阳离子脂质的制造方法与流程

本发明涉及一种阳离子脂质的制造方法。

背景技术：

核酸药物作为新一代药物而引人注目，但是为了将核酸有效地引入细胞，需要载体。载体粗略地分为病毒载体和非病毒载体。相比非病毒载体，病毒载体具有高核酸引入率，但是不能解决毒性的问题。因此，非病毒载体虽然引入率低于病毒载体，但由于其高安全性而引人注意。

作为非病毒载体，已经报道了使用由阳离子脂质、peg脂质等构成的脂质膜的载体和使用由阳离子聚合物构成的胶束的载体，并且已经积极地进行了对使用能够通过脂质的组成来控制功能的脂质膜的载体的研究。在脂质膜中使用的脂质中，最影响核酸引入率的脂质是阳离子脂质。

阳离子脂质通常具有一个季铵基和两个疏水基团。典型的阳离子脂质包括n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(n-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride)(以下称为dotap-cl)和n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(n-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride)(以下称为dotma-cl)。这些脂质由于相比于其他已知的阳离子脂质具有高核酸引入率，是最广泛地使用的阳离子脂质。

通过将油酰基或者油基引入二甲胺基丙二醇并且随后利用氯甲烷进行季铵化反应(quaternization)而获得dotap-cl和dotma-cl(非专利文献1)。然而，由于氯甲烷在常温常压下是气体，因此其必须使用高压反应容器，例如高压釜。此外，由于氯甲烷是剧毒性的，所以存在在处理其和使用装置时需要特别注意安全性的缺陷。

为了上述理由，已经研发并报道了不使用氯甲烷的dotap-cl或者dotma-cl的制造方法。在非专利文献2中，将油酰基引入二甲胺基丙二醇，通过使用碘甲烷合成n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化铵(以下称为dotap-i)，并且随后通过装有离子交换树脂的色谱柱使用氯离子置换dotap-i的碘离子。

然而，非专利文献2描述的方法对于获得的脂质需要大量的离子交换树脂。另外，为了执行有效的阴离子交换，由于溶液中dotap-i的浓度必须稀释，所以需要将dotap-i溶解在大量溶剂中，使得生产规模非常大。此外，由于在离子交换柱中的阴离子交换后必须移除大量溶剂，所以该方法效率低并且工业上不优选。

因此，在专利文献1中，通过重复四次将1n盐酸的甲醇溶液加入n-[1-(2,3-二亚油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化铵或者n-[1-(2,3-二亚油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化铵的二氯甲烷溶液，搅拌并用氯化钠溶液洗涤的操作而进行阴离子交换。然而，该方法不仅具有低的阴离子交换率，并且由于在如dotap-cl的分子中具有酯键的情况下，由于与酸水解产生例如脂肪酸的杂质，所以，为了获得具有药用所需的纯度的产物，还需要效率低的纯化步骤，例如，柱纯化。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：biochem.，84，7413(1987)

非专利文献2：biochim.biophys.acta，1299，281(1998)

专利文献

专利文献1：jp-a-2014-132014

技术实现要素：

本发明要解决的问题

如上所述，如今已经报道的阳离子脂质的制造方法是需要特殊生产设备的制造方法或者包括离子交换柱的效率极低的制造方法，并且尚未建立高纯度阳离子脂质的高效工业制造方法。

本发明的目的是提供一种阳离子脂质的工业制造方法，其不需要特殊的设备，并且通过该方法能够有效率地获得高纯度的阳离子脂质。

解决问题的手段

在常见的平衡反应中，平衡能够通过将产物从反应系统中排出而向一个方向倾斜。例如，在用于从各种卤代烷获得烷基碘化物的芬克尔斯坦(finkelstein)反应中，反应由于副产物钠盐的析出而进行。

因此，作为针对阴离子交换是平衡反应的事实的集中研究的结果，本发明人发现，当式(1)表示的阳离子脂质与具有任意阴离子的四烷基铵盐在有机溶剂中反应时，通过阴离子交换形成的四烷基碘化铵析出使得反应有效率地进行，并且其后通过过滤去除四烷基碘化铵并且浓缩滤液以增加阴离子交换率，从而完成本发明。

