一种特异性结合上皮细胞黏附分子的靶分子多肽及其制备方法与流程

本发明涉及一种特异性结合上皮细胞黏附分子(epcam)的靶分子多肽及其制备方法。具体而言，本发明提供了具有较高的epcam的靶向结合的生物学活性的靶分子多肽。

背景技术：

巴雷特食管

胃食管反流(gastroesophagealrefluxdisease，gerd)所引发的食管黏膜伴有杯状细胞的肠上皮化生，即barrett食管(barrett’sesophagus,be)，研究表明食管腺癌几乎均来源于be，60％以上的胃食管结合部腺癌和贲门癌来源于be。be产生的主要原因是长期慢性的胃食管反流(gastroesophagealrefluxdisease，gerd)。食管上皮在胆汁酸的长期侵蚀下沿肠上皮化生(be)-低度异型增生(lowgradedysplasia,lgd)-高度异型增生(highgradedysplasia,hgd)-腺癌的趋势发生恶变。目前，对于be患者推荐进行定期内窥镜监测，hgd与早期ea要求行手术切除。然而，hgd与早期ea结构扁平，没有明显的结构异常和结节，在内窥镜下很难辨别。通常采用的四象限随机取样活检或是在可疑区域的定向活检均容易漏诊。因此，随着对be分子生物学认识的加深和传统疗法的缺陷，be的检测和治疗日趋向靶向化和个体化。

小分子多肽在靶向治疗中的研究进展

以小分子肽作为导向，构建治疗或诊断性的靶向药物具有成本低，免疫原性小，组织渗透性好的优点，而且很多小分子多肽与其配体的亲合力很高，不亚于抗体与抗原的亲和。可以作为导向的小分子肽包括两大类，一类是天然存在的，如生长激素释放抑制因子(somatostatin)、血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)等，它们分别在神经内分泌肿瘤、消化道肿瘤等的特异性诊断和治疗发挥了良好的导向性作用。另一类则是非天然存在的肽，与天然肽相比，该类肽的种类更多，鉴定更方便，而且有可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高，故该类肽成为近年来人们关注的热点。噬菌体随机呈现肽库筛选被认为是用于该类肽筛选的快速而有效的方法。

小分子多肽在靶向治疗中的应用

靶向性的小分子多肽作为诊断试剂，可以偶联放射性核素，同位素，荧光素等结合pet，ect或荧光内窥镜进行疾病诊断。作为治疗用，它们可以偶联化疗药物，基因工程蛋白药物，基因治疗药物构建肿瘤靶向性新药，增加抗肿瘤药物在肿瘤局部的药物浓度，提高抗肿瘤效果，降低系统毒性。靶向肿瘤新生血管内皮细胞表面整合素分子的rgd-阿霉素在达到相同治疗效果的同时，用量仅是单纯阿霉素组的1/40；靶向肿瘤新生血管内皮细胞表面cd13分子的ngr-人肿瘤坏死因子联合顺铂治疗难治性实体瘤具有系统毒性低，患者顺应性好的特点；ngr-阿霉素比普通阿霉素抑制肿瘤生长多40％；靶向人脐静脉细胞的sigyplp-腺病毒的基因转染效率是单纯腺病毒载体的15.5倍；rgd-肿瘤坏死因子能提高肿瘤局部药物浓度，增加肿瘤坏死因子的治疗指数。大量的基础和临床实验研究均证实了小分子多肽导向在肿瘤靶向治疗方面的潜能。

食管腺癌特异性结合作用的小分子多肽的靶分子的研究前景

目前的研究资料显示be发展为ea过程中，很多分子的表达发生改变。例如：鳞状上皮转录因子p63，sox2，pax9在hgd组织中表达下调；肠道上皮转录因子cdx2在经胆汁酸处理的鳞状上皮细胞表达上调；骨形成蛋白bmp4在gerd患者的食管上皮细胞中表达上调；bmp4的上游信号分子shh在ea组织表达上调；一种新发现的胆汁酸受体tgr5在ea组织表达上调等。此外，c-erbb2，egfr，src，k-ras，cyclind1，p16，p27，apc，p53等多种表皮因子受体、蛋白激酶、原癌基因被发现与be恶变相关。研究成果尽管众多，可是ea至今没有明确的特异性肿瘤标志物，为肿瘤靶向治疗和多肽导向抗肿瘤药物研究带来困难。食管腺癌特异性结合作用的小分子多肽的靶分子很有可能就是食管腺癌的特异性肿瘤标志物，对于肿瘤靶向治疗意义重大，也为食管腺癌发生发展机制积累线索。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种特异性结合上皮细胞黏附分子(简写为epcam)的靶分子多肽，所述靶分子多肽包含氨基酸序列snfymplgggsk，或者所述靶分子多肽包含氨基酸序列snfymplgggsk中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列且具有特异性结合上皮细胞黏附分子活性的多肽。

