延续细胞培养基的材料和方法与流程
本申请根据35u.s.c.§119，要求2014年11月25日提交的序列号为62/084356的美国临时申请的优先权的权益，本文以该申请为基础并将其全文通过引用结合于此。
背景技术：
在细胞培养系统中，细胞在培养中生存所需要的营养物质存在于浸泡细胞的液体培养基(media)中。为了将细胞在静置培养中维持较长的一段时间，在培养基中提供了在较长的一段时间内足以喂养细胞的营养物质的浓度。然而，营养物质随着时间而分解。例如，在细胞培养基中提供了谷氨酰胺和葡萄糖，谷氨酰胺是一种必需氨基酸；葡萄糖为能量代谢所必需。这些营养物质随着时间而分解。这些营养物质的分解可受营养物质自身的浓度的影响。营养物质(例如谷氨酰胺和葡萄糖)的分解产物对细胞可能是有毒性的。因此，为了延续细胞培养的寿命，在细胞培养基中提供相对高浓度的营养物质可能会导致培养基对细胞变得有毒性，因为营养物质会随着时间分解。这些作用可能会限制细胞培养的寿命。
本公开涉及用于向培养的细胞持续并控制地递送营养物质的材料，以提供适于延续细胞培养持续时间的环境。
发明概述
本公开提供了一个暴露于细胞培养的表面，所述表面具有延续培养基的材料，所述材料隔离或捕获了细胞培养的营养物质并提供了以控制和持续的方式释放营养物质的机制，这使得更长时间地供养了培养中的细胞。在实施方式中，延续培养基的材料为施涂到细胞培养表面的涂层或膜，其能够随着时间释放细胞培养的营养物质。在实施方式中，本文公开的延续培养基的材料为在水性环境中膨胀至小于50重量％水的聚合物，所述聚合物与营养物质一起混合，或者捕获了营养物质，或者含有营养物质。在实施方式中，营养物质以结晶或固体形式被聚合物捕获或隔离。
在另外的实施方式中，本公开提供了在具有延续培养基的材料的细胞培养表面的存在下，培养细胞的方法，其中在聚合物基质(matrix)中被捕获的营养物质，在水性培养基的存在下溶解，并且缓慢释放到培养基中。当所述营养物质溶于水性环境中时，在聚合物基质的囊(pocket)中可以建立渗透泵，使得营养物质从聚合物囊的浓度更高的环境流到培养基中。在聚合物基质中，营养物质的这一隔离使得营养物质缓慢引入培养基而不用开启细胞培养容器。这一隔离还使得在较低浓度的营养物质的存在下可在静置培养或者动态培养条件下培养细胞，所述营养物质在较高的浓度下可能对细胞有直接或间接的毒性。
在实施方式中，本公开提供了一种细胞培养容器，其具有一个表面，所述表面包含延续细胞培养基的材料。在实施方式中，延续细胞培养的材料可为涂层或膜，或者为作为膜的涂层。在实施方式中，所述延续细胞培养基的材料包括吸湿性聚合物，所述吸湿性聚合物包括至少一种被隔离的营养物质。在实施方式中，细胞培养容器包括至少一个细胞培养区室，每个细胞培养区室包括底板(bed)、顶板(ceiling)和至少一个壁。在实施方式中，延续细胞培养基的材料位于细胞培养区室的底板上、顶板上或壁上，或者在底板、顶板或壁的组合之上。
在实施方式中，本公开提供了一种延续细胞培养基的材料，其包括吸湿性聚合物和至少一种营养物质。在实施方式中，所述延续细胞培养基的材料形成了细胞培养容器的部分或微载体的部分。在实施方式中，所述吸湿性聚合物包括eva，并且所述至少一种营养物质为葡萄糖、谷氨酰胺或者葡萄糖与谷氨酰胺的组合。
在实施方式中，本公开提供了一种培养细胞的方法，所述方法包括：(a)将细胞引入到细胞培养室中，所述细胞培养室包括延续细胞培养基的材料，其中，所述延续细胞培养基的材料包括吸湿性聚合物，所述吸湿性聚合物包括至少一种被隔离的营养物质；(b)在l-谷氨酰胺浓度小于2mm的培养基的存在下，在静置培养中孵育细胞。在实施方式中，谷氨酰胺浓度在0至1.5mm之间。
附图的简要说明
在本公开的实施方式中：
图1a和1b为在一个实施方式中的细胞培养容器的示意图。图1b为在图1a中示出的细胞培养容器的横截面，其从图1a中示出的平面a-a处截取。
图2为在另一个实施方式中，作为微载体形式的细胞培养表面的示意图。
图3a-3e为在图1b中示出的在平面a-a处截取的细胞培养容器的横截面，其示出了在细胞培养容器的内表面上的材料的实施方式。
图4a和4b为在没有dpbs的情况下(图4a)和存在dpbs的情况下(图4b)，延续细胞培养的材料的实施方式的图像。
图5为在另一个实施方式中，多层细胞培养容器的部分剖开示意图。
图6为在图5中示出的在平面b-b处截取的细胞培养容器的横截面，其示出了在多层细胞培养容器的内表面上的材料的五(5)个实施方式。
图7为在一个实施方式中，使用所述材料的方法的示意图。
图8a-8d为在多层培养瓶环境中使用所述材料的四个实施方式的方法的实施方式的示意图。
图9为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基的存在下的葡萄糖消耗相对于铵生成的图表。
图10为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基中生长96个小时后获得的chok1细胞的图表。
图11为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基中生长96个小时后的每日每个细胞的铵生成的图表。
图12为示出了从所述材料的含葡萄糖和谷氨酰胺的实施方式中以mg/cm2为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
图13为示出了从所述材料的含葡萄糖和谷氨酰胺的实施方式中以mg/cm2为单位随着时间释放谷氨酰胺的图表。。
图14为示出了从所述材料的含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
图15为示出了从所述材料的含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
图16为示出了从所述材料的另一个含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
图17为示出了从所述材料的另一个含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
图18为示出了从所述材料的另一个含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。
详述
在实施方式中，本公开提供了一种延续细胞培养基的材料，所述材料能够随着时间将营养物质缓释到细胞培养环境中。在另外的实施方式中，将所述材料暴露于细胞培养基。在实施方式中，该材料为细胞培养容器的一部分。在实施方式中，所述材料为在细胞培养材料表面上的涂层或膜。在另外的实施方式中，所述材料为在其上培养细胞的表面，例如细胞培养容器或微载体。