根据本发明的一种阳离子脂质的制造方法的特征在于，式(1)表示的阳离子脂质与具有x^-的四烷基铵盐在有机溶剂中混合，并且在通过过滤分离析出的四烷基碘化铵后，浓缩滤液以至少析出四烷基碘化铵，从而获得式(2)表示的阳离子脂质：

其中，在式(1)中，r¹、r²、和r³各自表示具有1～6个碳原子的烃基，并且r⁴和r⁵各自表示具有10～22个碳原子的酰基或者具有10～22个碳原子的烃基；

其中，在式(2)中，r¹、r²、和r³各自表示具有1～6个碳原子的烃基，r⁴和r⁵各自表示具有10～22个碳原子的酰基或者具有10～22个碳原子的烃基，并且x^-表示氯离子、溴离子、氟离子、醋酸根离子、甲基磺酸根离子、或者对甲苯磺酸根离子。

本发明的效果

因为能够有效率地获得高纯度阳离子脂质而不需要特殊设备，本发明作为阳离子脂质的工业制造方法是非常有用的。

附图说明

图1示出实施例1获得的dotap-cl的滴定结果。

图2示出实施例2获得的dotma-cl的滴定结果。

图3示出比较例1获得的dotap-cl的滴定结果。

具体实施方式

式(1)或者式(2)中的r¹至r³各自代表具有1～6个碳原子的烃基。r¹至r³中的每个可以是直链的、分支的或环状的，或者r¹和r²可以相互成键以形成环。r¹至r³可以是相互相同或不同的。烃基中碳原子的数量优选为1～3，并且更优选为1。

构成r¹至r³中的每个的具有1～6个碳原子的烃基包括，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环戊基、环己基和苯基。在r¹和r²相互成键以形成环的情况下，示例了四亚甲基、五亚甲基等。r¹至r³中的每个优选为甲基、乙基、丙基或者异丙基，并且更优选为甲基。

式(1)或者式(2)中的r⁴和r⁵各自表示具有10～22个碳原子的酰基或者具有10～22个碳原子的烃基，可以是直链的或者分支的，可以是饱和或者不饱和的，并且可以是相互相同或不同的。酰基或者烃基中碳原子的数量优选地为14以上，优选为18以下，并且更优选为18。

构成r⁴至r⁵中的每个的具有10～22个碳原子的酰基包括，例如，癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基、二十一烷酰基、二十二烷酰基、癸烯酰基、十一碳烯酰基、十二碳烯酰基、十三碳烯酰基、十四碳烯酰基、十五碳烯酰基、十六碳烯酰基、十七碳烯酰基、十八碳烯酰基、十九碳烯酰基、二十碳烯酰基、二十一碳烯酰基、二十二碳烯酰基、癸二烯酰基、十一碳二烯酰基、十二碳二烯酰基、十三碳二烯酰基、十四碳二烯酰基、十五碳二烯酰基、十六碳二烯酰基、十七碳二烯酰基、十八碳二烯酰基、十九碳二烯酰基、二十碳二烯酰基、二十一碳二烯酰基、二十二碳二烯酰基、十八碳三烯酰基、二十碳三烯酰基、二十碳四烯酰基、二十碳五烯酰基、二十二碳六烯酰基、异硬酯醇基和四甲基十六碳烯基(叶绿醇残基)，并且优选地为十四烷酰基、十四碳烯酰基、十六烷酰基、十六碳烯酰基、十八烷酰基、十八碳烯酰基或者十八碳二烯酰基，并且更优选为十八烷酰基、十八碳烯酰基或者十八碳二烯酰基。

构成r⁴至r⁵中每个的具有10～22个碳原子的烃基包括，例如，癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬酯醇基和四甲基十六碳烯基(叶绿醇残基)，并且优选为十四烷基、十四碳烯基、十六烷基、十六碳烯基、十八烷基、十八碳烯基或者十八碳二烯基，并且更优选为十八烷基、十八碳烯基或者十八碳二烯基。

式(2)中的x^-表示除碘离子以外的卤离子、羧酸根离子或者有机磺酸根离子。x^-具体地包括氯离子、溴离子、氟离子、醋酸根离子、甲基磺酸根离子和对甲苯磺酸根离子，并且优选为氯离子或者甲基磺酸根离子，并且更优选为氯离子。