优选地，所述靶分子多肽的氨基酸序列为snfymplgggsk。

本发明的另一目的在于提供上述靶分子多肽的制备方法，所述方法包括以fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽。

优选地，所述方法还包括使用c18或c8柱对所述粗品多肽进行分离纯化。

优选地，在所述fmoc-固相多肽合成法中，以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂中的任何一种为固相载体。

优选地，本发明的目的在于，通过以n,n-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基-苯并-三氮唑(dic/hobt)、n,n-二异丙基碳化二亚胺/n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(dic/hoat)、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑(bop/hobt)、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑/n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(bop/hoat)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑(hbtu/hobt)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hbtu/hoat)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑(hatu/hobt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hatu/hoat)或6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑(hctu/hobt)中的一种为缩合剂进行接肽反应中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护的snfymplgggsk十二肽树脂。

优选地，在得到保护的靶分子多肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得靶分子多肽粗品。再经c18(或c8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得得纯度达98％以上的一种特异性结合上皮细胞黏附分子的靶分子多肽(以下简写为十二肽或snf十二肽)。

优选地，其中粗品经c18或c8色谱柱分离纯化的步骤为：

将靶分子多肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经c18或c8色谱柱纯化，流动相有两种：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1-150ml/min；检测波长为：215～285nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，冻干，获得成品。

所获得的食管腺癌特异性结合多肽具有生物学活性，具有与epcam较高的靶向结合能力。通过rna干涉实验，荧光偏振实验，免疫荧光实验，测定该蛋白质活性和靶向结合能力，结果表明，食管腺癌特异性结合多肽snfympl具有较高的epcam的靶向结合能力。且该方法仅使用一个层析柱就完成了目的蛋白的分离纯化，步骤简单、快速、成本低，为食管腺癌的诊断和治疗以及上皮细胞黏附分子在肿瘤诊断治疗中的作用奠定了进一步研究和广泛应用的基础。

另外，为了进行食管腺癌特异性结合十二肽snf与上皮细胞黏附分子epcam的靶向性验证，利用转录组测序结果进一步验证靶分子在食管腺癌细胞中的表达，利用荧光偏振，rna干涉和免疫荧光测定十二肽与靶分子的亲和力，鉴定十二肽的靶分子。

此外，本发明提供的化学合成法独具优势。其有益效果是：本发明snf十二肽固相合成制备方法具有以下特点：原辅材料来源方便，工艺稳定，收率高，质量可控，产品纯度高，生产周期短，成本低，可规模化生产。采用本发明方法制备的snf十二肽极具市场竞争力，其生产规模完全能够满足snf十二肽的应用需求，其质量完全能够达到snf十二肽的应用要求。

另外，在本发明的工艺中，采用温和的fmoc路线，每步脱fmoc仅用20％的pip，每步缩合反应时间短，大大缩短了生产周期；采用合理封闭技术，提高粗肽产品的纯度；切割采用tfa，避免了常用的氟化氢，减少了生产中产生的三废，有利于工业化生产。

