用不相干肽池重刺激的脾脏细胞。

图8：对分离自CLDN6免疫小鼠的CD8+T细胞进行TCR特异性测试。用TCR-α/β链RNA转染HLA-A*02阳性健康供体的CD8+T细胞，并且通过IFNγ-ELISPOT测试用CLDN6 RNA转染的或用CLDN6重叠的15mer肽(＝C16池)或CLDN6 HLA-A*02结合肽(C16-A2-1，C16-A2-2)脉冲的K562-A2细胞的识别。阴性对照：不相干肽池、不相干9mer肽；阳性对照：SEB。

图9：在人预激活CD8+T细胞上进行CLDN6特异性鼠科动物TCR的表面表达。用OKT3预激活，并且用20μg TCRα/βRNA转染CD8+T细胞。20h后，用PE-缀合的抗-CD8抗体和APC-缀合的识别鼠科动物TCRβ链恒定结构域的抗体给电穿孔的细胞染色。针对单个淋巴细胞为细胞设门。

图10：由CLDN6特异性TCR介导的肿瘤细胞溶解。用20μg TCRα/βRNA转染预激活的CD8+T细胞，并且在20h后与表达HLA-A*02的CLDN6阳性(PA1-Luc；NIH-OvCar3)或阴性(SK-Mel-37)肿瘤细胞系以30:1的E：T(效应细胞：靶细胞)比例一起共培养。共培养4h后，通过基于荧光素酶的细胞毒性测定分析特异性细胞溶解。

图11：响应表达CLDN6的靶细胞由CLDN6特异性TCR介导的剂量依赖性增殖。用20μg TCR RNA转染并用CFSE标记CD8+T细胞，并且与用滴定量的CLDN6 RNA转染的自体单核细胞共培养。共培养4天后，用APC-Cy7标记的抗-CD8抗体给细胞染色。A)基于CFSE增殖染料的稀释，通过流式细胞术分析特异性增殖。点状图显示在与用lμg CLDN6-RNA转染的单核细胞共培养后活的CD8+T淋巴细胞。B)条柱显示增殖的CD8+T细胞的百分比。

图12：在静止的人CD4+和CD8+T细胞上进行CLD6特异性CAR构建体的表面表达。用10μg CAR RNA转染PBMC。20h后，用PE-缀合的抗-CD8、FITC-缀合的抗-CD4和用Dylight-650标记的独特型特异性抗体给电穿孔的细胞染色。针对单个CD4+或CD8+T细胞为细胞设门。

图13：由不同的CLDN6靶向受体形式介导的肿瘤细胞溶解。用CAR或TCR RNA转染预激活的CD8+T细胞，并在20h后与CLDN6阳性或CLDN6阴性肿瘤细胞系PA1和MDA-MB-231-Luc以不同的E：T比例一起共培养。共培养4h后，通过基于荧光素酶的细胞毒性测定分析特异性细胞溶解。

图14：响应表达CLDN6的靶细胞由CLDN6特异性CAR介导的抗原特异性增殖。用20μg TCR或CAR RNA转染，并用CFSE标记CD8+T细胞，并且与用CLDN6或对照RNA转染的自体iDC共培养4天。A)在用鼠科动物APC-缀合的TCRβ特异性或Dylight650缀合的对象基因型特异性抗体染色后，通过流式细胞术分析TCR/CAR的表面表达。基于CFSE增殖染料的稀释通过流式细胞术分析特异性增殖。

图15：在预激活的CD8+T细胞上进行有突变的半胱氨酸46的CLDN6-CAR-CD28ζ构建体不同突变体的表面表达。用OKT3预激活，并且用20μg CAR RNA转染CD8+T细胞。20h后，用PE缀合的抗CD8抗体和用Dylight650标记的独特型特异性抗体给电穿孔的细胞染色。针对单个分开的细胞和淋巴细胞为细胞设门。

图16：在三个不同供体的预激活的CD8+T细胞上进行有突变的半胱氨酸46的CAR-CD28ζ构建体不同突变体的表面表达。用OKT3预激活，并且用20μg CAR RNA转染CD8+T细胞。20h后，用Dylight650标记的独特型特异性抗体给电穿孔的细胞染色。针对表达CAR的CD8+T淋巴细胞为细胞设门。显示了三个独立实验的结果。顶部：显示CAR+/CD8+T细胞的百分比；底部：显示CAR阳性CD8+T细胞的平均荧光强度；

图17：由有突变的半胱氨酸46的CLDN6-CAR-CD28ζ构建体不同突变体介导的特异性肿瘤细胞溶解。A)在用Alexa647缀合的CLDN6特异性抗体染色后，通过流式细胞术分析在靶细胞系上的CLDN6表面表达。B)用20μg CAR RNA转染预激活的CD8+T细胞，并在20h后与CLDN6阳性(PAl)或CLDN6阴性(MDA-MB-231-Luc-Tomato)肿瘤细胞系以不同的E：T比例一起共培养。共培养4h后，通过基于荧光素酶的细胞毒性测定分析特异性细胞溶解。C)在用荧光染料缀合的CD8特异性和独特型特异性抗体染色后，通过流式细胞术分析在T细胞上的CAR表面表达。

图18：由有突变的半胱氨酸46的CLDN6-CAR-CD28ζ构建体不同突变体介导的剂量依赖性细胞溶解。A)用20μg CAR RNA转染预激活的CD8+T细胞，并在20h后与用滴定量的CLDN6-RNA转染的自体iDC一起共培养(E:T-30:1)。B)在用Alexa647缀合的CLDN6特异性抗体染色后，通过流式细胞术分析在转染的iDC上的CLDN6表面表达。