通过在有机溶剂中混合式(1)表示的阳离子脂质和具有x^-的四烷基铵盐以进行阴离子交换而获得式(2)表示的阳离子脂质。阴离子交换是平衡反应，并且通过析出几乎不溶的阴离子交换副产物四烷基碘化铵，该系统的平衡向产生式(2)表示的阳离子脂质的一侧倾斜。具有x^-的四烷基铵盐的x^-与式(2)表示的阳离子脂质的x^-相同。

关于本发明的制造方法的阴离子交换步骤中使用的具有x^-的四烷基铵盐，当成键的烷基的碳原子数量太大时，副产物四烷基碘化铵容易溶解在反应中使用的有机溶剂中，并且平衡几乎不倾斜，使得式(2)表示的阳离子脂质的产量减小。因此，四烷基铵盐的烷基的碳原子数量为1～4，优选为1～2，并且更优选为1。

具有x^-的四烷基铵盐包括，例如，四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基氟化铵、四甲基醋酸铵、四甲基甲磺酸铵、四甲基对甲苯磺酸铵、四乙基氯化铵、四乙基溴化铵、四乙基氟化铵、四乙基醋酸铵、四乙基甲磺酸铵、四乙基对甲苯磺酸铵、四丙基氯化铵、四丙基溴化铵、四丙基氟化铵、四丙基醋酸铵、四丙基甲磺酸铵、四丙基对甲苯磺酸铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氟化铵、四丁基醋酸铵、四丁基甲磺酸铵和四丁基对甲苯磺酸铵，并且优选为四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基氟化铵、四甲基醋酸铵、四甲基甲磺酸铵、四甲基对甲苯磺酸铵、四乙基氯化铵、四乙基溴化铵、四乙基氟化铵、四乙基醋酸铵、四乙基甲磺酸铵或者四乙基对甲苯磺酸铵，并且更优选为四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基氟化铵、四甲基甲磺酸铵或者四甲基对甲苯磺酸铵。

关于具有x^-的四烷基铵盐的用量，当其太小时，式(2)表示的阳离子脂质的收率降低。当其太大时，用于溶解具有x^-的四烷基铵盐的溶剂的量增加，由于生产率降低从而其是不优选的。因此，具有x^-的四烷基铵盐的用量优选为相对于式(1)表示的阳离子脂质的1.5～10.0当量，更优选为2.0～5.0当量。

出于提高式(1)表示的阳离子脂质和四烷基铵盐的离子的离解度的目的，本发明的制造方法的阴离子交换步骤中使用的有机溶剂优选为质子极性溶剂。具体地，低级醇，例如，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇或者叔丁醇是优选的，并且乙醇是更优选的。

关于本发明的制造方法的阴离子交换步骤中使用的有机溶剂的用量，当其太小时，搅拌困难，并且当其太大时，由于生产率降低而不优选。具体地，有机溶剂的用量优选为相对于式(1)表示的阳离子脂质的5～30倍重量，更优选为10～20倍重量。

本发明的制造方法的反应温度不特别限定，只要其为式(1)表示的阳离子脂质和具有x^-的四烷基铵盐能够在有机溶剂溶解的温度即可，并且其通常为0～120℃，并且优选为10～60℃。

根据本发明的制造方法，在使式(1)表示的阳离子脂质与具有x^-的四烷基铵盐在有机溶剂中反应之后，析出的四烷基碘化铵通过过滤分离，并且通过蒸发器浓缩滤液，以析出溶解在滤液中的四烷基碘化铵，从而使平衡向产生式(2)表示的阳离子脂质的系统倾斜，使得式(1)表示的阳离子脂质的残余量能够进一步减少。当滤液的浓度不足并且浓缩物中残留大量溶剂时，式(1)表示的阳离子脂质残留并且式(2)表示的阳离子脂质的纯度降低。因此，浓缩物的重量优选为式(1)表示的阳离子脂质的投料量的2倍重量以下，更优选为1.6倍重量以下。

除了式(2)表示的阳离子脂质以外，滤液的浓缩物包含过量使用的具有x^-的四烷基铵盐。为了除去具有x^-的四烷基铵盐，浓缩物在难以溶解具有x^-的四烷基铵盐的非质子溶剂中分散，并且通过过滤分离不溶物。通过过滤分离的不溶物包含具有x^-的四烷基铵盐和四烷基碘化铵。然后，对滤液进行脱溶剂从而能够容易地获得高纯度的式(2)表示的阳离子脂质。能够使用的非质子溶剂包括，例如，丙酮、乙腈、甲基叔丁基酯、乙酸乙酯、氯仿和己烷，并且优选为丙酮或者乙酸乙酯。