附图说明

图1荧光偏振结果

图2rna干涉后食管腺癌细胞中epcam在mrna水平的表达

图3rna干涉后食管腺癌细胞中epcam在蛋白水平的表达

图4rna干涉后食管腺癌细胞的免疫荧光结果

具体实施方式

以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。

按照本发明所采用的技术方案是：通过以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂中的任何一种为起始原料，用dic/hobt或dic/hoat或bop/hobt或bop/hoat或hbtu/hobt或hbtu/hoat或hatu/hobt或hatu/hoat或hctu/hobt中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护snfymplgggsk十二肽树脂，其后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得snfymplgggsk粗品，再经c18(或c8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得得纯度达98％以上的snf十二肽。所获得的食管腺癌特异性结合多肽具有生物学活性，具有与epcam较高的靶向结合能力。通过rna干涉实验，荧光偏振实验，免疫荧光实验，测定该蛋白质活性和靶向结合能力，结果表明，食管腺癌特异性结合多肽snfymplgggsk具有较高的epcam的靶向结合能力。且该方法仅使用一个层析柱就完成了目的蛋白的分离纯化，步骤简单、快速、成本低，为食管腺癌的诊断和治疗以及上皮细胞黏附分子在肿瘤诊断治疗中的作用奠定了进一步研究和广泛应用的基础。

实现上述技术方案，总体方案按照以下步骤进行：

1)多肽合成。

(1)制备fmoc-lys(boc)-树脂：

以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂其中的一种作树脂，用n,n-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10～60分钟，混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；

然后在上述的树脂中，加入n,n'-二异丙基乙胺(diea)、n,n-二异丙基碳化二亚胺(dic)或4-二甲氨基吡啶(dmap)、fmoc-val-oh，10～50℃反应0.5～5小时，再加入封闭试剂甲醇、苯甲酰氯或吡啶10～50℃反应0.2-3小时，树脂用异丙醇、n,n-二甲基甲酰胺洗涤，获得fmoc-lys(boc)-树脂；

diea或dmap的摩尔数为树脂的2～20倍；

fmoc-lys(boc)-oh的摩尔数为树脂的1～10倍：

反应溶液中，树脂的浓度为0.5～5ml/g；

(2)制备fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(1)的fmoc-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-ser(tbu)-oh的摩尔数为树脂的1-5倍；

fmoc-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(3)制备fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(2)的fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩尔数为树脂的2～5倍；

fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(4)制备fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(3)的fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩尔数为树脂的2～5倍；

fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(5)制备fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(4)的fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩尔数为树脂的2～5倍；

fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(6)制备fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(5)的fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-leu-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(7)制备fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(6)的fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-pro-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(8)制备fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(7)的fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-met-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(9)制备fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(8)的fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-tyr(tbu)-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(10)制备

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(9)的

fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-phe-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(11)制备

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(10)的

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一种混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得fmoc-sn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-asn(trt)-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(12)制备

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(11)的

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea、tbtu/hobt或hbtu/hobt或bop/hobt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，抽干，获得

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

所说的脱帽试剂的组分和体积比为：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-ser(tbu)-oh摩尔数为树脂的2～5倍：

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩尔数为树脂的2-5倍；

hobt/hoat摩尔数为树脂的2-5倍；

(13)制备

ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂：

在步骤(12)的

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇、dmf、重蒸过的dmf洗涤，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5～3小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂；

(14)粗品的获得

把吹干的

ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20～10℃的切肽试剂(tfa/edt/h2o/thio＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)，10℃-50℃反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20～10℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1～6次，低温冷冻干燥10～24小时，获得作为十二肽的靶分子多肽粗品；

切肽试剂中，树脂的浓度为：5～50ml/g。

优选的是其还包括粗品经c18或c8色谱柱分离纯化的步骤。

更优选的是，其中粗品经c18或c8色谱柱分离纯化的步骤为：

将snf十二肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经c18或c8色谱柱纯化，流动相有两种：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1-150ml/min；检测波长为：215～285nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，冻干，获得成品。

在本文中，如未特别指出，“常温”表示室温，即25℃。

本发明的有益效果是：本发明snf十二肽固相合成制备方法具有以下特点：原辅材料来源方便，工艺稳定，收率高，质量可控，产品纯度高，生产周期短，成本低，可规模化生产。采用本发明方法制备的snf十二肽极具市场竞争力，其生产规模完全能够满足snf十二肽的应用需求，其质量完全能够达到snf十二肽的应用要求。

另外，在本发明的工艺中，采用温和的fmoc路线，每步脱fmoc仅用20％的pip，每步缩合反应时间短，大大缩短了生产周期；采用合理封闭技术，提高粗肽产品的纯度；切割采用tfa，避免了常用的氟化氢，减少了生产中产生的三废，有利于工业化生产。