图19：用于稳定的CAR表达的逆转录病毒SIN构建体的示意图。将质粒pES12.6-CLDN6-CAR-C46S用于使用HEK293T细胞来瞬时产生GALV-包封的SIN载体。

图20：在用于过继性转移到NSG小鼠中的转导的人T细胞上进行CLDN6-CAR和针对不相关肿瘤抗原的CAR检测。分别用定向针对CD8和CD4的荧光染料缀合的抗体(BD Biosciences)，并用定向针对CLDN6-CAR的各自scFv部分的独特型特异性抗体(抗-IMAB206.Ganymed Pharmaceuticals AG)以及针对不相关肿瘤抗原的CAR给细胞染色。针对单个CD8⁺或CD4⁺淋巴细胞为细胞设门。将转导的T细胞用于在OV90-SC12移植的NSG小鼠中进行过继性细胞转移。CLDN6-CAR和针对不相关肿瘤抗原的CAR的转导率分别是约37％的CD4⁺和20％的CD8⁺，以及36％的CD4⁺和24％的CD8⁺细胞。图以对数刻度显示。

图21：在卵巢癌模型中CLDN6-CAR转导的T细胞的抗肿瘤活性。将1x10⁷的人OV90-SC12肿瘤细胞(ATCC CRL11732)皮下注射到NSG小鼠中(10只小鼠/组)。4天后，用单次静脉注射lx10⁷CD3/CD28珠子刺激的、逆转录病毒转导的人T细胞(约37％的CD4和20％的CD8是CLDN6-CAR阳性的)，处理小鼠。A)实验设置的方案。B)与对照组相比，在CLDN6-CAR处理的小鼠中肿瘤生长延期(没有T细胞、未转导的T细胞和用针对不相关肿瘤抗原的CAR转导的T细胞)。每周进行通过体积测量的肿瘤监测和外周血分析。将结果表达为平均肿瘤体积±SEM，全部组为n＝10只小鼠。使用下述公式计算肿瘤体积：V＝1/2*(长度*平方宽度)。在t＝31天，CLDN6-CAR处理的小鼠的图显著地不同于对照处理组(*ANOVA,P<0.05)。C)显示每组的单个小鼠的肿瘤生长曲线。请注意，在第24天由于高肿瘤负荷(用+标记)，不得不处死在未处理肿瘤抗原组中的2只小鼠。

图22：在与表达CLDN6的iDC共培养之后CAR T细胞的增殖。用编码定向针对A)CLDN6或B)不相关肿瘤抗原作为负对照的CAR的IVT-RNA来转染CD8⁺T细胞，并用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)进行标记，并且与用CLDN6转染的自体iDC共培养4天。基于CFSE稀释，通过流式细胞术分析CAR T细胞的增殖。针对单个活的CD8⁺T淋巴细胞为细胞设门。

实施例

本文使用的技术和方法以自身已知的方式在本文描述或实施，其描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y。除非明确指出，包括试剂盒和试剂使用的全部方法均根据制造商的信息实施。

实施例1：材料和方法

细胞系和试剂

在标准条件下培养人慢性骨髓性白血病细胞系K562(Lozzio,C.B.&Lozzio,B.B(1975),Blood 45,321-334)。将用HLA-A*0201(Britten.CM.et al.(2002),J.Immunol.Methods 259.95-1 10)(例如称为K562-A*0201)稳定转染的K562细胞用于验证分析。根据制造商的说明，培养原始人新生儿包皮成纤维细胞系CCD-1079Sk(ATCC No.CRL-2097)。

将表达人类CLDN6的卵巢癌细胞系OV-90-SC12用于CLDN6-CAR的体内验证。

用于PA-1-SC 12_A0201_luc gfp F7的培养基，由86％RPMl 1640+GlutaMAX(Co.Gibco,Cat-No.61870)、10％PCS(Co.Biochrome,Cat-No.S0615)、1％丙酮酸钠(l00mM)(Co.Gibco,Cat-No.11360)、1％MEN非必需氨基酸溶液(100X)(Co.Gibco.Cat-No.11140)、2％碳酸氢钠7.5％溶液(Co.Gibco,Cat-No.25080)组成。

用于OV-90-SC 12的培养基，由41.5％MCDB 105(Co.Sigma Aldrich,Cat-No.M6395-1L)、41.5％Medium 199(Co.Sigma Aldrich.Cat-No.M2154-500mL)、15％PCS(Co.Biochrome,Cat-No.S0615)、2％碳酸氢钠的7.5％溶液(Co.Gibco,Cat-No.25080)组成。

用于SK-MEL-37的培养基，由90％DMEM+GlutaMAX(Co.Gibco,Cat-No.31966)、10％FCS(Co.Biochrome,Cat-No.S0615)组成。用于MDA-MB-231_luc_tom的培养基，由88％RPMl 1640+GlutaMAX(Co.Gibco,Cat-No.61870)、10％FCS(Co.Biochrome,Cat-No.S0615)、1％丙酮酸钠(l00mM)(Co.Gibco,Cat-No.11360)、1％MEN非必需氨基酸溶液(100X)(Co.Gibco.Cat-No.11140)组成。

每2-3天进行细胞系的饲养和/或分离。

外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞和树状细胞(DC)

通过Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)密度梯度离心，从血沉棕黄色层分离PBMC。通过PCR标准方法确定HLA等位基因型。用抗-CD14微珠(Miltenyi Biotech.Bergisch-G lad bach,Germany)富集单核细胞。通过在补充有细胞因子的培养基中分化单核细胞5天获得未成熟的DC(iDC)，其描述于Kreiter等人(2007),Cancer Immunol.Immunother.,CI1,56,1577-87。