在实施方式中，所公开的延续细胞培养基的材料，以及所公开的制造和使用该延续细胞培养基的材料的方法提供了一个或多个优势特征或方面，包括例如下文讨论的特征和方面。在任何权利要求中列出的特征或方面通常可应用于本发明的所有方面。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
定义
“营养物质”指具有化学或生物学来源的任何化合物或组分，其可用于所公开的材料，该营养物质与细胞培养基接触，以维持或促进细胞的生长或增殖，或生物活性物质的细胞产量。“组分”、“营养物质”、“活力维持物”或“成分”可以互换使用并且均指此类化合物。可用于细胞培养基的营养物质可包括，例如，氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等物质，或其组合。可促进或维持细胞的体外培养(例如，在细胞培养中)的其他成分可由本领域技术人员根据具体需要做出选择。
“材料”意为在实施方式中，本文公开的延续细胞培养基的材料。
“被隔离的”意为营养物质以固体或结晶形式在聚合物基质中被捕获或在聚合物基质中混合。俘获于聚合物层之下或俘获于聚合物各层之间的营养物质也是“被隔离的”。
“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排它。
用来描述本公开实施方式的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、过程温度、过程时间、产量、流速、压力、粘度等数值及它们的范围或者组件尺寸等数值及它们的范围的“约”是指数量的变化，可发生在例如：用于制备材料、组合物、复合物、浓缩物、组件零件、制品或应用制剂的典型测定和处理步骤中；这些步骤中的无意误差；用来实施所述方法的原料或成分的制造、来源、或纯度方面的差异中；以及类似的考虑因素中。术语“约”还包括由于组合物或制剂的老化而与特定的初始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合物不同的量。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情形可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件或情形发生的情况和事件或情形不发生的情况。
所述材料，和制备和使用本公开的材料的方法可包括权利要求书中所列的组分或步骤；加上实质上不影响所述材料的基本性质和新性质的其他组分或步骤，或实质上不影响制备和使用所述材料的方法的其他组分或步骤，例如，具体装置或容器构造、具体添加剂或成分、具体试剂、具体结构的材料或组分、具体孵育或培养条件，及类似的结构、材料或选定的过程变量。
除非另有说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该/所述”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。
可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hrs”；表示克的“g”或“gm”；表示毫升的“ml”；表示室温的“rt”；表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
在组合物、成分、添加剂、尺寸、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开的组合物和方法可包括本文所描述的任何数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括显义或隐义的中间值和中间范围。
成功的细胞培养需要考虑营养物质消耗和代谢废物积累。培养中的细胞通常在水性培养基环境中生长。细胞可在静置培养中、灌注培养中、或者混合或振荡培养中生长。静置培养条件为没有营养培养基恒定流入或流过细胞培养容器的条件，在该静置培养条件中培养的细胞长时间地位于细胞培养基中。由细胞培养基提供的营养物质随着时间被所培养的细胞用光，并且累积了副产物或废产物。这些废产物可能是有毒性的。
细胞培养基含有重要的氨基酸、糖、盐、生长因子及对维持培养中的细胞的健康到关重要的其他成分。在细胞培养基中的一个重要的氨基酸成分为谷氨酰胺。谷氨酰胺在细胞培养基中随着时间自发分解。细胞培养介质通常用过量的谷氨酰胺配制以弥补其的分解。然而，l-谷氨酰胺的自发分解生成了铵。由于细胞的代谢，也生成了铵。细胞培养基中过多的铵可能对培养的细胞有毒性。已显示流加式系统因为使用持续低浓度谷氨酰胺以降低了铵形成的速率而受益。这经过频繁或连续地供料得以实现，这样增加了所需培养基的体积并且稀释了形成的培养产物。
细胞培养基可以是，例如，基于水性的，并且可在(例如，去离子的蒸馏水的)溶液中包含多种成分，以形成“基础培养基”。任何基础介质均可用于本公开的方法。所述基础培养基可包括，例如，一种或多种如下成分：氨基酸、维生素、有机盐、无机盐、微量元素、缓冲盐和糖。优选地，所述基础培养基可包括，例如，一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种无机盐、硫酸腺嘌呤、atp、一种或多种微量元素、脱氧核糖、乙醇胺、d-葡萄糖、谷胱甘肽、n-[2-羟基乙基]-哌嗪-n′-[2-乙磺酸](hepes)，或一种或多种其它两性离子缓冲剂、次黄嘌呤、亚油酸、类脂酸、胰岛素、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、胸苷、尿嘧啶，和黄嘌呤。这些成分是市售可得的。
可包含在本公开的培养基中的氨基酸成分可包括，例如，l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸；l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸，和l-缬氨酸。
可包含在本公开的培养基中的维生素成分可包括，例如，抗坏血酸镁盐、生物素、氯化胆碱；d-ca++泛酸盐、叶酸、i-肌醇、甲萘醌、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸(paba)、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素-hcl、维生素a乙酸盐、维生素b12和维生素d2。
可用于本公开的培养基的无机盐成分可包括，例如，cacl2、kcl、mgcl2、mgso4、nacl、nahco3、na2hpo4、nah2po4h2o，和柠檬酸铁螯合物或硫酸亚铁螯合物。
可用于本公开的培养基的微量元素可包括，例如，钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌和铝的离子。这些离子可以，例如，微量元素盐的形式提供。