关于非质子溶剂的用量，当其太小时，搅拌困难，并且当其太大时，由于生产率降低而不优选。具体地，非质子溶剂的用量优选为相对于式(1)表示的阳离子脂质5～30倍重量，更优选为10～20倍重量。

通过式(3)表示的化合物和烷基碘化物的季铵化反应获得式(1)表示的阳离子脂质。

在式(3)中，r¹、r²、r⁴和r⁵各自具有与式(1)或者式(2)中限定的相同的含义。

关于烷基碘化物的用量，当其太小时，反应不完全，并且当其太大时，由于生产率降低而不优选。因此，烷基碘化物的用量优选为相对于式(3)表示的化合物的1.1～3.0当量，更优选为1.2～2.0当量。

在季铵化反应中，能够使用溶剂。使用的溶剂不特别限定，只要其溶解式(3)表示的化合物和烷基碘化物并且不抑制所述反应即可。

关于季铵化反应中溶剂的用量，当其太小时，搅拌困难，并且当其太大时，由于生产率降低而不优选。因此，溶剂的用量优选为相对于式(3)表示的化合物的5～30倍重量，更优选为8～20倍重量。

关于季铵化反应的反应温度，当其太低时，反应无法进行，并且当其太高时，由于发生副反应并且期望产物的产量降低而不优选。因此，季铵化反应的反应温度优选为0～100℃，并且更优选为20～70℃。

通过3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇与脂肪酸的酯化或者3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇与具有离去基团的烃的醚化而获得式(3)表示的化合物。3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇可以适当地合成或者可以使用可商购的化合物。可商购3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇包括，例如，3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇、3-(二乙氨基)-1,2-丙二醇、3-(二丁氨基)-1,2-丙二醇、3-吡咯烷基-1,2-丙二醇、3-哌啶基-1,2-丙二醇和3-(二戊氨基)-1,2-丙二醇，并且优选为3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇、3-(二乙氨基)-1,2-丙二醇或3-(二丁氨基)-1,2-丙二醇，并且更优选为3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇。

关于酯化中使用的脂肪酸的量，当其太大时，脂肪酸残留导致期望产物的纯度降低。当其太小时，反应在单酯体阶段停止导致期望产物的纯度降低。因此，脂肪酸的用量优选为相对于3(二烷氨基)-1,2-丙二醇的1.9～2.5当量，更优选为2.0～2.4当量。

在酯化中，可以使用缩合剂。关于缩合剂，能够使用碳二亚胺缩合剂、脲阳离子缩合剂、鏻离子缩合剂等，并且从高反应性和高可用性的角度，碳二亚胺缩合剂是优选的。碳二亚胺缩合剂包括，例如，n,n’-二环己基碳二亚胺、n,n’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐，并且从反应后移除的简易性的角度，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐是优选的。

关于酯化中使用的缩合剂的量，当其太大时，作为中间产物的酸酐的形成受阻。当其太小时，原材料残留并且产量减少。因此，缩合剂的用量优选为相对于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的2.0～3.0当量，更优选为2.2～2.6当量。

关于酯化中使用的溶剂，从提高反应效率和抑制副产物的形成的角度，具有高原材料可溶性的溶剂是优选的。此外，在使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为缩合剂的情况下，由于作为副产物的一种的尿素能够通过用水洗涤而去除，所以与水不相容的溶剂是优选的。具体地，氯仿或者二氯甲烷是优选的。

关于酯化中使用的溶剂的量，当其太大时，生产率降低。当其太小时，反应溶液粘性增加而导致搅拌困难。因此，溶剂的量优选为相对于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的30～120倍重量，更优选为50～100倍重量。

关于酯化的反应温度，当其太低时，反应无法进行，并且当其太高时，产生副产物n-酰基脲使得产量降低。具体地，酯化的反应温度优选为0～40℃，并且更优选为10～30℃。

关于醚化中使用的具有离去基团的烃的用量，当其太大时，具有离去基团的烃残留导致期望产物的纯度降低。当其太小时，反应在单酯体阶段停止导致期望产物的纯度降低。因此，具有离去基团的烃的用量优选为相对于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的1.9～3.0当量，更优选为2.0～2.5当量。