肽以及刺激器细胞的肽脉冲

通过标准固相化学(JPT GmbH,Berlin.Germany)，合成对应于密封蛋白-6或HIV-gag的序列的、有11个氨基酸重叠的N-和C-末端游离的15-mer肽池(称为抗原肽池)，并且溶解在DMSO中至0.5mg/ml终浓度。在PBS 10％DMSO中重新组成九聚体肽。在培养基中使用不同肽浓度于37℃培养刺激器细胞1h，用于进行脉冲。

用于RNA体外转录(IVT)的载体

所有构建体是之前描述的pST1-sec-insert-2βgUTR-A(120)-Sap1质粒的变体(Holtkamp,S.et al.(2006),Blood 108,4009-4017)。为了获得编码人TCR链的质粒，从人CD8+T细胞中扩增编码TCR-α、或TCR-β1和TCR-β2恒定区的cDNA，并克隆入这一骨架中。为了产生编码鼠科动物TCR链的质粒，从商业提供者定购编码TCR-α、-β1和-β2恒定区的cDNA，并类似地克隆(GenBank登录号分别是Ml4506、M64239和X67127)。将特异性V(D)J PCR产物引进到此类基因盒中，以产生全长TCR链(称为pSTl–人/鼠科动物TCRαβ-2βgUTR-A(120))。

类似地，从供体的PBCM中克隆个体HLA I类和II类等位基因，并且将来自人DC的β2-微球蛋白(B2M)cDNA插入到这一骨架中(称为pSTl-HLA I/II类-2βgUTR-A(120)和pSTl-B2M-2βgUTR-A(120))。

编码连接到分泌信号(sec)和MHC I类转运信号(MITD)的CMV的pp65抗原(pSTl-sec-pp65-MITD-2BgUTR-A(120))和NY-ESO-I(pSTl-sec-NY-ESO-1-MITD-2BgUTR-A(120))的质粒，是之前描述的(Kreiter,S.等(2008),J.Immunol.180,309-318)。通过克隆从商业提供者获得cDNA(GenBank登录号NM_021796)进入Kreiter等人的骨架，产生了编码PLACl的质粒pST1-sec-PL AC1-MITD-2βgUTR-A(120)，通过克隆从商业提供者获得的cDNA进入以附加的α-球蛋白5'-非翻译区为特征的Holtkamp等人的载体的变体中，产生了编码TPTE的质粒pST1-αgUTR-TPTE-2βgUTR-A(120)和pST1-αgUTR-TPTE-MITD-2βgUTR-A(120)(GenBank登录号AF007118)。

引物从Operon Biotechnologies,Cologne,Germany购买。

体内转录的(IVT)RNA的产生和转移进细胞

按照之前描述的(Holtkamp,S.等人(2006).Blood 108,4009-4017)进行IVT RNA的产生，并且添加到在预冷的4mm间隙无菌电穿孔小池(Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich.Germany)中的X-VIVO 15培养基(Lonza.Basel.Switzerland)中悬浮的细胞。用Gene-Pulser-II装置(Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich,Germany)(T细胞:450V/250μF；IVSB T细胞:350V/200μF；SupTl(ATCC No.CRL-1942):300V/200μF；人DC:300V/150μF；K562:200V/300μF)，进行电穿孔。

通过用IVT RNA对HLA A2.1/DR1小鼠进行节内免疫在体内诱导T细胞

通过使用编码抗原的IVT RNA进行重复的节内免疫，在体内诱导针对目标抗原的A2/DR1小鼠T细胞(Kreiter S.et al.(2010),Cancer(Pajot A.et al.(2004),Eur.J.Immunol.34,3060-69)。为了节内免疫，用甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉小鼠。外科手术暴露腹股沟淋巴结，使用有超细针的一次性0.3-ml注射器(31G,BD Biosciences)，缓慢注射在林格氏液中稀释的10μL RNA(20μg)和无核糖核酸酶的水，并且将伤口闭合。在六次免疫循环之后，将小鼠处死并且分离脾脏细胞。

脾脏细胞的收获

在它们解剖之后，在无菌条件下将脾脏转移到含有PBS的离心管中。用镊子机械地将脾脏分解，并且用细胞过滤器(40μm)获得细胞悬浮液。用PBS洗涤脾细胞，离心并且在低渗的缓冲液中重悬以用于红细胞溶解。在室温孵育5min后，通过加入20-30ml培养基或PBS停止反应。将脾脏细胞离心，并且用PBS洗两遍。

在CD137染色后，抗原特异性CD8+T细胞的单细胞分选

为了抗原特异性重刺激，将来自免疫的A2/DR1小鼠的2.5x10^6/孔的脾脏细胞接种到24孔板中，并且用编码目标抗原或对照抗原的重叠肽池进行脉冲。在24h孵育之后，收获细胞，用FITC-缀合的抗-CD3抗体、PE-缀合的抗CD4抗体、PerCP-Cy5.5-缀合的抗-CD8抗体和Dylight-649-缀合的抗-CD137抗体染色。在BD FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分选。分选CD137、CD3和CD8阳性的细胞，在含有人CCD-1079Sk细胞作为饲养层细胞的96孔V-底部板中收获每孔一个细胞，在4℃离心，并且立即在-80℃储存。