可任选地包含在所述培养基中的其它成分为，例如，生长因子、胰岛素(尤其是胰岛素-zn++的形式)和转铁蛋白。这些其它成分可以常规生物学或生理学浓度配制到所述培养基中。铁盐或螯合物(例如，柠檬酸铁螯合物或硫酸亚铁)可作为转铁蛋白的取代物用于所述培养基中。重组胰岛素或基于锌的盐(例如，zncl等)可代替动物源性或人源性的胰岛素。
已经采用了许多策略使得在维持培养的细胞的健康的同时，使细胞培养的持续时间最大化。例如，已经使用了频繁的培养基更换；将释放营养物质的材料引入到培养基中；灌注培养和流加式培养过程。
为了使培养基中的细胞培养的营养物质最大化，并且使废产物累积最小化，可以更换培养基。移除旧的培养基(其可能耗尽了营养物质并且含有废产物)并向培养中的细胞递送新鲜培养基。然而，当更换培养基时，存在破坏细胞培养的风险。例如，当开启细胞培养容器以移除旧的培养基并递送新的培养基时，可能发生污染。培养基更换还需要细胞培养专业人员的时间和注意力。即，培养基更换具有污染的风险及人力成本。
已经努力延长培养基更换之间的时间，以减少人力成本并降低培养基更换期间的污染风险。例如，因为细胞会耗尽营养物质，所以细胞培养基可以含有过多的必要营养物质，以确保足够的营养物质在细胞培养中存在更长的一段时间。这导致培养基过于富含某些营养物质，例如谷氨酰胺或葡萄糖。谷氨酰胺(在本文中也可互换地称为“l-谷氨酰胺”)在水性环境中水解导致生成铵。谷氨酰胺还被细胞分解生成铵。然而，由谷氨酰胺的细胞代谢所生成的铵比谷氨酰胺在水性环境中水解所生成的铵，对培养基中的铵的积累的作用可能更小。葡萄糖被细胞分解生成乳酸。在充氧良好的细胞培养系统中，乳酸的产生是过多葡萄糖的结果。铵和乳酸可累积并可对细胞有毒性。因此，通过向培养基提供过量的这些化合物，从而努力提供充足的营养物质使得细胞培养维持更长的一段时间；矛盾的是这可能使细胞发现其自身处于比所必要的环境更不健康的环境中，因为毒性副产物随着时间在培养基中累积。
已经开发了一些技术以通过提供缓释的葡萄糖将营养物质(例如葡萄糖)缓释到细胞培养基中。例如，第3,926,723号美国专利公开了一种培养细胞的方法，该方法包括提供一种培养基，该培养基包括可酶促释放的葡萄糖基部分(淀粉)和一种酶(例如麦芽糖酶和淀粉酶)，该酶通过从淀粉聚合物中酶促释放葡萄糖，能够将葡萄糖基部分释放到细胞培养基中。在酶的存在下，淀粉分解形成葡萄糖。
已公布的第2011/0244573号美国专利申请公开了小球或小丸，其可与酶一起被加入到细胞培养物中，以从小球的结构中释放营养物质用于细胞培养物的流加式培养。公开了具有乳糖芯的淀粉片用于大肠杆菌(e.coli)培养。乳糖的作用为降解淀粉片以向细胞培养提供葡萄糖。
细胞还可在灌注培养条件下生长。然而，灌注细胞培养系统要求重要的仪器(包括泵、导管和连接器)以确保向培养的细胞连贯地递送新鲜的培养基，并同时保持无菌及避免细胞的不必要的破坏。例如，标题为“pre-programmednon-feedbackcontrolledcontinuousfeedingofcellcultures(细胞培养物的预编程非反馈控制的连续供料)”的国际专利公布wo2013/04044公开了用于向细胞培养物提供连续供料流的设备。
其他策略包括流加式或分批式(batch-fed)过程向细胞培养物提供供料浓缩物。然而，流加式供料或批式供料(bolusfeeding)导致细胞培养物中营养物质的浓度随时间发生变化，并且可能是人工密集型的。
在静置培养中，有时候使用产品如glutagrotm(购自纽约州康宁市的康宁有限公司(corning,incorporated,corning,ny))、或者glutamaxtm(购自加州卡尔斯巴德的生命科技公司(lifetechnologies,carlesbad,ca))。这些产品为细胞培养基的添加物质，其含有谷氨酰胺二肽(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽)，该谷氨酰胺二肽缓慢分解释放谷氨酰胺。这导致在细胞培养中，在培养基中显著更低的铵累积，但是仍然释放丙氨酸，丙氨酸造成一些细胞类型表现不佳。哺乳动物细胞培养技术广泛用于生物医药研究和制药工业。哺乳动物细胞中的重组蛋白生成通常采用易于放大规模进行的悬浮适应型细胞来实施。实验室规模的现代细胞培养主要基于振荡培养，其通常以批式培养方式进行，即，在培养起始时添加营养物质。相比于工业流加式工艺，该振荡培养的特点是低体积细胞和低产物产量。振荡培养瓶仅提供有限的信息用于生物工艺开发；在流加式模式中常常要再优化培养参数，这显著延长了时间，并增加了人力成本。与可变的振荡培养不同，在良好受控的生物反应器规模培养中，大多采用流加式技术，因为它提供了对于营养物质和代谢物浓度、氧水平、生物量密度，和培养基ph而言，更好的工艺控制。批式培养中缺乏工艺控制能力是以批量模式进行的工艺和培养基优化结果无法直接转化成流加式操作模式的大规模生产的主要原因。为了克服这些问题，使用微型生物反应器或自动化技术(参见例如，legmann,r.等人，apredictivehigh-throughputscale-downmodelofmonoclonalantibodyproductioninchocells(cho细胞中单克隆抗体生产的预测性高通量缩小规模模型),biotechnolbioeng.,2009；104；1107-1120；thomas,d.等人,anovelautomatedapproachtoenablinghigh-thoughputcelllinedevelopment,selection,andothercellculturetasksperformedinerlenmeyer(shake)flasks(在爱伦美氏(振荡)培养瓶中实现高通量细胞系开发、选择和进行的其它细胞培养任务的新型自动化方法),j.assoc.labautom.,2008；13:145-151；gryseels,t.,consideringcellcultureautomationinupstreambioprocessdevelopment(在上游生物工艺开发中探讨的细胞培养自动化),bioproc.intl.,2008；6:12-16)以使高通量的流加式操作具有自动供料和自动ph控制。因为这些技术昂贵，振荡培养瓶被持续广泛地用作哺乳动物细胞工艺开发中的工业和学术界中主要的规模缩小平台(参见buhs,j.，introductiontoadvantagesandproblemsofshakencultures(振荡培养的益处及问题介绍)，biochem.eng.j.，2001；7:91-98)。