在醚化中，碱用作催化剂。关于碱，能够使用例如氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠或者叔丁醇钾。关于催化剂的用量，当其太小时，反应无法进行，并且当其太大时，由于生产率降低而不优选。因此，碱的用量优选为相对于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的2.0～15.0当量，更优选为5.0～10.0当量。

关于醚化中使用的溶剂，对碱稳定并且与水不相容的溶剂是优选的。具体地，己烷或者甲苯是优选的，并且己烷是更优选的。

关于醚化的反应温度，当其太低时，反应无法进行，并且当其太高时，由于进行副反应并且期望产物的产量降低而不优选。具体地，的反应温度优选为40～120℃，并且更优选为60～100℃。

实施例

(碘离子含量和氯离子含量的分析方法)

通过本发明的制造方法获得的式(2)表示的阳离子脂质中的碘离子含量和氯离子含量能够通过电势滴方法而确定，使用例如银/氯化银电极作为电极并且硝酸银作为滴定剂。具体地，约1g式(2)表示的阳离子脂质溶解在100ml乙醇中。银/氯化银电极浸入溶液中，并且通过添加硝酸银水溶液(n/100，n/10)同时用搅拌器搅拌而进行滴定以测量电势差。以滴定量标绘电势差，并且能由首先出现的拐点(拐点1)处的滴定量确定碘离子含量，并且能够由第二拐点(拐点2)处的滴定量和拐点1处的滴定量之间的差确定氯离子含量。

(制造例1)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n-二甲胺(以下称为dodap)的制造

在120g氯仿中溶解2.00g(16.78mmol)3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇(tokyochemicalindustryco.,ltd.的产品)、9.48g(33.56mmol)油酸(extraolein99，nofcorp.的产品)和0.41g(3.36mmol)4-二甲氨基吡啶(koeichemicalco.,ltd.的产品)。向溶液中添加7.72g(40.27mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(tokyochemicalindustryco.,ltd.的产品)，随后在20～30℃搅拌。一小时后，用120g离子交换水和120g25重量％的氯化钠水溶液洗涤混合物，向有机层添加3.0g无水硫酸镁，随后搅拌。通过过滤分离硫酸镁，并且利用蒸发器对滤液进行脱溶剂，从而获得dodap(产量：11.12g，17.16mmol)。

(制造例2)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化铵(以下称为dotap-i)的制造

在30g丙酮中溶解3.00g(4.63mmol)dodap，并且向溶液中添加0.99g(6.94mmol)碘甲烷(kantochemicalco.,inc.的产品)，随后在20～30℃搅拌。5小时后，通过过滤分离析出的晶体并且干燥，从而获得dotap-i(产量：2.94g，3.72mmol)。

(制造例3)

油基甲磺酸酯(oleylmethanesulfonate)(以下称为ole-ms)的制造

在1,450g脱水甲苯中溶解290g(1.08mol)油醇(nofable(注册商标)ao-99，nofcorp.的产品)，并且将溶液冷却至5～10℃。向溶液添加131g(1.30mol)三乙胺(kantochemicalco.,inc.的产品)，随后在5～10℃搅拌10分钟，并且然后逐滴缓慢加入136g(1.19mol)甲磺酰氯(kantochemicalco.,inc.的产品)。在5～15℃搅拌一小时后，通过过滤分离析出的盐酸三乙胺，并且滤液用580g离子交换水洗涤两次。向有机层添加87g无水硫酸镁，随后搅拌，并且然后过滤。利用蒸发器对滤液进行脱溶剂，从而获得ole-ms(产量：335g，0.97mol)。

(制造例4)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n-二甲胺(以下称为dodma)的制造

向1168g己烷添加233g(4.15mol)氢氧化钾(kantochemicalco.,inc.的产品)，随后边搅拌边添加55g(0.46mol)1,2-丙二醇(tokyochemicalco.,ltd的产品)。然后，向其中加入320g(0.92mol)ole-ms，随后在38～42℃搅拌。7小时后，反应溶液冷却至15℃，并且用640g蒸馏水和256g乙腈洗涤3次。在用768g乙腈进一步萃取和洗涤4次后，通过蒸发器对上层进行脱溶剂，从而获得黄色液体。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝95/5～70/30(v/v)))使用硅胶来纯化黄色液体，从而获得dodma(产量：157g，0.25mol)。