来自分选的细胞的RNA提取物、基于SMART的cDNA合成和非特异性扩增

根据供应商的说明，用RNeasy微型试剂盒(Qiagen.Ililden,Germany)提取来自分选的T细胞的RNA。将改进的BD SMART方案用于cDNA合成：将BD PowerScript逆转录酶(BD Clontech,Mountain View.CA)与用于启动第一链合成反应的寡(dT)-T-引物长以及与用于引进寡(riboG)序列的TS-短(Eurogentec S.A.,Seraing,Belgium)进行联合，以允许通过逆转录酶的末端转移酶活性产生延长的模板并用于模板的开关(Matz,M.et al.(1999)Nucleic Acids Res.27,1558-1560)。使根据制造商的说明合成的第一链cDNA在200μΜdNTP存在时，经历采用5U PfuUltra Hotstart高保真DNA聚合酶(Stratagene.La Jolla,CA)和0.48μΜ引物TS-PCR引物的21个循环的扩增(循环条件：在95℃2min，在94℃30s，在65℃30s，在72℃1min，在72℃最后延伸6min)。用人或鼠科动物TCR-β恒定区特异性引物控制TCR基因的成功扩增，并且如果检测到强的带，则仅执行了连续的克隆型特异性人或鼠科动物Vα-/Vβ-PCR。

用SuperScriptll逆转录酶(Invitrogen)和寡(dT)引物以及1-5μg从患者来源的PBMC提取的RNA，合成了用于扩增HLA I类或II序列的第一链cDNA。

设计用于TCR和HLA扩增的PCR引物

为了设计人TCR共有序列引物，将在ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www.imgt.org)中列举的所有67个TCR-Vβand 54TCR-Vα基因(开放型阅读框和假基因)与它们的相应先导序列一起，用BioEdit序列比对编辑器比对(例如http://www.bio-soft.net)。设计有最多3个简并碱基、GC含量在40-60％之间和在3'末端是G或C的24-27bp长度的正向引物，以与尽可能多的前导序列退火，并且配备有15bp的以稀有的限制性酶位点和Kozak序列为特征的5'延伸。设计反向引物，以与恒定区基因的第一外显子退火，引物TRACex1_as结合到对应于Cα的氨基酸7至16的序列，以及引物TRBCex1_as结合到对应于Cβl和Cβ2中的氨基酸(aa)8到16的序列。两个寡核苷酸都是用5'磷酸合成的。将引物合并在有相同退火温度的2-5个正向寡核苷酸的池中。

复制这一策略用于鼠科动物TCR共有序列引物的设计，比对129个列举的TCR-Vα和35个列举的TCR-Vβ基因。反向引物mTRACexl_as和mTRBCexl_as分别与对应于aa 24-31和aa8-15的序列是同源的。

通过用BioEdit序列比对编辑器，比对在Anthony Nolan研究所网站(www.anthonynolan.com)上列举的所有HLA I类和II类序列，设计了HLA共有序列引物。将与尽可能多一个基因座的HLA序列退火的、有最多3个简并但编码保留的碱基的23-27bp长度的正向引物，配备有5'-磷酸和Kozak序列延伸。类似地设计反向引物，但没有引入摆动碱基，并且配备有14bp的编码AsiSI限制性酶位点的5'延伸。

V(D)J序列的PCR扩增和克隆

在0.6μΜVα-/Vβ特异性寡核苷酸池、0.6μΜCα-或Cβ-寡核苷酸、200μΜdNTP和5U Pfu聚合酶存在时，使3-6μl来自分离的T细胞的预扩增cDNA经受40个PCR循环(循环条件：在95℃2min，在94℃30s，退火温度30s，在72℃1min，最后72℃6min延伸时间)。使用Qiagen毛细管电泳系统分析PCR产物。将在400-500bp有带的样品在琼脂糖凝胶上按大小分块，用凝胶回收试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)切除并纯化条带。进行序列分析以显示V(D)J结构域和β恒定区两者的序列，因为引物TRBCex1_as和mTRBCex1_as各自匹配分别在人和小鼠中的TCR恒定区基因β1和β2。将DNA消化并且克隆到包含用于完整TCRα/β链的合适骨架的IVT载体中。

流式细胞检测分析

使用针对TCRβ链的合适可变区家族或恒定区的、PE-缀合的抗-TCR抗体(Beckman Coulter Inc.,Fullerton.USA)和FITC/APC-标记的抗-CD8/-CD4抗体(BD Biosciences)，通过流式细胞术分析转染的TCR基因的细胞表面表达。使用能识别包含在所有CLDN6-CAR结构中的scFv片段的Dylight-650-缀合的独特型特异性抗体(GanymedPharmaceuticals)，分析转染的CAR的细胞表面表达。通过用FITC-标记的HLA II类特异性抗体(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,USA)和PE-标记的HLA I类特异性抗体(BD Biosciences)染色，检测HLA抗原。通过用Alexa-Fluor647-缀合的CLDN6-特异性抗体(Ganymed Pharmaceuticals)染色，分析在靶细胞(BD Biosciences)上的CLDN6表面表达。在FACS CANTO II流式细胞仪上，使用FACS Diva软件进行流式细胞检测分析。

荧光素酶细胞毒性分析

为了评估细胞介导的细胞毒性，将基于生物体发光的分析确定作为针对⁵¹Cr释放的替代选择和最优选择。相对于标准的铬释放分析，这一分析通过计算共孵育之后活的表达荧光素酶的靶细胞数，测量效应细胞的细胞溶解活性。用编码来自萤火虫(Photinus pyralis)(EC 1.13.12.7)的萤火虫荧光素酶的荧光素酶基因稳定或瞬时地转染靶细胞。荧光素酶是催化荧光素氧化的酶。该反应是ATP依赖的，并且发生在以下两个步骤：