主要的挑战不仅是流加式原理适应的是小规模——其大多数通过间歇供料来完成，更重要的是同时达到了高细胞密度。在批式工艺中，细胞密度通过生长限制性营养物质源的浓度、培养基ph，和毒性代谢物浓度来确定。这产生了如下困境：高细胞密度仅在有足够葡萄糖可供作为碳源利用时获得。同时，葡萄糖的大剂量添加(bolusaddition)可能会造成营养物质浓度的大幅瞬时增加，其可导致高摩尔渗透压浓度和高废物代谢物浓度，例如，高葡萄糖浓度可导致乳酸盐或酯的产量增加和ph下降(参见zhou，w.c.等人，highviablecellconcentrationfedbatchculturesofhybridomacellsthroughonlinenutrientfeeding(通过在线营养物质馈料的杂交瘤细胞的活细胞高浓度流加式培养)，biotechnolbioeng.，1995；46:579-587；chee,f.w.d.等人,impactofdynamiconlinefed-batchstrategiesonmetabolism,productivityann-glycosylationqualityinchocellcultures(动态在线流加式策略对cho细胞培养物中的代谢、生产力、n-糖基化质量的影响),biotechnol.bioeng.,2005；89:164-177)。此外，可通过将培养基中的葡萄糖浓度控制在低水平来控制重组抗体的糖化(参见yuk，i.h.等人，controllingglycationofrecombinantantibodyinfed-batchcellcultures(流加式细胞培养中重组抗体的控制糖化)，biotechnol.bioeng.,2011；108；2600-2610)。细胞利用葡萄糖的主要通路是糖酵解。肿瘤源性的细胞系一般丧失了基于能量需求控制糖酵解通量的能力(参见eigenbrodt，e.等人，newperspectivesoncarbohydratemetabolismintumorcells(肿瘤细胞中碳水化合物代谢的新观点)，r.brietner(编)，regulationofcarbohydratemetabolism(碳水化合物代谢的调节)，第2卷，佛罗里达州波卡拉顿的crc出版社)。因此，糖酵解受胞外生长培养基中的葡萄糖浓度控制。在批式细胞培养中，葡萄糖存在的浓度(高达50mm)通常显著高于血流中所见浓度(5mm或更少)。已显示cho(中国仓鼠卵巢)细胞活力的减少是由高水平的毒性代谢物丙酮醛所致，其作为高葡萄糖浓度下糖酵解的副产物生成(参见chaplen，f.w.r.等人，evidenceofhighlevelsofmethylglyoxalinculturedchinesehamsterovarycells(培养的中国仓鼠卵巢细胞中高水平丙酮醛的证据)，proc.natl.acad.sci.usa，1998；95:5533-5538；roy，b.m.等人，toxicconcentrationsofmethylglyoxalinhybridomacellsculture(杂交瘤细胞培养中的毒性浓度的丙酮醛)，cytotechnology，2005；46:97-107)。
为了解决或减轻由细胞培养基中高葡萄糖浓度造成的这些问题，越来越需要用于高密度培养的连续底物递送源。微生物培养的一个实例是enbasetm，一种酶控葡萄糖递送系统，其经开发且目前可市购用于培养微生物(参见panula-perala，j.等人，enzymecontrolledglucoseauto-deliveryforhighcelldensitycultivationsinmicroplatesandshakeflasks(用于微板和摇瓶中的高细胞密度培养的酶控葡萄糖自动给予)，microbialcellfactories，2008；7:31)。enbasetm采用葡糖糖化酶/淀粉作为碳源，用于产生葡萄糖。葡糖糖化酶在细胞培养基中的应用为哺乳动物细胞带来了限制。或者，包埋进入聚二甲硅氧烷树脂的葡萄糖已被用作缓释技术，用于在振荡培养瓶中培养多形汉逊酵母(h.polymorpha)(参见jeude，m.等人，fed-batchmodeinshakeflasksbyslow-releasetechnique(通过缓释技术的震荡培养瓶中的流加式模式)，biotechnologyandbioengineerin，2006；95；在kuhner.com作为供料珠市售可得)。根据文献，已知pdms对于细胞培养基中的蛋白质具有高非特异性结合能力，由此是哺乳动物细胞培养应用中不希望的。然而，已开发了基于水凝胶的葡萄糖递送系统的应用用于哺乳动物细胞培养(参见hedge，s.等人，controlledreleaseofnutrientstomammaliancellcultureinshakeflasks(对于振荡培养瓶中哺乳动物细胞培养物的营养物质控释)，biotechnol.prog.,2012；28:1)。该系统基于具有包封的葡萄糖粉末的hema:egdma水凝胶盘。因为未反应的残留单体，所述系统需要对水凝胶进行大量清洗以减轻细胞毒性。
2013年10月22日授予sexton等人的标题为“sustainedreleaseofnutrientsinvivo(营养物质在体内的持续释放)”的us8,563,066提及，以时间控制方式在长时程内可持续的体内递送的营养组合物提供了增强的运动性能、增加的手/眼协作，以及手头任务的密度。所述组合物可包括水性悬浮液，其包含(a)一种或多种营养补充物；和(b)一种或多种水凝胶微颗粒，其包封(a)的一种或多种营养补充物，其中，所述一种或多种水凝胶微颗粒(i)具有1至1000微米的直径；(ii)包含一种或多种化合物，所述化合物无毒、交联，且其以时间受控和持续的方式在体内释放包封的一种或多种营养补充物；(iii)是ph敏感性的，其中，所述水凝胶微颗粒的一种或多种化合物在ph1-3不溶胀；和(iv)是温度敏感性的，其中，所述水凝胶微颗粒的一种或多种化合物在水性溶液中具有较低的临界共溶温度。(b)(ii)中的用于营养补充物的受控和持续释放的一种或多种化合物可以是可生物降解的聚合物、生物粘附物、粘合剂，或其组合。所述可生物降解的聚合物和粘合剂可以是如下物质中的一种或多种：聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚已酸内酯、聚碳酸酯、聚酰胺酯、聚酐、聚(氨基酸)、聚原酸酯、聚乙酰(polyacetyl)、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二噁烷酮)、聚(烯烃烷基化物)、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、可生物降解的聚氨酯、多糖和多糖与聚醚的共聚物。sexton还提到，微球体可包含营养化合物的混合物，并且所述微球体由可生物降解的材料组成，该可生物降解的材料在某一时间段内释放。例如，为了提供初始突释的营养物质，以向个体提供能量或营养物质的即刻储蓄，营养化合物如此配制，并且可包含不同比例的多种碳水化合物、氨基酸、电解质、维生素等。第二组可包含不同比例的碳水化合物:氨基酸:维生素等，或严格意义上不同或类似的碳水化合物，其在较长的时间段内释放，以保持营养物质的可持续的释放。微球体中营养物质的配制和释放的时间可根据活性形式、个体、年龄、体重和营养需求而不同。例如，马拉松赛跑运动员(长时间持续的营养需求)与短跑运动员(激增营养需求)将具有不同的营养需求。