(制造例5)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化铵(以下称为dotma-i)的制造

在30g丙酮中溶解3.00g(4.84mmol)dodma，并且向溶液中添加1.03g(7.26mmol)碘甲烷，随后在20～30℃搅拌。3小时后，利用蒸发器对反应溶液进行脱溶剂，从而获得dotma-i(产量：3.70g，4.86mmol)。

(实施例1)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap-cl)的制造

在20g甲醇中溶解1.39g(12.66mmol)四甲基氯化铵(kantochemicalco.,inc.的产品)，并且向溶液中添加2.0g(2.53mmol)dotap-i，随后在20～30℃搅拌。一小时后，通过过滤分离析出的晶体，并且通过蒸发器浓缩滤液。向浓缩物中添加20g乙酸乙酯，随后在20～30℃搅拌。一小时后，通过过滤分离不溶物，并且对滤液进行脱溶剂，从而获得dotap-cl(产量：1.65g，2.36mmol)。

(实施例2)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma-cl)的制造

在20g甲醇中溶解1.44g(13.12mmol)四甲基氯化铵，并且向溶液中添加2.0g(2.63mmol)dotma-i，随后在20～30℃搅拌。一小时后，通过过滤分离析出的晶体，并且通过蒸发器浓缩滤液。向浓缩物中添加20g乙酸乙酯，随后在20～30℃搅拌。一小时后，通过过滤分离不溶物，并且对滤液进行脱溶剂，从而获得dotma-cl(产量：1.65g，2.36mmol)。

(比较例1)

在35ml二氯甲烷中溶解1.50g(1.90mmol)dotap-i。向溶液中添加8ml1n盐酸的甲醇溶液，随后在20～30℃搅拌。此外，向其中添加12ml25重量％的氯化钠水溶液，随后在20～30℃搅拌，并且然后分离和收集有机层。向剩下的水层添加4ml二氯甲烷，随后搅拌，并且收集有机层并且和之前收集的有机层混合。在重复从添加1n盐酸的甲醇溶液起的一系列操作4次后，用18ml25重量％的氯化钠水溶液洗涤收集的有机层，向其中添加5.0g无水硫酸钠，随后搅拌，并且然后过滤。对滤液进行脱溶剂，从而获得dotap-cl的粗产物。通过柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～75/25(v/v)))使用硅胶来纯化粗产物以去除副产物，例如，脂肪酸，从而获得dotap-cl(产量：1.26g，1.80mmol)。

(dotap-cl或者dotma-cl中碘离子含量和氯离子含量的分析)

将实施例和比较例中获得的约一克dotap-cl或者dotma-cl溶解在100ml乙醇中。将银/氯化银电极浸入溶液中，并且通过添加硝酸银水溶液(n/100，n/10)同时用搅拌器搅拌而进行滴定以测量电势差。以滴定量标绘电势差，并且由出现的拐点1处的滴定量确定碘离子含量，并且由拐点2处的滴定量和拐点1处的滴定量之间的差确定氯离子含量。

标绘了dotap-cl的分析结果(图1、2和3)。图1示出实施例1获得的dotap-cl的滴定结果。图2示出实施例2获得的dotma-cl的滴定结果。图3示出比较例1获得的dotap-cl的滴定结果。

分别对于实施例1和2获得的dotap-cl和dotma-cl，能够根据滴定开始后即刻出现的拐点1处的滴定量(小于0.001mmol)看到碘离子含量极小。此外，能够看到包含的氯离子含量几乎与拐点2处的滴定量和拐点1处的滴定量之间的差的理论值相同，并且确认离子交换定量地进行并且能够获得dotap-cl或者dotma-cl。氯离子纯度(氯离子与碘离子和氯离子总量的比率)为99摩尔％以上。

另一方面，对于比较例1中获得的dotap-cl，包含0.181mmol碘离子，并且氯离子纯度为90摩尔％(表1)。根据上述结果，确认本发明的制造方法作为式(2)表示的阳离子脂质的制造方法是有用的。

表1

*氯离子含量/(碘离子含量+氯离子含量)×100

虽然已经参考其具体实施例详细地描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，能够在不背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明进行各种变化或修改。

本申请基于2014年12月8日提交的日本专利申请(日本专利申请号2014-247723)，并且其全文作为参考并入本申请。另外，本文引用的所有文献作为整体并入本文。