荧光素+ATP→荧光素化腺苷酸+PP_i

荧光素化腺苷酸+O₂→氧化荧光素+AMP+光

以每孔10⁴个细胞的浓度将靶细胞铺在白色96孔板中(Nunc,Wiesbaden,Germany)，并且与不同数量的TCR-转染的T细胞共培养，终体积是100μl。3h后，向细胞中加入50μl包含反应混合物(荧光素(1μg/μl)、HEPES缓冲液(50mM,pH)、腺苷酸5'-三磷酸(ATP酶，0.4mU/μΙ,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA))的D-荧光素(BD Biosciences)。通过将ATP酶加入到反应混合物中，减弱了从死细胞释放的荧光素酶发出的荧光。

在总计4h的孵育时间之后，使用Tecan Infinite 200阅读器(Tecan,Crailsheim,Germany)测定由活细胞发射的生物光。细胞杀伤活性是针对通过添加2％Triton-X 100诱导完整细胞溶解之后获得的荧光值进行计算，并且仅与由靶细胞单独发射的荧光相关联。数据输出是每秒钟计数的(CPS)，并且按下述计算特异性溶解的百分比：

(l-(CPS_exp-CPS_min)/(CPS_max–CPS_min)))*100。

在没有效应物时孵育靶细胞之后，评估最大荧光(最大每秒钟计数，CPS_max)，以及在用清洁剂Triton-X-100处理靶标以完全溶解之后，评估最小荧光(CPS_min)。

ELISPOT(酶联免疫斑点分析)

在室温用抗-IFNγ抗体1-Dl k(Mabtech,Stockholm.Sweden)包被微量滴定板(Millipore.Bedford,MA,USA)过夜，并且用2％人血清蛋白(CSL Behring,Marburg,Germany)封闭。一式三份，将2-5x 10⁴/孔的抗原提呈刺激器细胞与电穿孔24h后的0.3-3x10⁵/孔的TCR-转染的CD4+或CD8+效应细胞一起接种。将板孵育过夜(37℃,5％CO₂)，用PBS 0.05％Tween 20洗涤，并且与1μg/ml终浓度的抗-IFNγ生物素化的mAB 7-B6-1(Mabtech)在37℃孵育2小时。将亲和素结合的辣根过氧化物酶H(Vectastain Elite Kit；Vector Laboratories,Burlingame,USA)添加到孔中，在室温孵育1小时，并且用3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma,Deisenhofen,Germany)显影。

CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)扩增分析

用TCR或CAR RNA转染CD8+T细胞，并用2.5μΜCFSE标记。洗涤标记的T细胞，并与RNA转染的自体单核细胞或iDC共培养(E:T(效应细胞:靶(肿瘤)细胞)＝10:1)。在共培养4天后收获细胞，并且基于在细胞分裂后子代细胞中的CFSE荧光进行性二等分，用流式细胞术分析增殖。

用于稳定的CAR表达的逆转录病毒构建体

为了稳定表达用作负对照的针对不相关肿瘤抗原的CLDN6-CAR或CAR，使用逆转录病毒SIN载体ES I 2.6(图19)。

人T细胞的转导

为了小鼠过继性细胞转移(ACT)实验，在塑料附着2h之后，通过去除单核细胞从健康供体的PBMC中富集人T淋巴细胞。在补充有5％人AB血清(Invitrogen)、100U/ml IL2(Proleukin S,Novartis)、20ng/ml IL7(Miltenyi)、10ng/ml IL15(Miltenyi)的X-Vivol 5(Lonza)培养基中，培养T淋巴细胞，并且用磁性抗-CD3/抗-CD28珠子(Dynabeads磁珠；Invitrogen)以CD3细胞和珠子为1:3的比例进行刺激，并且在刺激后第3和4天用逆转录病毒上清液转导。在补充有5％人AB血清、300U/ml IL2、20ng/ml IL7和10ng/ml IL15的X-Vivol 5培养基中扩增细胞。37℃、5％CO₂、95％rH下孵育(图20)。

用于抗肿瘤活性体内验证的小鼠模型

通过皮下注射1x10⁷OV90-SC 12人卵巢肿瘤细胞到8-14周龄的NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtml Wjl/SzJ(NSG)小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，建立异种移植肿瘤。4天后，用单次静脉注射1x10⁷的CAR转导的T细胞(20-37％CAR阳性)处理小鼠。通过使用卡尺进行体积测量，每周进行肿瘤监测(图21(a))。

实施例2：分离特异性针对密封蛋白-6的高亲和力HLA-A*02限制性鼠TCR

通过用编码CLDN6的IVT-RNA的重复节内免疫，我们验证在A2/DR1小鼠中CLDN6的免疫原性的潜能，并将这些小鼠的脾脏细胞用于CLDN6特异性T细胞的分离，以及随后的相应TCR基因的克隆(图5)。针对CLDN6特异性T细胞的成功诱导和它们对预测的离体结合HLA-A*02的CLDN6肽的反应性，通过IFNγ-ELISPOT测定分析免疫小鼠的脾脏细胞(图6)。

通过RNA免疫，可以在全部三只小鼠中诱导CLDN6特异性T细胞的有效频率，然而T细胞反应性集中在预测的有最好的HLA-A*02结合得分的两个CLDN6肽上(C16-A2-1和C16-A2-2)。