一般而言，生物降解产物通常在体外或离体细胞培养中均是不希望的。在实施方式中，选择用于本公开的材料聚合物在原位(即，在细胞培养中和过程中)不易被生物降解。
标题为“cellculturehydrogelwithphindicator(具有ph指示剂的细胞培养水凝胶)”的美国专利公布20090190135提到用于在细胞培养中维持条件和用于检测细胞培养物中的条件的装置、组合物和方法。具体而言，该发明提供了用于数种非侵入性技术以及细胞培养物中ph水平的非侵入性检测的水凝胶材料、设备和方法，所述非侵入性技术将细胞培养物中的葡萄糖和ph水平保持在接近最优化水平。
本公开提供了一种材料的实施方式，所述材料以稳定且受控的方式释放谷氨酰胺和其它营养物质，包括葡萄糖，这可供更长时间段的更稳健的细胞培养条件之用。另外，这一改进的材料创造的条件使得细胞培养中的培养基含有显著更少的葡萄糖和谷氨酰胺，同时仍然供养优良的细胞生长和降低的铵和乳酸盐(或酯)生成。这便于进行更长时间的细胞培养而不需要更换培养基(也被称为“再供料”)，同时降低了污染的风险及频繁更换培养基带来的增加的人力成本。延续培养基供养细胞的能力还可以使容器中的细胞密度能够更高，这同样会使得细胞培养更加有效。
图1a和1b为在一个实施方式中的细胞培养容器100的示意图。所述容器(在此处以培养瓶示出，但是所述细胞培养容器可以为适于进行细胞培养的任何形状，包括皮氏培养皿、培养瓶、多孔板、包、生物反应器、多层容器、多层培养瓶(如在一个实施方式中，在图5和图6中所示出的)、底板(bed)、微载体(如在图2中所示出的)或适于细胞培养的任何器皿、容器、培养瓶、或表面。所述细胞培养容器或表面可以适于供养贴壁细胞或非贴壁细胞、动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、真核细胞、原核细胞、组织培养、器官培养、植株培养、原代细胞、细胞系、基因工程细胞或组织、任何其他细胞培养目的。
在图1a和1b示出的实施方式中，容器100具有底109、顶110、侧壁112、变细的开口131，在图1a中示出的容器100具有一个与变细的开口相连的盖130。在图1a中示出的容器的内部为细胞培养室111。图1b为在图1a中示出的细胞培养容器的横截面，其从图1a中示出的平面a-a处截取。如图1b所示，容器100具有内表面。顶壁110具有内表面115，其也被称为顶板(ceiling)115。底壁109具有内表面113，其也被称为底板(bed)113。每个侧壁112具有内表面132。
图2为微载体实施方式。图2以横截面示出了微载体200。所述微载体具有微载体体身149，其具有微载体表面150。材料151在微载体表面150上的一层中示出
图3a-3e为在图1b中示出的平面a-a处截取的细胞培养容器的横截面示意图，其示出了在细胞培养容器的内表面上的材料的实施方式。在图3a-3e的每幅图中，示出了图1a和图1b示出的实施方式中的细胞培养容器100的横截面。所述细胞培养容器100具有顶壁110，其具有顶内表面115或顶板115；侧壁112，其具有内部侧壁表面132；底壁109，其具有底内表面113或底板113；以及细胞培养室111。在图3a中，材料151示出于底壁109的内表面113或底板113上。在图3b中，材料151示出于顶壁110的内表面115或顶板115上。在图3c中，材料151示出于侧壁112的内表面132上。在图3d中，材料151示出于相对的侧壁112的内表面132上。在图3e中，材料151示出于顶壁110、底壁109和侧壁112各自的内表面115、113和112上。虽然图3e在顶壁110、底壁109和侧壁112各自的细胞培养室115、113和112的每个内表面上均示出了材料，但是材料可以存在于顶壁110、底壁109和侧壁112各自的内表面115、113和112中的一个、多于一个但小于全部、或者全部的表面上。
在实施方式中，材料151可以完全地覆盖表面，或者可以部分地覆盖表面。在实施方式中，材料151为一涂层，其被施涂到顶壁110、底壁109和侧壁112各自的内表面115、113和112中的一个或多个内表面上。可以用湿法化学，通过例如浇铸和固化方法施涂涂层。即，可以将材料的溶液引入到容器100中并使其涂布容器的一个或多个内部表面。还可以采取其他步骤，例如固化步骤或干燥步骤，以使得涂层粘到容器的一个或多个内部表面上。在实施方式中，材料151为一膜，其被施涂到顶壁110、底壁109和侧壁112各自的内表面115、113和112中的一个或多个内表面上。可以通过本领域已知的方法将膜施涂到容器的一个或多个内部表面，所述方法包括在组装容器之前先将膜施涂到一个或多个内部表面。在实施方式中，材料与顶壁110、底壁109和侧壁112中的一个或多个是一体的。例如，可以将材料挤出形成顶壁110、底壁109和侧壁112中的一个或多个。
图4a和4b为在没有细胞培养基的情况下(图4a)和存在细胞培养基的情况下(图4b)，延续细胞培养基的材料151的实施方式的图像。在图4a中示出的是延续细胞培养的材料的实施方式的照片，所述延续细胞培养的材料为被溶剂浇铸到一表面上的，具有20％葡萄糖的聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)“eva”材料(40％乙烯基乙酸酯)。在干燥条件下，葡萄糖晶体300在聚合物301的致密层下方是可见的。如在图4a中所示，葡萄糖晶体被隔离在聚合物中。在实施方式中，所述聚合物，连同其俘获或隔离的营养物质(在图4a和4b的情形中为葡萄糖)一起为延续细胞培养的材料151。如图4b所示，在与培养基渗透性相似的水性dpbs溶液中孵育材料96小时后，该材料发生了变化。不限于理论，现假定俘获于聚合物中的葡萄糖已经吸收了水，从而在聚合物301中形成了增压的囊315，这导致营养物质从聚合物中泵出进入到周围溶液中。这可被称为渗透泵，其中，营养物质通过囊与培养基之间的浓度梯度，从聚合物囊中被驱出进入到培养基中。
在本发明的实施方式中，提供了一种多层培养瓶。本发明的多层培养瓶100的一个实施方式示出于图5，其以部分剖开的透视图示出。该多层培养瓶100具有一个外部容器体身101，其通过顶壁110、底部板(未示出)、侧壁112和端壁114限定。如在图6中可以更清楚地看到，设置在培养瓶100内的为单独的细胞生长室111。单独的细胞生长室111各自通过底表面或底板113和顶表面或顶板115限定。表面113和115沿着侧壁112和端壁114连接至培养瓶体身101。在实施方式中，在每个室111内部的至少一个底表面113是能够为细胞117的生长提供表面的气体可渗透、液体不可渗透的材料。所述气体可渗透、液体不可渗透的材料可以提供细胞在其上附着的表面，或细胞生长室的底板，或者其可以为相对的表面，或细胞生长室的顶板。底表面113，或细胞培养表面113可以是挠性的或刚性的。在实施方式中，每个顶表面115是刚性的、气体大致可渗透的材料，该材料将为细胞生长室111和多层细胞培养容器提供支撑。所述多层培养瓶的表面可以是清晰的、不透明的、有色的或者是无色的。在本发明的一个实施方式中，在每个细胞生长室111之间存在气管空间118。所述室111的相对的顶表面115限定了细胞生长室111的上壁或顶板以及气管室118的底部部分。因此，气管室118包含第一细胞生长室的气体可渗透的、液体不可渗透的表面113和第二生长室111的相对的表面115。还可以存在支撑物119以提供结构支撑，从而在一体化的培养瓶101内部形成与气管空气空间118交替的生长室111时，整体并入表面113和115。因此，每个细胞生长室111以垂直连续取向与气管室118交替。
在本发明的一个实施方式中，单独的细胞生长室111允许在气体可渗透的膜113上进行细胞生长，以使得多个细胞生长室111与多层培养瓶100的体身101成为一体，并且能够用用于细胞生长的营养物质培养基完全填充。在实施方式中，这些细胞生长室为约2mm高。通过多层培养瓶100的一系列气管空气空间118在生长于气体可渗透的表面113上的细胞117与外部环境之间提供了气体交流，所述可渗透的表面113位于多层培养瓶内部的单独的细胞生长室111中的培养基127中。气管空间118允许通过气体可渗透的表面113对位于细胞生长室111内部的培养基进行充氧。此外，气管室118可以为任何空气隙或空气空间的形式，并且不允许液体进入。因此，刚性细胞培养多层培养瓶100具有与气管空间118交替的多个生长室111，协同构造该刚性细胞培养多层培养瓶100以向大量的细胞117提供等效气体分布的益处。在实施方式中，多层培养瓶可以具有端口(port)120，该端口120可以具有插塞或端口盖121。此外，多层培养瓶可以为任意形状。例如，多层培养瓶可以具有壁角107。
图6为在图5中示出的平面b-b处截取的细胞培养容器100的横截面，其示出了在图5中示出的多层细胞培养容器实施方式的内表面上的材料的实施方式1-5。在细胞培养室1(111)中，顶壁110具有内表面或顶板115，以及在底表面或底板113上的一层延续细胞培养基的材料151。在实施方式中，底板113由液体不可渗透的、气体可渗透的膜制成。气管空间118位于底板113下部，其通过支撑物119支撑。在多层细胞培养室的实施方式(1)中，延续细胞培养基的材料在底部表面或底板113上。
在细胞培养室2中，延续细胞培养基的材料在顶壁的内表面或顶板115上(在多层的这一第二层中，该顶壁的内表面或顶板115也为提供了支撑物119以支撑气体可渗透、液体不可渗透的膜并形成气管空间118的层)。在细胞培养室3和4中，材料151在侧壁上。在细胞培养室5中，延续细胞培养基的材料在细胞培养室111的所有内表面上。普通技术人员应理解，可以在图1、2、3、5、6、7、8中示出的构造或其他任何构造中的细胞培养容器中的任何表面上提供延续细胞培养基的材料。
图7为在一个单层细胞培养容器的实施方式中，使用所述材料的方法的示意图。在图7中，延续细胞培养基的材料151在细胞培养容器的底壁或底板113上。细胞159位于底板113顶部，其被培养基160覆盖。如图7中的箭头所示，虽然营养物质161由培养基提供，但是其也从延续细胞培养基的材料151中释放出来。另外，如图7中的箭头所示，来自培养基160的水进入到了材料151中。水可以从培养基移动进入聚合物膜。虽然不受关于营养物质释放到培养基中的作用机制的理论限制，但是可能的是水使固体营养物质颗粒水化，从而在聚合物内的囊中形成了饱和溶液，如图4b所示。该溶液体积在膜内形成了压力，该压力驱使溶剂化的营养物质(其可以为例如谷氨酰胺或葡萄糖)以稳定的速率通过聚合物并从聚合物中出来以进入到培养基中(参见图14-18)。该稳定的速率维持了谷氨酰胺的低的有用的浓度以供养培养中的细胞，同时保持低的铵生成速率。
图8a-8d为在多层培养瓶环境中使用所述材料的四个实施方式的方法的实施方式的示意图。在图8a中，材料151在多层细胞培养容器中的细胞培养室的顶板115上。细胞159位于底板113顶部，所述底板113可以为液体不可渗透的、气体可渗透的膜，细胞159被培养基160覆盖。如箭头所示，虽然营养物质161由培养基提供，但是其也从材料151中释放出来。另外，来自培养基160的水进入到了材料151中，(在图8中未示出，但是见于图7，以及同样地见于图4a和4b)。在图8b中，材料151在多层细胞培养容器的细胞培养室的底壁或底板113上。细胞159位于底板113顶部，其被培养基160覆盖。如箭头所示，虽然营养物质161由培养基提供，但是其也从材料151中释放出来。在图8b中，材料151在多层细胞培养容器的细胞培养室的侧壁112的内表面132上。细胞159位于底板113顶部，其被培养基160覆盖。如箭头所示，虽然营养物质161由培养基提供，但是其也从材料151中释放出来。在图8d中，材料151在多层细胞培养容器的细胞培养室的所有内表面上。细胞159位于底板113上的材料151的顶部，其被培养基160覆盖。如箭头所示，虽然营养物质161由培养基提供，但是其也从材料151中释放出来。
在一些细胞培养容器中，以在容器中提供一层空气的方式向细胞培养室提供培养基。以这种方式，随着氧气在培养基-空气界面处扩散到培养基中，将氧气水平维持在健康水平。在多层细胞培养装置(例如在图5和6中示出的多层细胞培养装置)中，培养基完全填充了细胞培养室。在这些实施方式中，通过扩散过形成细胞培养室113底板的气体可渗透的液体不可渗透的膜，向培养中的细胞提供氧气。底板113在膜的细胞培养室侧与培养基接触；在膜的气管空间118侧与空气接触。
在实施方式中，在多层细胞培养容器中的细胞培养室的顶板表面115上提供了材料151。以这种方式，氧气可通过细胞培养室底板113的气体可渗透的液体不可渗透的膜扩散进入细胞培养室中，而营养物质可经由存在于细胞培养室顶板上的材料151进入到培养基中。
用于营养物质释放的细胞培养材料的实例包括含有被隔离的营养物质颗粒的聚合物。合适的聚合物材料允许水缓慢渗透聚合物材料，同时释放在聚合物基质中被捕获的营养物质颗粒。然后，水能够开始溶解营养物质颗粒，使待释放的营养物质游离通过聚合物并到培养基外。这一从聚合物材料中释放营养物质可起到响应渗透泵的作用，以使得谷氨酰胺在几天内稳定释放。
对本发明有用的聚合物需要能够含有营养物质。这可通过在将聚合物材料形成与细胞培养基接触的表面之前，先将营养物质与聚合物材料混合。如图4a和4b中所示，营养物质可以为晶体形式，并且可被聚合物层捕获或在聚合物层中被结合。或者，这可通过在营养物质层与细胞培养基之间提供一聚合物层，以允许营养物质随着时间通过聚合物层被释放来实现。或者，可将营养物质俘获在聚合物各层之间。俘获于聚合物层之下或俘获于聚合物各层之间的营养物质也是“被隔离的”。另外，聚合物需能够以受控的速率释放营养物质。即，如果聚合物过于多孔，则营养物质将过于迅速地被释放——大约几个小时。为了延长细胞培养的生命，营养物质需要经过几天或者甚至是几周被释放。如果聚合物对水是非渗透性的，则不会释放营养物质以有利于细胞培养。在实施方式中，聚合物具有以合适的速率释放营养物质的特性。描述该特性的一种方式是在聚合物的吸湿特性中。吸湿性聚合物有能力从周围环境中吸引并保持水分子(吸收水分子)。吸湿性聚合物的实例包括聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)、聚(乙基纤维素)、pdms、聚(醚/酰胺)共聚物如pebax2533等。吸湿性聚合物可区别于水凝胶。水凝胶的定义为“一种表现出在其结构中膨胀和保留大部分水的能力，但是不溶于水的聚合材料”(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s2090123213000969)。水凝胶被iupac定义为“一种凝胶，在该凝胶中膨胀剂为水”(注意：1.水凝胶的网络组分通常为聚合物网络。2.网络组分为胶态网络的水凝胶可以被称为水性凝胶(aquagel)。一般来说，水凝胶在水中膨胀，并且在水中，其含有高百分比的水。出于本公开的目的，水凝胶为在水性环境中膨胀至大于50重量％水的聚合物材料。在实施方式中，本文公开的吸湿性材料为在水性环境中膨胀至小于50重量％水的聚合物。所述聚合物的吸水特性和释放水的特性决定了聚合物随着时间能够释放溶于水的营养物质的速率。营养物质从聚合物材料中扩散出来或者扩散通过聚合物材料。
在实施方式中，延续培养基的材料为施涂到细胞培养表面的涂层或膜，其能够随着时间释放细胞培养的营养物质。在实施方式中，本文公开的延续培养基的材料为在水性环境中膨胀至小于50重量％水的聚合物，所述聚合物与营养物质一起混合，或者捕获或隔离了营养物质，或者含有营养物质。在实施方式中，营养物质以结晶或固体形式在聚合物中被捕获或隔离。
在另外的实施方式中，本公开提供了在具有延续培养基的材料的细胞培养表面的存在下，培养细胞的方法，其中在聚合物基质中被捕获的营养物质，在水性培养基的存在下溶解，并且缓慢释放到培养基中。当所述营养物质溶于水性环境中时，在聚合物基质的囊中可以建立渗透泵，使得营养物质从聚合物囊的浓度更高的环境流到培养基中。在聚合物基质中，营养物质的这一隔离便于将营养物质缓慢引入到培养基中而不要求更换培养基。这一隔离还使得在较低浓度的营养物质的存在下可在静置培养或者动态培养条件下培养细胞，所述营养物质在较高的浓度下可能对细胞有直接或间接的毒性。
营养物质随着时间从聚合物中扩散出来的速率还受膜或多层膜、营养物质的性质、聚合物与培养基之间的扩散梯度、温度及其它因素的影响。
这些聚合物/营养物质材料可以任何形式被制造，包括浇铸、挤出、模制，或者作为涂层或薄膜提供以提供用于交换的高比表面积。此外，一旦挤出或制成了膜，则可对膜进行模制、二次模制(over-molded)、嵌入模制(insert-molded)或用别的方式将膜施涂至暴露于细胞培养的表面。可对所述材料自身进行模制或二次模制以形成暴露于细胞培养的表面。所述材料可形成细胞培养区室的表面的至少一部分。所述材料可形成一表面的部分，该表面也是细胞粘附或生长其上的表面(“细胞培养表面”)，或者所述材料可以形成不是细胞培养表面的表面的部分。或者，所述材料可形成微载体或用于培养细胞的其他表面的至少一部分。
在实施方式中，挤出所述材料以形成细胞培养容器。在另外的实施方式中，所述材料作为细胞培养容器的表面上的涂层形成。在另外的实施方式中，所述涂层可以为膜。所述涂层可以被浇铸到细胞培养容器的表面，或者所述涂层可以作为膜形成，该膜之后作为膜被施涂到细胞培养表面。可对膜进行模制、二次模制、嵌入模制或用别的方式将膜施涂至暴露于细胞培养的表面。所形成的膜可以通过本领域已知的任何其他方法进行浇铸、挤出、或者模制、或者形成。溶剂浇铸可用于生成膜和涂层。
在另外的实施方式中，以大于一层的形式将所述材料施涂到细胞培养表面。例如，可将含有营养物质的材料施涂到一表面以形成第一层，然后可将不含有营养物质的第二材料施涂到所述第一层的顶部以形成第二层。施涂不含有营养物质的第二层可应用于减缓一种或多种营养物质从所述第一层中的释放，因为在营养物质变为可进入培养基之前，其不得不从所述第一层中移动出来，并且还要通过所述第二层(参见，例如下表1中的膜19)。
实施例
以下实施例示出了用于增强长期细胞培养条件的示例性材料的制备。
实施例1：材料的形成：膜13由以下物质浇铸形成：10％的聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)(40％va)的二氯甲烷溶液与以聚合物重量计的20％葡萄糖粉末(经研磨的样品)和以聚合物重量计的20％谷氨酰胺混合。将该溶液刮(knife)到0.010”厚的聚苯乙烯膜上，刮至0.010”厚度，将其干燥至约0.002”厚度。然后用未添加营养物质的10％的相同聚合物(eva)溶液涂布该形成的膜。最终的膜厚度为0.013”，包含0.010”聚苯乙烯基膜。以相同的方式但是使用20％葡萄糖和30％谷氨酰胺制造膜15。对于膜19的层4——“保护层”，将聚合物溶于没有营养物质的溶剂中以形成保护层。膜19由另外的基底层制造。第一基底层具有在eva中的40％葡萄糖，接着的另一层具有30％葡萄糖，接着的一层具有20％葡萄糖和25％谷氨酰胺，接着为没有营养物质的eva保护层。
表1
实施例2——材料膜的形成：将图12-18(下文讨论)中描述的膜溶剂浇铸到细胞培养表面上。溶剂浇铸为将聚合物溶于合适的溶剂中的过程。在这一实施例中，合适的溶剂为溶解聚合物但不溶解营养物质的溶剂。然后将聚合物溶液刮到一膜上并使其干燥。这产生了复合膜材料，该复合膜材料具有含有营养物质的聚合物。固体(未溶解的)营养物质以块状的形式存在于膜中。即，因为营养物质不溶于浇铸材料，所以它们不均匀地分布于整个复合聚合物材料中(参见图4a和4b)。溶剂浇铸可用于生成膜和涂层。还可以使用热加工以提供材料151的膜。可将这些膜嵌入模具中并用朝向模具腔的膜的第一聚合物层二次模制，以在用能与第一聚合物层兼容的聚合物填充模具时形成接合处(weld)。膜的渗透泵侧随后会朝向细胞培养室。还可在第二操作中接合所述膜。
图9为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基的存在下的葡萄糖消耗相对于铵生成的图表。图9示出了在低谷氨酰胺培养基条件下，在图9的图表中示出的培养的96个小时内，铵生成有所减少。图9示出了在96个小时培养结束时，在常规谷氨酰胺条件中的铵生成为从在低谷氨酰胺条件下的培养物中测得的约两倍。另外，在低谷氨酰胺浓度条件中，葡萄糖浓度下降得更快。铵(nh4)水平的增加与健康细胞培养条件的下降有关联。图9示出了在低谷氨酰胺的存在下，细胞培养条件维持了更长时间的更为健康的条件。在低谷氨酰胺溶度的存在下，葡萄糖浓度下降得更快，这是因为相较于常规谷氨酰胺条件，细胞群有所增加(参见图10)。换言之，在低谷氨酰胺条件下，细胞群比在常规谷氨酰胺条件下生长得更快。这可能是由于铵累积减少的原因(如图11中所示)。
图10为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基中生长96个小时后获得的chok1细胞的图表。如在图10中所示，相较于在常规谷氨酰胺条件存在下的细胞，用低谷氨酰胺配制的培养瓶的细胞产量有所增加。结合图9中示出的图表，该数据表面细胞在低谷氨酰胺条件中生长得更快。这符合批式培养条件的报道，所述报道发现细胞在低谷氨酰胺/低氨培养条件中生长得更更快(low-glutaminefed-batchculturesof293-hekserum-freesuspensioncellsforadenovirusproduction(用于腺病毒生产的293-hek无血清悬浮细胞的低谷氨酰胺流加式培养物)lee,y.y.等人,biotechnol.prog.2003,19,501-509)。该组人员还测量到在低谷氨酰胺/低氨条件中生长的细胞中的病毒滴度更高。本公开示出了在流加式细胞培养条件中，以低浓度分批提供谷氨酰胺是有利的。
出于本公开的目的，“低谷氨酰胺浓度”意为浓度低于2mml-谷氨酰胺、低于1.5mml-谷氨酰胺或低于1.0mml-谷氨酰胺。细胞在培养中需要一些谷氨酰胺，但不是很多。即，低于2mml-谷氨酰胺、低于1.5mml-谷氨酰胺或低于1.0mml-谷氨酰胺的l-谷氨酰胺浓度足够用于供养细胞培养。然而，由于谷氨酰胺在培养中分解，因此，用于静置培养的培养基中提供的谷氨酰胺水平通常大于2mm。
图11为示出了相较于l-谷氨酰胺浓度为0.5mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的实验性的低谷氨酰胺培养基条件，在l-谷氨酰胺浓度为4mm(和葡萄糖浓度为1g/l)的常规培养基中生长96个小时后的每日每个细胞的铵生成的图表。相较于标准浓度l-谷氨酰胺对照(组2)，每日每个细胞生成的氨(累积的生成的铵除以ivcd——总活细胞密度)示出了80％的减少。
图12为示出了从所述材料的含葡萄糖和谷氨酰胺的实施方式中以mg/cm2为单位随着时间释放葡萄糖的图表。对既含有葡萄糖又含有谷氨酰胺的3种聚合物/营养物质膜制剂的实施例进行了葡萄糖释放的测试。在表1中限定了实施例13、15和19。图12绘制了葡萄糖的释放速率以支持细胞大量营养物质需求，并且示出了膜制剂中的相对变化可导致大范围的营养物质释放速率。
图13为示出了从所述材料的含葡萄糖和谷氨酰胺的实施方式中以mg/cm2为单位随着时间释放谷氨酰胺的图表。既含有葡萄糖又含有谷氨酰胺的3种聚合物/营养物质膜制剂的实施例(参见表1的材料组合物)。图13绘制了l-谷氨酰胺的释放速率以支持细胞大量营养物质需求，并且示出了膜制剂中的相对变化可导致大范围的营养物质释放速率。根据系统要求，可以调整制剂以符合需要。
图14为示出了从所述材料的含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。图14示出了从pebaxtm2533材料中释放的葡萄糖，所述pebaxtm2533材料含有10％葡萄糖，并且具有的另外的pebaxtm的顶部涂层，该顶部涂层不含葡萄糖，其厚度为约0.001”。pebaxtm为购自宾夕法尼亚州普鲁士王市的阿科玛(arkema,kingofprussia,pa)的聚酰胺/聚醚嵌段共聚物。将材料溶剂浇铸到细胞培养表面上，并且在与培养基的渗透性相似的水性dpbs溶液中孵育。以时间增量测量葡萄糖的浓度，单位为g/l。将测得的葡萄糖的浓度乘以3.5以在其进入2mm培养基顶部高度(headheight)时得到释放的葡萄糖的当量浓度，结果对于2mm培养基高度来说，随着时间进行平均葡萄糖释放的量度为0.5g/l。该培养基的顶部高度为图5中示出的多层细胞培养瓶
图15为示出了从所述材料的另一个含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。图15示出了从eva(乙基乙烯基乙酸酯，40重量％va)中释放的葡萄糖，所述eva含有10％葡萄糖，并且具有的另外的eva的顶部涂层，该顶部涂层不含葡萄糖，其厚度为约0.001”。将eva材料溶剂浇铸到细胞培养表面上，并且在与培养基的渗透性相似的水性dpbs溶液中孵育。以时间增量测量葡萄糖的浓度，单位为g/l。将测得的葡萄糖的浓度乘以3.5以在其进入2mm培养基顶部高度时得到释放的葡萄糖的当量浓度。含有葡萄糖的eva材料以1.5g/l的稳定速率经96小时释放葡萄糖。
图16和17为示出了从所述材料的含葡萄糖的乙基纤维素实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。图15示出了从含有30％葡萄糖的ec300级乙基纤维素(目录号为247499，购自英国多塞特郡的西格马(sigma,dorset,uk))材料中释放葡萄糖；图16示出了从含有50％葡萄糖的ec100级乙基纤维素(目录号为200654，购自英国多塞特郡的西格马(sigma,dorset,uk))材料中释放葡萄糖；两种材料各自均具有厚度为约0.001”的另外的无葡萄糖的聚合物顶部涂层。在两种情形中，将材料溶剂浇铸到细胞培养表面上，并且在与培养基的渗透性相似的水性dpbs溶液中孵育。以时间增量测量葡萄糖的浓度，单位为g/l。将测得的葡萄糖的浓度乘以3.5以在其进入2mm培养基顶部高度时得到释放的葡萄糖的当量浓度。两种含有葡萄糖的乙基纤维素材料均以稳定速率经120小时释放葡萄糖。从具有30％葡萄糖的ec300材料中计算的葡萄糖释放为0.7g/l，从具有50％葡萄糖的ec100材料中计算的葡萄糖释放为2.8g/l。
图18为另一个示出了从所述材料的另一个含葡萄糖的实施方式中以g/l为单位随着时间释放葡萄糖的图表。图18示出了从eva(乙基乙烯基乙酸酯，40重量％va)中释放的葡萄糖，所述eva含有30％葡萄糖，并且具有的另外的eva的顶部涂层，该顶部涂层不含葡萄糖，其厚度为约0.001”。将eva材料溶剂浇铸到细胞培养表面上，并且在与培养基的渗透性相似的水性dpbs溶液中孵育。以时间增量测量葡萄糖的浓度，单位为g/l。将测得的葡萄糖的浓度乘以3.5以在其进入2mm培养基顶部高度时得到释放的葡萄糖的当量浓度。含有葡萄糖的eva材料以4.9g/l的稳定速率经96小时释放葡萄糖。
已经参考各种具体实施方式和技术描述了本公开。但是，应当理解，可以在本公开的范围内做出许多变化和改进。
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