前述过程中所采用的原料中英文列表1如下：

表1

实施例11g级别二氯树脂(2clresin)的snf十二肽合成过程

(1)制备fmoe-lys(boc)-2clresin

称取二氯树脂1g(吉尔生化(上海)有限公司；loadding：1.0mmol/g)倒入反应柱中，加入大约10mldcm，浸泡30分钟(常温)后用真空泵抽干，加入fmoc-lys(boc)-oh0.25g，diea0.9ml，dcm20ml，于常温反应2小时，再加入封闭试剂甲醇，常温反应3小时，树脂用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-lys(boc)-2clresin；

(2)制备fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(1)的fmoe-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-ser(tbn)-oh0.7g，diea0.4ml，tbtu0.34g，hobt1ml，dmf10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(3)制备fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(2)的fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.37g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常温反应37min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(4)制备fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(3)的fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.36g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常温反应71min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(5)制备fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(4)的fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.38g，diea0.4ml，tbtu0.42g，dmf10ml常温反应94min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(6)制备fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(5)的fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-leu-oh0.43g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常温反应74min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(7)制备fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(6)的fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-pro-oh0.38g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常温反应71min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc--pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(8)制备fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(7)的fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-met-oh0.43g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常温反应81min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(9)制备

fmoc-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(8)的

fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-tyr(tbn)-oh0.52g，diea0.4ml，tbtu0.36g，dmf10ml常温反应81min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(10)制备

fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(9)的fmoc-

tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-

2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-phe-oh0.42g，diea0.4ml，tbtu0.36g，dmf10ml常温反应71min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(11)制备

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(10)的

fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-asn(trt)-oh0.65g，diea0.4ml，tbtu0.39g，dmf10ml常温反应96min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

(12)制备

fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(11)的fmoc-

asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，加入fmoc-ser(tbn)-oh0.42g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常温反应67min，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，dmf洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，抽干，获得fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(13)制备

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步骤(12)的

fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的dmf溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用dmf洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的dmf洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡1.5小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为：

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(14)制备粗品

把吹干的

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20℃的切肽试剂(tfa9.5ml，h2o0.5ml)，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤3次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得snfymplgggsk肽粗品1.26g，经hplc测定纯度为78％(注：应该大于0.69/1.23)；

(15)纯化

将步骤(17)的snf十二肽粗品1.23g溶于13ml水中，过滤，滤液上样于c18色谱柱，流动相为如下a、b液体的混合物：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈。从a液体占混合物比例100％开始梯度洗脱，期间b液体占混合物比例逐渐升高，直至占100％，流速为10ml/min，检测波长为：215nm。收集目标峰(用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰)的流出液，浓缩冻干，获得成品，共获得成品0.69g(mw：1419.6)，经hplc测定纯度大于98％。

实施例2食管腺癌特异性结合验证

选取食管腺癌细胞oe33，以人食管上皮细胞q-htert细胞作对照。

荧光偏振测定结合力

将epcam活性片段(abcam公司)用pbs(27mmkcl，137mmnacl，10.1mm，1.8mm，ph7.4)从浓度10μm起逐渐对半稀释10次至0.001μm，分别加入黑色避光96孔板(corninglifescience,nonbindingsurfaceornbs)中，每孔60μl。每孔加入40μl100nmsnf-fitc室温孵育60分钟，荧光酶标仪(tecaninfinitem1000fluorescenceplatereader)读板，偏振值设为λex＝490nm和λem＝530nm。所得不同浓度的偏振值通过以下公式计算：

可得kd的偏振曲线，并算出kd值为kd＝172nmol/l(r^2＝0.997)。如图1所示，荧光偏振测snf十二肽和epcam的结合力结果显示，结合力kd值为kd＝172nmol/l(r^2＝0.997)，snf十二肽和epcam有结合，且结合力较高。。

rna干涉

在上海生物工程有限公司构建合成sirna。将细胞铺板(6孔板4x10⁵个细胞，8孔ezslide3x10⁴个细胞)，过夜，换培养基为opti-mem。将lipofectamine^tm2000(6孔板5ul/孔；8孔ezslide1ul/孔)与opti-mem(6孔板250ul/孔；8孔ezslide30ul/孔)混匀，静置5min。同时将sirna(6孔板5ul/孔；8孔ezslide1ul/孔)与opti-mem(6孔板250ul/孔；8孔ezslide30ul/孔)混匀。将混匀后一半体积的lipofectamine^tm2000与混匀后的sirna混合，静置20min。对照组仅加入lipofectamine^tm2000(6孔板255ul/孔；8孔ezslide31ul/孔)，实验组加入lipofectamine^tm2000与sirna的混合物(6孔板510ul/孔；8孔ezslide62ul/孔)。干涉结果，2天rna水平表达，3天蛋白水平表达。

qrt-pcr

1、细胞总rna提取

细胞铺板(6孔板)，待细胞长满后，预冷pbs(ph7.4)洗涤细胞三遍，加入trazol(1ml/孔)，冰上静置5min，枪头吹打。将各孔trazol吸到1.5mlep管中，加入预冷氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。冰上静置5min，离心(4℃，12000rpm，20min)。离心后液体分为三层(上层－无色水样层为rna，中层白色为dna和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的ep管中。加入等体积异预冷异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，冰上静置10min，离心(4℃，12000rpm，15min)。去上清，沉淀加入预冷乙醇1ml，震荡摇匀，离心(4℃，12000rpm，10min)。小心去上清，管内沉淀静置干燥20min。加入20uldepc水溶解，酶标仪紫外测rna浓度和纯度。

2、反转录

rna稀释，调节浓度为200ng/ul。加样：10mmdntpmix2μl；样品(rna)2μl；depc水6μl。反转录：37℃15min，85℃5s，4℃30min。所得样品加90μldepc水稀释。

3、qrt-pcr

加样：上下游引物各1μl/孔；cdna2μl/孔；green10μl/孔。

程序：起始(50℃2min；95℃2min)；40个循环(95℃3s；60℃30)数据分析：求出2^(-δδct)值，进行比较，如图2所示，epcam在mrna水平的表达结果显示，在mrna水平，oe33细胞中epcam的表达远高于在q-htert细胞中的表达。。

免疫印迹试验(westernblot)

1、培养细胞并做好rna干涉。

2、提取细胞总蛋白，加入5xloadingbuffer缓冲液，煮沸样品10minutes。

3、电泳分离：上样20μg至10％的sds-page胶(10cmx10cm)电泳。

4、转膜：

(1)依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将胶和pvdf膜浸于转移缓冲液中平衡15min。pvdf膜需用纯甲醇先浸泡饱和5秒钟再移入转移缓冲液中。

(2)装配转移三明治：海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵，每层放好后，赶去气泡，胶放于负极面(黑色面)。

(3)将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，恒流，300ma1h。

5、免疫杂交与显色：

(1)置膜于25ml封闭缓冲液中，4℃过夜，缓慢摇动。15mltbst洗3次(10min/次)。

(2)加入稀释后的(1：1000)的一抗，4℃过夜，缓慢摇动。

(3)15mltbst洗3次(10min/次)。

(4)加入稀释后的(1：5000)辣根过氧化酶(hrp)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。

(5)15mltbst洗3次(10min/次)。

(6)蛋白检测，机器扫膜。见图3所示epcam在蛋白水平的表达结果显示，在蛋白水平，oe33细胞中epcam的表达远高于在q-htert细胞中的表达。

免疫荧光

1、培养细胞并做好rna干涉。

2、预冷pbs洗两遍，山羊血清封闭20min

3、免疫荧光染色，抗体组(对照组)为间接抗体染色：每个孔加入200μl一抗(1：400)，4℃摇摆过夜；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；每个孔加入200μl荧光二抗(1：800)，室温孵育30min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；200μl4％多聚甲醛固定20min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗一遍；100μldapi(1：100)染色7min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；10μl抗荧光淬灭剂封片。snf组(实验组)：每个孔加入200μlsnf(800μg/ml)，室温孵育30s；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；200μl4％多聚甲醛固定20min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗一遍；100μldapi(1：100)染色7min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；10μl抗荧光淬灭剂封片。

4、倒置荧光显微镜看片。免疫荧光实验检测十二肽对epcam的靶向性结果显示，在epcam表达量高的oe33细胞表面上结合的snf十二肽远高于在q-htert细胞表面的结合量。这证实snf十二肽对细胞的靶向性随着epcam的增加而增加。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。