为了分离CLDN6特异性T细胞，在体外再刺激免疫小鼠的脾脏细胞，并且基于激活诱导的CD137上调，通过流式细胞术分选(图)。

可以从全部三只免疫的A2/DR1小鼠中取回CLDN6特异性CD8+T细胞，并且从单分选的鼠T细胞克隆出总共11个CLDN6特异性TCR。

TCR经受了免疫学验证分析，其显示六个CLDN6-TCR识别的HLA-A*0201限制表位CLDN6-91-99(C16-A2-1)以及四个CLDN6-TCR均是针对CLDN6-14-22(C16-A2-2)具有特异性的，然而，这两个表位是之前通过离体ELISPOT分析鉴定的(图8)。一个CLDN6-TCR(TCR_CD8-CLDN6#7)识别的肽CLDN6-7-15(C16-A2-3)。

实施例3：特异性针对CLDN6 91-99的鼠科动物TCR的对比试验

鉴定出总共六个鼠科动物TCR全部识别HLA-A*02限制性表位CLDN 6-91-99。为了确认这一表位是自然处理的并且由内源表达CLDN6的肿瘤细胞系提呈，以及为了评估鉴定的鼠科动物TCR介导的此类细胞的杀伤潜能，进行基于荧光酶的细胞毒性分析。用TCR RNA转染人预激活的CD8+T细胞，并且通过流式细胞术分析表面表达(图9)。由用特异性针对鼠科动物TCR-β链的恒定结构域的荧光染料缀合的抗体的染色表明，全部鼠科动物TCR在RNA转移后均表达于高百分比人CD8+T细胞上。将TCR转染的T细胞与表达CLDN6的肿瘤细胞系PAl(畸胎瘤)和NIH-Ovcar3(卵巢癌)一起，经受基于荧光素酶的细胞毒性分析。CLND6阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为阴性对照。全部TCR介导的、表达CLDN6的肿瘤细胞系的有效溶解，范围从38-94％的PAl和29-76％的NIH-Ovcar3，而未转染的T细胞没有观察到溶解(图10)。当使用mTCR_CD8-CLDN6#1、#8或#18时，大部分靶细胞被溶解。

为了分析是否鼠科动物TCR可以在与表达自体抗原的靶细胞共培养后介导人T细胞的特异性增殖，进行了CFSE增殖分析(图11)。将TCR转染的CD8+T细胞与用滴定量的CLDN6RNA转染的自体单核细胞共培养。在与CLDN6-RNA转染的CD14+细胞共培养4天后，通过CFSE增殖染料的稀释指示了全部TCR介导的特异性增殖，而再一次mTCR_CD8-CLDN6#1、#8或#18显示最好的结果，特别是当低量的CLDN6RNA被转染入靶细胞时。我们决定使用mTCR_CD8-CLDN6#18与靶向CLDN6的CAR形式一起作为用于先导结构选择的金标准。

实施例4：密封蛋白-6特异性CAR的产生和体外验证

我们评估特异性靶向在表达CLDN6的靶细胞上的CLDN6的两种不同CAR形式。其中一种代表基于scFv与鼠科动物TCRβ链的恒定结构域连接和TCRα链(CAR/Cα)的恒定结构域的共表达的新形式(Voss RH等人,(2011)Molecular Therapy(分子治疗)1 9,增刊,S86)(图3)。第二种形式代表经典的第二代CAR(CAR-28ζ)，其分别包含CD3ζ和CD28的信号转导和共刺激部分。一旦CAR衔接，在CD28内结构域中缺失lck结合部分取消了IL2的分泌，以防止调节T细胞的诱导(Kofler D.M.等人,(2011)Molecular Therapy(分子治疗)19(4),760-767)。在CAR细胞外部分中的IgGl Fc‘间隔区’结构域的修饰，避免了‘脱靶’激活和非计划中启动固有免疫应答(Hombach A.等人,(2010)Gene Therapy(基因治疗)17,1206-1213)。

因为CAR提供HLA-非依赖性scFv-介导的抗原结合，它们在CD4+和CD8+T细胞中均是有功能的。因此，在将CAR RNA转染入大多数PBCM后，我们首先分析在CD4+和CD8+T细胞上的CAR表面表达。

两者，新的CAR/Cα和经典的第二代CAR(CAR-28ζ)，在RNA转移后均在人T细胞表面上表达(图12)。CAR-28ζ比CAR/Cα显著地更好地表达在CD4+和CD8+T细胞表面上。为了CAR和Cα基因的同步表达，将后者通过CAR和Cα链共转染，或作为基于2A肽的双顺反子载体转移。流式细胞分析显示，基于2A的CAR和Cα连接导致与两成分共表达相比的表面表达减少。因为双顺反子载体可用于临床测试，必须进一步地改进两个CAR/Cα成分的连接。

为了分析由不同的CLDN6-靶向受体形式介导的特异性肿瘤细胞溶解，进行基于荧光素酶的细胞毒性分析。将CAR-或TCR-转染的预激活的CD8+T细胞与CLDN6阳性或阴性肿瘤细胞系以不同的效应物与目标的比例一起培养，并且在共培养4h后计算特异性细胞溶解(图13)。全部CAR-和TCR-转染的T细胞，与未转染的T细胞相比显示出表达CLDN6的肿瘤细胞系的显著特异性细胞溶解。

在患者体内的CAR工程化T细胞的增殖和持久性的先决条件是，存在如由在恶性血液病中的CD19特异性CAR的有希望的临床试验结果所显示的抗原。类似于通过RNA免疫进行内源性T细胞的扩增，我们想要分析，是否CAR T细胞也可以通过使用RNA接种靶细胞来扩增，以为CAR T细胞刺激提供天然的CLDN6。使用CAR转染的CD8+T细胞与CLDN6或对照RNA转染的自体iDC一起，进行体外增殖分析(图14)。mTCR_CD8-CLDN6#18介导了响应CLDN6-转染的靶细胞的最好的增殖(73％)。CLDN6-CAR-28ζ也导致相当比例的增殖的T细胞(44％)，而CLDN6-CAR/Cα大概由于缺乏CD28介导的共刺激没有成功诱导增殖。因为诱导增殖是成功的抗肿瘤活性的先决条件，我们决定将CAR-28ζ形式用于进一步的先导结构选择。

实施例5：用于临床前和临床试验的CLDN6-CAR-28ζ先导结构选择

负责抗原识别的CLDN6-CAR-28ζscFv片段，包含未配对的半胱氨酸。因为此类游离的半胱氨酸可以在某些情况下导致CAR蛋白的错误折叠或通过二硫键的形成导致与其他半胱氨酸的不需要的相互作用，我们决定消除这一半胱氨酸，并由丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸交换它。

我们比较分析了与表面表达(图15、16)和细胞毒性(图17)有关的产生的CLDN6-CAR-28ζ构建体。除了甘氨酸变体之外，全部的突变构建体显示与野生型突变体相当的表面表达和细胞溶解。

为了比较突变的CAR构建体的亲和力，分析了其响应用滴定量的CLDN6 RNA转染的自体iDC的细胞毒性潜能。即使非常少量的CLDN6 RNA(0.001μg)也导致了由全部CAR构建体介导的靶细胞显著溶解。因为CLDN6-CAR-28ζ的丝氨酸变体显示稍微更好的与表面表达和细胞毒性有关的结果，我们决定使用这一变体用于临床前试验。

实施例6：CLDN6-CAR的体内抗肿瘤活性

在已经在体外确定了针对表达CLDN6的肿瘤细胞系的抗肿瘤活性后，确定了在荷瘤小鼠中的抗肿瘤能力。因此，在异种移植模型中，将CLDN6-CAR转导的人T细胞的效价，与用针对不相关肿瘤抗原和未转导T细胞的对照CAR转导的T细胞进行比较。将总数为lx10⁷的人卵巢癌细胞系OV90-SC12的细胞，皮下注射到NSG小鼠中。在肿瘤移植后四天，用单次静脉注射lx10⁷的CAR转导T细胞处理小鼠。通过使用卡尺进行体积测量，每周进行肿瘤监测。相比用不相关的肿瘤抗原CAR转导的、未转导T细胞处理的对照组或没有接受T细胞的组，用CLDN6-CAR转导T细胞处理的小鼠显著地减慢肿瘤的生长(图21(b)和(C))。

实施例7：响应表达CLDN6的靶细胞的CLDN6-CAR T细胞的体外增殖

类似于通过RNA免疫进行内源性T细胞的扩增，通过体外增殖测定分析使用RNA接种靶细胞来刺激和扩增的CAR T细胞以提供天然的CLDN6。用编码针对CLDN6或作为阴性对照的不相关肿瘤抗原的CAR的IVT-RNA转染CD8+T细胞，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记，并且与CLDN6转染的自体iDC共培养4天(图22)。可以观察到响应CLDN6转染的iDC的几乎全部CD8+T细胞的CLDN6-CAR介导的增殖(95％)，而对不相关抗原CAR转染的T细胞只可以观察到背景增殖(1.5％)，这表明增殖不是依赖于CAR骨架而是CLDN6特异性。

CLDN6特异性T细胞表位

A2-1(aa 91-99)

ALFGLLVYL

A2-2(aa 14-22)

TLLGWVNGL

A2-3(7-15)

QILGVVLTL

CLDN6特异性T细胞受体

TCR_CD8-mC16#l：

SEQ ID NO:6；>Vα9N.3 J13 C

MLLALLSVLGIHFLLRDAQAQSVTQPDARVTVSEGASLQLRCKYSYFGTPYLFWYVQYPRQGLQLLLKYYPGDPVVQGVNGFEAEFSKSNSSFHLRKASVHWSDWAVYFCAVSMSSGTYQRFGTGTKLQVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFlTDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:7；>Vβ29 Dl J2.5 C2

MRVRLISAVVLCFLGTGLVDMKVTQMPRYLIKRMGENVLLECGQDMSHETMYWYRQDPGLGLQLIYISYDVDSNSEGDIPKGYRVSRKKREHFSLILDSAKTNQTSVYFCASSSQNQDTQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#2：

SEQ ID NO:8；>Vα6N.6 J23 C

MDSFPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGQVTVSESKSLIINCTYSATSIGYPNLFWYVRYPGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKEATSFHLQKASVQESDSAVYYCALNNQGKLIFGQGTKLSIKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:9；>Vβl 3.2 D l J2.4 C2

MGSRLFFVLSSLLCSKHMEAAVTQSPRNKVAVTGGKVTLSCNQTNNHNNMYWYRQDTGHGLRLIHYSYGAGSTEKGDIPDGYKASRPSQENFSLILELATPSQTSVYFCASGGDSQNTLYFGAGTRLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#3：

SEQ ID NO:18；>Vα16N J6 C

MLILSLLGAAFGSICFAATSMAQKVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYKQTASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMRDSSGGNYKPTFGKGTSLVVHPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:19；>Vβ2 D2 J2.4 C2

MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWYRQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQEDWGSQNTLYFGAGTRLSVLEDLPNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#7：

SEQ ID NO:28；>Vα6N.7或Vα6D.7_4 J26 C

MDSFPGFMTVMLLIFTRAHGDSVTQTEGQVALSEEDFLTIHCNYSASGYPALFWYVQYPGEGPQFLFRASRDKEKGSSRGFEATYDKGTTSFHLRKASVQESDSAVYYCALGNNYAQGLTFGLGTRVSVFPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:29；>Vβ13.3Dl J1.4_02 C1

MGSRLFFVVLILLCAKHMEAAVTQSPRSKVAVTGGKVTLSCHQTNNHDYMYWYRQDTGHGLRL1HYSYVADSTEKGDIPDGYKASRPSQENFSLILELASLSQTAVYFCASSTGNERLFFGHGTKLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

TCR_CD8-mC16#8：

SEQ ID NO:10；>Vα16N J13 C

MLILSLLGAAFGSICFATSMAQKVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYKQTASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMREAANSGTYQRFGTGTKLQVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:11；>Vβ2 Dl J1.3 C1

MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKTLICEQYLGHNAMYWYRQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQQNSGNTLYFGEGSRLIVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

TCR_CD8-mC16#10：

SEQ ID NO:20；>Vα13D.4_03 J42 C

MKRLVCSLLGLLCTQVCWVKGQQVQQSPASLVLQEGENAELQCNFSSTATRLQWFYQRPGGSLVSLLYNPSGTKHTGRLTSTTVTKERRSSLHISSSQTTDSGTYFCAMSSNSGGSNAKLTFGKGTKLSVKSNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:21；>Vβ4_02 D2 J2.7 C2

MGCRLLSCVAFCLLGIGPLETAVFQTPNYRVTRVGNEVSFNCEQTLDHNTMYWYKQDSKKLLKIMFSYNNKQLIVNETVPRRFSPQSSDKAHLNLRIKSVELEDSAVYLCASSDWGDSYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#12：

SEQ ID NO:12；>Vα3.3 J50 C

MKTVTGPLFLCFWLQLNCVSRGEQVEQRPPHLSVREGDSAVITCTYTDPNSYYFFWYKQEPGASLQLLMKVFSSTEINEGQGFTVLLNKKDKRLSLNLTAAHPGDSAAYFCAVESSSFSKLVFGQGTSLSVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLR1LLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:13；>Vβ26 D2 J2.5 C2

MATRLLCYTVLCLLGARILNSKVIQTPRYLVKGQGQKAKMRCIPEKGHPVVFWYQQNKNNEFKFLINFQNQEVLQQIDMTEKRFSAECPSNSPCSLEIQSSEAGDSALYLCASSLTGGAQDTQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#13：

SEQ ID NO:22；>Vαl6N J22 C

MLILSLLGAAFGSICFAATSMAQKVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYKQTASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMRVASSGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:23；>Vβ2 Dl J2.1 C2

MGS1FLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKIL1CEQYLGHNAMYWYRQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQGDNNYAEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYE1LLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#14：

SEQ ID NO:14；>Vα4N.4或Vα4D.4_03 16 C

MQRNLVAVLGILWVQICWVRGDQVEQSPSALSLHEGTGSALRCNFTTTMRAVQWFRKNSRGSLINLFYLASGTKENGRLKSAFDSKERYSTLHIRDAQLEDSGTYFCAAEGGGNYKPTFGKGTSLVVHPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:15；>Vβ31 D l J l.l C1

MLYSLLAFLLGMFLGVSAQTIHQWPVAEIKAVGSPLSLGCTIKGKSSPNLYWYWQATGGTLQQLFYSITVGQVESVVQLNLSASRPKDDQFILSTEKLLLSHSGFYLCAWSPPINTEVFFGKGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

TCR_CD8-mC16#15：

SEQ ID NO:24；>Vα3.1 J39 C

MKTVTGPLLLCFWLQLNCVSRGEQVEQRPPHLSVREGDSAIIICTYTDSATAYFSWYKQEAGAGLQLLMSVLSNVDRKEEQGLTVLLNKKDKRLSLNLTAAHPGDSAVYFCATNAGAKLTFGGGTRLTVRPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQTNVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:25；>Vβ4 D2 J2.7 C2

MGCRLLSCVAFCLLGIGPLETAVFQTPNYHVTQVGNEVSFNCKQTLGHDTMYWYKQDSKKLLKIMFSYNNKQLIVNETVPRRFSPQSSDKAHLNLRIKSVEPEDSAVYLCASSLYWGDSYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#17：

SEQ ID NO:26；>Vαl4.3或Vαl4D.3/DV8_08 J22 C

MDKNLTASFLLLGLHLAGVSGQQEKRDQQQVRQSPQSLTVWEGETAILNCSYENSAFDYFPWYQQFPGEGPALLISILSVSDKKEDGRFTIFFNKREKKLSLHIADSQPGDSATYFCAASLSSGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:27；>Vβ3 D2.12.7 C2

MDIWLLGWIIFSFLEAGHTGPKVLQIPSHQIIDMGQMVTLNCDPVSNHLYFYWYKQILGQQMEFLVNFYNGKVMEKSKLFKDQFSVERPDGSYFTLKIQPTALEDSAVYFCASSLVGGYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

TCR_CD8-mC16#18：

SEQ ID NO:16；>Vα6D.6_02 J4 C

MDSSPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGPVTVSESESLIINCTYSATSIAYPNLFWYVRYPGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKETTSFHLQKASVQESDSAVYYCALGETGSFNKLTFGAGTRLAVCPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:17；>Vβ26 Dl J2.7 C2

MATRLLCYTVLCLLGARILNSKVIQTPRYLVKGQGQKAKMRC1PEKGHPVVFWYQQNKNNEFKFLINFQNQEVLQQIDMTEKRFSAECPSNSPCSLEIQSSEAGDSALYLCASSLGIYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS