技术领域本发明属于基因工程技术领域，主要涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及对应打靶载体的构建、应用，本发明是利用一对转录激活效应因子核酸酶定点敲除山羊BLG基因和敲入人乳铁蛋白(hLF)基因，获得BLG-/hLF+转基因胎儿成纤维细胞，并应用该细胞作为供核细胞，通过体细胞核移植制备BLG-/hLF+基因打靶转基因山羊。
背景技术：
BLG是奶山羊乳乳清中的乳清蛋白成份之一，不存在于人乳中。山羊BLG基因编码105个氨基酸。BLG分子一般在羊乳中以二聚体的形式存在，一个分子的Asp130和Glu134与另一个分子的赖氨酸残基以共价键相结合。BLG是一种结构化蛋白，耐酸和耐蛋白酶水解，胃蛋白酶不能将其水解。因此，消化后人体内还存在着完整的BLG可能会引起过敏反应。2000年Hattori等的报告指出牛乳过敏症患者中82％的人对β-乳球蛋白是敏感的。2005年Fritsche等的研究表明：BLG的抗体血清识别BLG的肽段，其中149-162肽链是主要的IgE识别表位。通过传统的乳品加工方法，如酶消化、加热和糖基化处理均难消除BLG致敏原。人乳铁蛋白(humanLactoferrin，hLF)是人初乳中一种功能性蛋白，具有增强免疫功能，分子量大小为80kDa。乳铁蛋白是一种乳蛋白，在人初乳中含量丰富，但在羊奶中含量极低，乳铁蛋白具有广泛而独特的生物学功能和理化特性(抑菌、抗病毒、调节免疫、促进铁吸收等)，国际上各个领域的学者对其进行研究。在国外，已有乳铁蛋白的成品问世，但多为动物来源的乳铁蛋白，而且乳铁蛋白的天然来源有限，大规模的工业生产人乳铁蛋白将依赖于基因工程。因此如何高效、廉价地工业化生产人乳铁蛋白有很高的经济价值和应用意义。目前，乳铁蛋白研究、应用和开发仅局限于少数发达国家，成本较昂贵、表达较低及不稳定性，因此，应用基因工程技术，对其进行精细修饰，利用乳腺生物反应器以获得高效表达重组乳铁蛋白的转基因生物，以满足市场需求，这是当前研究的热点。近年来研究表明，hLF基因也可以在动物乳腺中表达，人乳铁蛋白的生物活性及对人体有益的功能要大大强于动物乳铁蛋白，因此，要动物乳中增加人乳铁蛋白成份可显著提高乳品质，甚至可以替代人乳。通过对山羊BLG基因的敲除修饰，并在BLG基因座定点整合hLF基因等遗传定向修饰，获得乳腺特异性表达转基因羊，可用于羊乳的人乳化改造，并且可以降低或消除乳汁中BLG过敏源，同时增加人乳铁蛋白(HumanLactoferrin，hLF)功能成分，提高羊奶的品质，生产高端羊奶，具有很大的经济价值和社会效应。迄今为止，在动物转基因研究中外源基因整合宿主动物染色体有两种方式，一种是随机整合，另一种是基因定点修饰。前者技术要求低，但对品种培育存在较大缺陷，外源基因在传代过程中易丢失，易造成宿主动物其他功能异常；后者虽技术要求高，但遗传背景清晰，外源基因传代稳定。哺乳动物基因定点修饰根据同源重组原理实现的，这一技术的经典方法的缺点是中靶率低，，通常只有10-6-10-8，对打靶载体要求高。人们一直在寻找简单高效的基因打靶方法。近年来核酸酶指导的基因组靶向修饰技术发展迅速。这类核酸酶通常由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成，由DNA识别结构域特异的识别靶位点，把核酸酶定位到需要进行编辑的基因组区域，然后由非特异性核酸内切酶切断DNA双链，引起DNA断裂自我修复机制，从而引发基因序列的突变和促进同源重组的发生。人工锌指核酸酶(ZincFingerNucleases，ZFN)技术是第一代核酸酶定点修饰技术。ZFN技术曾被作为诱导基因组突变及提高同源重组效率的主要手段。但是，由于ZFN受上下游依赖效应的影响，与靶点DNA序列之间结合不稳定，不能定位所有靶序列，需要大量的筛选和鉴定工作，易产生脱靶性突变。此外，成套的商业化的ZFN价格昂贵，设计烦锁，效果不稳定。转录激活样效应因子(transcriptionactivator-likeeffector,TALE)具有DNA结合特异性，识别密码的模块化操作简洁和方便。TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含34个氨基酸，把单元的第12和13位氨基酸设计为可变区(repeatvariablediresidues,RVDs)。TALE的RVDs识别DNA序列的4个碱基具有高度专一性，第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合。研究者能够根据DNA序列，在任意位点构建特异的TALE-DNA识别结合域，可以广泛用于基因序列突变修饰和基因打靶等。设定DNA靶序列，组装TALE-DNA结合域，融合FokI内切酶的非特异性DNA切割域，组装成TALE核酸酶(tanscriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)。TALENs靶向结合DNA，产生DNA双链断裂(DNAdouble-srandbreaks,DSBs)。在真核细胞内DSBs激活两条保守的DNA修复通路。非同源末端连接修复(non-homologousendjoining,NHEJ)可以将断裂的染色体重新连接，在连接过程中断裂位点有可能引入小片段碱基的丢失或插入，从而影响基因功能或产生基因敲除效应。若此时引入同源重组载体，同源指导修复(homology-directedrepair,HDR)能够利用相似的DNA模板指导修复，替代断裂点周围的DNA序列，实现特定突变或定点导入外源DNA。通过TALENs介导的基因打靶技术，对致敏原乳蛋白基因进行敲出，同时可定点引入人源的功能蛋白，利用内源的乳腺特异性表达调控序列，在乳腺中特异性的表达人源蛋白，实现乳汁的人乳化，改善乳汁品质和营养价值。2004年孙丽新等的研究将人乳铁蛋白(hLF)基因在山羊β-酪蛋白基因位点定点插入，希望在家畜乳汁中特异性高效的表达hLF，但最终未获得基因打靶的山羊。2007年Shen等报道了在山羊胎儿成纤维细胞中敲除山羊β-酪蛋白基因，希望能获得降低乳过敏原性的山羊新品系，但未能获得基因打靶的山羊。虽然已经有TALENs技术应用于山羊基因定点报道，但应用这一技术一次性敲除BLG基因，并定点整合hLF基因尚未见报道。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种山羊BLG基因定点敲除及其在BLG基因座定点整合hLF的系统方法和应用。本发明中术语山羊BLG基因是指山羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)。本发明中术语山羊hLF基因是指人乳铁蛋白(humanlactoferrin)。本发明中术语TALENs是指转录激活因子样效应物核酸酶(thetranscriptionactivator-likeeffectornucleases)。为了解决上述问题，本发明采取了如下技术方案：一种山羊BLG基因定点敲除敲除系统，所述定点敲除敲除系统为剪切山羊BLG基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；所述山羊BLG基因靶序列位于山羊BLG第3外显子(NCBI,emb|Z33881.1|,8088bp)，转录起始位点下游，其中，3959-3974位核苷酸为左臂识别模块，3992-4008位核苷酸为右臂识别模块，3975-3991位核苷酸为间隔序列spacer；所述的转录激活样效应因子核酸酶TALENs由剪切所述识别模块TALEN-3-L和剪切所述识别模块TALEN-3-R组成，核苷酸序列为TALEN-3-L:TGTGCTCAGAAGAAGAT(SEQIDNO.1)；TALEN-3-R:TGAACACCGCAGGGATCT(SEQIDNO.2).所述TALEN-3-L，由识别结构域TALE-L与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，由识别结构域TALE-R与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成；一个具体的山羊BLG基因定点整合系统，所述定点整合系统为人乳铁蛋白打靶载体BLTF-7-82；所述的BLTF-7-82打靶载体由山羊BLG同源臂DNA序列、功能基因hLF及负筛选基因TK等组成，见图7。本发明还提供上述山羊BLG基因定向修饰系统的制备方法，是在山羊BLG基因座位点一步法敲除BLG基因部分序列导致BLG表达失活的同时在同一位点整合hLF基因；包括在山羊BLG序列特定位点设计TALENs识别序列和删除序列，并以BLG序列为同源臂，连接功能基因hLF和筛选基因，组成基因打靶载体BLC14-TK的步骤。所述BLC14-TK基因打靶载体结构(图7)，5′-BLG-3744～-6+hLF2266bp+pA415bp+NEO1319bp+3′-BLG1609bp+tk4.4kb，其特征是在该BLG区间内同源臂及对应的TALENs设计将一步产生BLG-/hLF+的基因修饰细胞及个休。上述山羊BLG基因定点敲除和hLF定点整合系统的制备方法，具体是：(1)以所述山羊BLG基因核苷酸序列为靶序列位于山羊BLG第3外显子(NCBI,emb|Z33881.1|,8088bp)，转录起始位点下游，其中，3959-3974位核苷酸为左臂识别模块，3992-4008位核苷酸为右臂识别模块，3975-3991位核苷酸为间隔序列(剪切靶点)。(2)获得识别模块TALEN-3-L和TALEN-3-R组成剪切所述靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs。(3)以山羊BLG调控序列为同源臂，连接功能基因hLF和筛选基因，组成基因打靶载体BLC14-TK。本发明公开了山羊BLG基因定点敲除系统在制备BLG-/hLF+转基因胎儿成纤维细胞中的应用。本发明进一步公开了含有上述山羊BLG基因定点敲除系统编码基因的重组表达载体和重组菌；山羊胎儿成纤维细胞中表达上述BLG基因定向修饰系统的步骤；打靶载体BLC14-TK中15kb的DNA片段中含BLG同源臂，hLFcDNA序列，NEOr抗性筛选基因及GVC负筛选基因，该载体识别模块TALEN-3-L和TALEN-3-R材料同时用于转染胎儿成纤维细胞，基因浓度分别10μg/mL。共转染山羊胎儿成纤维细胞36小时培养液中加入800μg/mLG418+10μg/mLGCV；培养7-10天左右后换400μg/mLG418+5μg/mLGCV培养。一种BLG-/hLF+基因打靶转基因山羊的制备方法，利用所述山羊BLG基因定点敲除修饰系统定点敲除山羊BLG基因和敲入人乳铁蛋白(hLF)基因，获得BLG-/hLF+转基因胎儿成纤维细胞，并应用该细胞作为供核细胞，通过体细胞核移植制备BLG-/hLF+基因打靶转基因山羊。本发明相对于现有技术来说，本发明成功地应用TALENs技术改造山羊BLG基因座基因，在删除部分BLG序列的同时原位整合hLF基因，这一技术为定点修饰的转基因哺乳动物制备建立了更为便捷、可靠和经济的技术体系。附图说明图1TALEN载体RVD识别模块图。图2.TALEN左/右臂骨架载体图3基因打靶载体构建流程图。图4.PCR扩增BLG5’基因片段。M:DNAMarker2000，1:PCR扩增BLG5’基因。图5.PCR扩增BLG3’基因片段。M:DNAMarker2000；1:PCR扩增BLG3’基因。图6.M:DNAMarkerλ-T14。1:PCR扩增BLC14功能区基因片段。图7.BLG基因打靶载体图8.原代胎儿成纤维细胞(100×)。图9.单克隆细胞株(100×)。图10.M:DNAMarker2000；1～12与14～23为经正负筛选的细胞基因组PCR样品；13为阳性对照；24为阴性对照；25为空白对照。图11.M:DNAMarker2000；1～9与12为经正负筛选的细胞基因组PCR样品；10为阴性对照；11为空白对照。图12.hLF基因和CMV基因在BLG基因定点整合的阳性克隆细胞株测序鉴定结果。A图深色线为筛选获得的阳性细胞株基因组PCR产物测序结果与理论序列比对在BLG基因组5’外侧完全一致，证明该细胞为定点整合BLG基因的阳性细胞株。B图深色线则为PCR产物测序结果与理论序列在功能基因CMV上的比对图，说明在功能区其序列也完全一致。具体实施方式下面结合图表和具体实施案例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定，具体操作过程按照下面步骤进行：第一步，根据需打靶位置和打靶基因，构建打靶载体(同源臂+功能基因+筛选基因)；第二步，根据需打靶位置的基因序列设计出具有特异性的序列TALENs靶点；第三步，根据设计出的TALENs靶点构建出TALENs质粒；第四步，将TALENs质粒转染受体细胞，筛选、扩大培养、鉴定细胞基因组突变效率；第五步，将TALENs质粒与打靶载体BLTF-7-82共转染受体山羊胎儿成纤维细胞，筛选、培养、挑取单克隆，单克隆扩大培养，鉴定单克隆细胞基因打靶情况，挑选出中靶细胞保存，以作后续供核细胞；第六步，通过体细胞核移植技术制备基因打靶山羊，获取胎儿，建立基因打靶细胞系。下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得，可用类试剂或试剂盒替代。实施例1：山羊BLG基因座定点整合hLF基因本发明应用TALENs技术，针对山羊BLG基因exon3进行定向修饰操作，从而实现BLG基因的敲除和hLF基因的敲入。一、山羊BLG基因TALENs的设计与构建本发明选择山羊β-乳球蛋白基因(BLG)位于11号染色体上编码BLG的转录单元长4698bp，5’端非翻译区2148bp，3’端非翻译区1242bp，含有七个外显子，六个内含子。设计本发明基因打靶方案，按照已有报道的TALENs设计原则，以山羊BLG基因序列为模板设计TALENs，在第一外显子ATG-2189起始密码子附近选取2条靶序列，作为指导构建TALENs表达载体的靶向识别序列。选取与靶序列相对应的识别双残基模块和骨架载体，经过连接、转化、筛选、鉴定，最终获得2对TALEN表达载体(TALEN-L/TALEN-R、TALEN-L3/TALEN-R2)，TALENs表达载体的构建为TALENs活性鉴定及BLG基因定点修饰技术奠定基础。实验材料2.1主要试剂酵母提取物、精解蛋白胨和琼脂粉(购自Oxiod公司)；DNA聚合酶(DNApolymerase)、dNTP、DNAMarker(DL2000)、BamHI、ClaI各种限制性内切酶、Trans1-T1ChemicallyComptentCell、CaCl2、NaCl、NaOH、SDS、Tris、KCl、葡萄糖、冰乙酸、磷酸缓冲液等分析纯试剂及其它常用试剂。FastTALETMTALENAssemblykit(上海斯丹赛生物科技公司有售)。2.2试验仪器及器材移液器、高速台式离心机、高速冷冻台式离心机、基因扩增仪、隔水式恒温培养箱、恒温振荡培养箱、凝胶成像分析系统、电子天平、PH检测仪、–80℃超低温冰箱、超净工作台、DNA电泳仪和电泳槽、蛋白电泳仪、电热恒温水槽、制冰机、自动双重纯水蒸馏器、普通冰箱、核酸蛋白定量分析仪、超声波清洗器。2.3主要试剂的配制主要试剂如LB液体、固体培养基，碱裂解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，50×TAE等的配制参考金冬雁等译著的《分子克隆实验指南(第二版)》所介绍的方法。实验方法连接产物转化、质粒小量或大量提取、限制性内切酶酶切反应、DNA电泳等常规分子克隆实验方法均参考金冬雁等译著的《分子克隆实验指南(第二版)》所介绍的方法。3.1BLG基因的检索在NCBI网站(美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide库中进行检索，关键词“BLG”、“Caprahircus”、“Orytolaguscuniculus”，获得山羊BLG序列。3.2TALENs的设计以山羊BLG基因(GenBankAccessionNo.Z33881)序列为模板，参考Bogdanove等、Joung等与Rebar等给出的指导原则(TALEN靶序列的第0位(5′端的前一位)碱基应为胸腺嘧啶；Spacer在13～30bp之间；重复单元数在9～24之间)，利用Bogdanove实验室建立的TALEffector-NucleotideTargeter(TALE-NT)2.0网络软件(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)进行TALEN设计。按照网站提示输入山羊BLG基因序列，设定Spacer长度为：最小值13bp；最大值20bp。设定重复单元数为：最少14个重复单元；最多19个重复单元。G识别RVD选择NN；筛选选项(FilterOptions)选择显示TALEN对(ShowTALENpairs(hideredundantTALENs))；不设定剪切位点与指导方针；上游基序(5′端第0位碱基)设定为T。点击确定完成设计，软件按照设定的参数自动生成并输出所有符合条件的成对的TALEN靶序列及其相应的RVDs序列，在第一内选取2对TALENs，用于设计靶位点的修饰，按照靶序列进行载体构建。3.3TALENs表达载体的构建与鉴定使用TALEN快速构建试剂盒FastTALETMTALENAssemblykit进行TALENs表达载体的构建。该试剂盒含有144种双RVD模块和28种单RVD模块(见图1)、8种基础骨架载体，左右臂各4个(左臂载体L14～17；右臂载体R10～13)，它们均含有NLS，N端，C端，FokⅠ(左右臂骨架的FokⅠ序列不同)等基本结构，4个载体间的不同在于TALEN识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种(见图2)。左臂载体上有puromycin的抗性基因，在TALENs载体表达过程中，质粒转染入细胞后可以通过加嘌呤霉素来进行初步筛选，将未转染的细胞杀死，富集阳性克隆的比例，减少后续克隆挑选的工作量。编号1～9的模块可以按照数字序号连接在一起，但是最后两个模块的连接必须为双RVD模块，8种骨架载体上分别含有左侧或右侧TALE的最后半个重复序列和RVD，因此使用此试剂盒可以构建含有10.5～18.5个重复单元的TALENs表达载体，能够满足本次试验的需要。表1TALENs靶序列按照2.2中选取的2对TALENs的识别序列(见表1)，分别选取识别模块及相应的骨架载体，构建2个TALEN表达载体，并分别给予命名，见表2。表2TALENs表达载体按照表2所列的模块和骨架载体选择方案分别进行2个TALEN表达载体的装配，操作步骤参考FastTALETMTALENAssemblykit说明书，简述如下：(1)按照表1分别选择骨架载体和9种连接模块，在PCR薄壁管中按如下体系混合：(2)将混合反应液置于PCR仪内进行反映，反应条件：37℃5min；16℃10min；上述步循环15次；80℃10min；12℃2min。(3)取出PCR反应管，依次向混合反应液中加入溶液4和溶液5各1μL和0.5μL，混合后置于37℃水浴锅中孵育60min。(4)连接产物的转化：取10μL上述连接产物，加入到Trans1-T1感受态细胞中，轻柔混匀后冰水中静置30min，然后将感受态细胞置于42℃水浴锅中热激45s，然后迅速转移至冰水中静置3min，加入900μL无抗生素LB培养液(37℃预热)，然后放入摇床中培养(37℃，200r/min，30min)；6000r/min离心沉淀菌体，弃900μL上清液，然后将菌体重悬，涂布至固体LB培养基(37℃预热，预先加入卡那抗菌素)，放入恒温培养箱中37℃培养16～24h。(5)通常培养16h即可长出明显菌落，挑取一定数目的菌落，每菌落加入5ml液体LB培养基进行小量培养(37℃，200r/min，12h)。(6)小量提取质粒，所有载体均用用ClaI限制性酶切进行鉴定。(7)挑选酶切正确的质粒进行测序，测序引物为：上游引物(p305)和下游引物(p306)，分别位于TALEN表达载体识别序列的上游和下游区域，其序列见表3。表3测序引物二、乳腺特异性表达hLF基因打靶载体的构建本方法为了获得能够在山羊乳腺中特异性高效表达人乳铁蛋白的载体，本发明以山羊BLG基因为模板，PCR分别扩增出山羊5’调控序列1035bp和3’调控序列1826bp，再以本实验室保存的BLC14为基础，载体包括5’调控序列、CMV启动/增强子、hLFcDNA基因序列、SV40polyA启动/增强子、NEO基因和3’调控序列，通过PCR扩增的方法获得其功能基因序列，然后连接上述BLG调控序列，鉴定插入序列的正反向，挑取正确的载体。在确定正确的乳腺特异性基因表达载体之后，通过酶切线性化，再与实验室保存的含有一个HSV-TK的负筛选基因序列相连接，从而获得本实验需要的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体。1、试验材料1.1菌种及质粒BLC14质粒菌种(含山羊β-乳球蛋白基因调控序列载体)、宿主菌DH5α均由本实验室保存。1.2试验仪器试验仪器同第一部分1.3分子生物学试剂pGEM-T克隆载体、高保真DNA聚合酶(PyrobestDNApolymerase)、各种限制性内切酶和DNA连接酶、。DNA纯化试剂盒、其它常用国产试剂及生化试剂与第一部分相同。1.4主要试剂的配制(1)LB液体培养基蛋白胨5g+酵母粉2.5g+NaCl5g+500mL双蒸水，调pH至7.5，高压灭菌冷却至室温待用。(2)LB固体培养基蛋白胨1g+酵母粉0.5g+NaCl1g+琼脂粉1g+100mL双蒸水，高压灭菌，待温度降至室温，铺板后待用。(3)氨苄青霉素(AMP)1g氨苄青霉素+4mL双蒸水，配成浓度为250mg/mL的储液，分装，-20℃保存。(4)质粒提取溶液溶液Ⅰ：50M葡萄糖+25mMTris(pH8.0)+10mMEDTA(pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2MNaOH+1％SDS(w/v)，现用现配(1:1体积)；溶液Ⅲ：3MNaAc，以冰醋酸调至pH5.5。(5)TE缓冲液10MTris·Cl(pH8.0)+1MEDTA(pH8.0)。(6)50×TAE贮存液242gTris碱+51.7mL冰乙酸+100mL0.5MEDTA(pH8.0)，加水定容至1L，4℃保存，使用时以双蒸水稀释成1×。(7)50×EB贮存液1g溴化乙锭粉末+100mL双蒸水，配成浓度为10mg/mL的储液，4℃保存，用时以双蒸水稀释成1×。(8)RNaseA溶液RNaseA溶于10mmol/LTris和15mmol/LNaCl混合液中，配制成浓度为10mg/mL，100℃煮沸15min，-20℃保存。2.方法2.1PCR引物合成和测序所有PCR引物设计借助于PrimerPremier5.0引物设计软件设计完成，由上海英骏生物技术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司合成；PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司和上海杰瑞生物技术公司完成。测序序列经DNAStar软件进行DNA序列分析。2.1常规分子生物学的操作方法实验中使用CaCl2法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞，细菌的转化、筛选及保种，大量或小量地制备质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳等操作方法均参照金冬雁等译的《分子克隆实验指南(第二版)》。2.2质粒酶切反应单酶切反应：参照产品说明书，将反应体系置于最适反应温度中，水浴适当时间，取少量反应液于1％琼脂糖凝胶电泳中观察酶切结果。双酶切反应：参照各种酶在不同缓冲液中的相对活性和通用缓冲液使用说明表，一般在同一缓冲体系中所用酶的活性均在70％以上，则可在这一反应体系中进行双酶切反应。如果缓冲体系或温度不一致，则应按先低盐后高盐，先低温后高温的顺序来进行。完成第一酶切后，苯酚/氯仿抽提，冰乙醇沉淀，再进行第二酶切反应。具体参见TaKaRa说明书，一般均在通用缓冲液中可查找。例如10μL酶切反应体系如下：37℃(参照酶说明书设定温度)，水浴2h，吸取少量3-5μL作电泳鉴定。双酶切参照此体系。如若需要割胶回收酶切产物，则需适当地按比例放大酶切体系和延长酶切时间。2.3酶切产物的回收DNA的回收和纯化，按照QIAGEN胶回收试剂盒的说明操作如下：(1)使用1×TAE缓冲液制作1％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖胶电泳。(2)用锋利的刀片切下一小部分进行EB染色，其余不进行染色。(3)在紫外灯下观察染色部分凝胶并对目的DNA条带进行标记，然后将其与未染色的凝胶对比，切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶。(4)将切下的含目的DNA的凝胶条切碎，装于2mL离心管中。(5)称量胶块重量，并记录。(6)向胶块中加入3倍胶块体积的BufferQG(计算胶块体积时，以1mg＝1μL计算)。(7)均匀混匀后，50℃加热融化胶块10min，期间每隔2min振荡混合一次，使胶块充分融化。(8)待胶块完全融化后再继续放置2min，检查溶液的颜色，与BufferQG颜色一样，应为黄色。(9)加入1倍体积的分析级异丙醇，混匀。(10)将试剂盒中的QIAquickspincolumn安装于2mL的收集管上。(11)将融化后的胶块溶液转移至column中，12000rpm离心1min，弃滤液。(12)加入500ul的BufferQG于column中，12000rpm离心1min，弃滤液。(13)加入750ul的BufferPE(用前已加入无水乙醇)于column中，12000rpm离心1min，弃滤液。(14)将column安装于新的1.5mL的离心管上，13000rpm空离，1min。(15)将column重新安装于另一新的1.5mL的离心管上，向column膜的中央处加入50μL的灭菌水，室温静置5min。(16)13000rpm离心1min,洗脱DNA。(17)将洗脱后的DNA溶液再次加入column膜中央处，室温静置5min。(18)13000rpm离心1min，洗脱DNA，-20℃保存待用。2.4连接反应在灭菌的0.2mL离心管中建立以下反应体系：15℃，孵育过夜。相应的载体和DNA片段的连接量按以下公式计算：其中摩尔比可在一定的范围内变化，50:1-1:1。3.试验方法3.1PCR扩增BLG5’、BLG3’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区3.1.1山羊BLG5’调控序列的扩增本发明选择在NCBI上已公布的序列长度为8088bp的山羊BLG基因(GenBankAccessionNo.Z33881)染色体基因组序列为模板设计山羊BLG基因5’调控序列，设计的引物为：BLG5’-1,BLG5’-2,引物设计完成后送上海生工生物工程有限公司合成。同时，为了便于克隆，在上、下游引物5′端分别添加了sacⅡ酶切位点。引物序列和扩增条件见(表1)。PCR反应体系如下：以山羊基因组DNA(来自萨能奶山羊)为模板，PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退45s，72℃延伸1.5min，扩增33个循环；72℃孵育5min。PCR扩增产物克隆入pGEM-T载体获得pGEM-T-BLG5’载体，并经基因测序验证扩增序列的正确性。3.1.2山羊BLG3’调控序列的扩增山羊BLG3’调控序列的扩增同样以序列长度为8088bp的山羊BLG基因染色体基因组序列为模板，设计的引物为：BLG3’-1,BLG3’-2,引物设计完成后送上海生工生物工程有限公司合成。同时，为了便于克隆，在上、下游引物5′端分别添加了claⅠ和salⅠ酶切位点。引物序列和扩增条件见表4。PCR反应体系如下：以山羊基因组DNA(来自萨能奶山羊)为模板，PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，62℃退45s，72℃延伸2min，扩增33个循环；72℃孵育10min。PCR扩增产物克隆入pGEM-T载体获得pGEM-T-BLG3’载体，并经基因测序验证扩增序列的正确性。3.1.3PCR扩增乳腺特异性表达载体功能区以本实验室保存的乳腺特异性表达载体Blc14为基础，PCR方法扩增获得4500bp左右的乳腺特异性表达载体功能区，包括CMV启动/增强子、hLFcDNA基因序列、SV40PolyA启动/增强子和NEO基因，设计的引物为：BLTF-1,BLTF-2,引物设计完成后送上海生工生物工程有限公司合成。为方便后续克隆、连接需要，在上、下游引物5′端分别添加sacⅡ和claⅠ酶切位点。PCR反应体系如下：以山羊基因组DNA(来自萨能奶山羊)为模板，PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，68℃退45s，72℃延伸5min，扩增33个循环；72℃孵育10min。PCR扩增产物克隆入pGEM-T载体获得pGEM-T-BLTF载体，并经基因测序验证扩增序列的正确性。引物序列和扩增条件见(表1)表4.BLG5’、BLG3’调控序列和表达功能区的引物扩增序列和条件3.2山羊BLG5’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区相连以sacⅡ酶切含有BLG5’调控序列的pGEM-T-BLG5’载体，同时以sacⅡ酶切pGEM-T-BLTF载体，分别得到1035bp线性化的BLG5’调控序列和7.2kb(含3kb的pGEM-T载体序列)的乳腺特异性表达载体功能区序列，将两者经T4连接酶相连，转化感受态细胞，挑取单克隆细菌提取质粒，电泳，初步剔除明显不正确或未提到的质粒，再经酶切鉴定重组克隆正反向，挑取符合预期的菌种进行测序。测序结果正确的构建命名为BF。3.3山羊BLG3’调控序列和表达载体BF相连以claⅠ和salⅠ同时酶切含有BLG3’调控序列的pGEM-T-BLG3’载体，同时以claⅠ酶切BF质粒，分别得到1826bp线性化的BLG3’调控序列和8.2bp左右的线性化质粒BF，将两者经T4连接酶相连，转化感受态细胞，挑取单克隆细菌提取质粒，电泳，初步剔除明显不正确或未提到的质粒，再经酶切鉴定重组克隆正反向，挑取符合预期的菌种进行测序。测序结果正确的构建命名为乳腺特异性表达载体BFN-7。3.4含单个负筛选HSV-TK基因与乳腺特异性表达载体BFN-7相连如图3，含有单个负筛选HSV-TK基因的质粒Porf-hsv1tk(Invitrogen,4.4kb)经XhoⅠ酶切线性化，纯化后用Klenow酶补平末端。乳腺特异性表达载体BFN-7经SalⅠ酶切线性化之后，用Klenow酶补平末端；末端补平的Porf-hsv1tk片段与补平的片段连接获得打靶载体BLTF-7-82。该质粒DNA经EcoRⅠ酶切鉴定插入方向，并经测序验证序列的正确性。3构件验证3.1PCR扩增BLG5’、BLG3’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区3.1.1山羊BLG5’和BLG3’调控序列的扩增经PCR分别扩增获得1035bp的BLG5’调控序列和1826bp的BLG3’调控序列，克隆到pGEM-T中，测序序列与山羊基因组序列(GenBankAccessionNo.Z33881)进行比对，同源性为100％。PCR产物以1％凝胶电泳确定大小。(见图4和5)3.1.2PCR扩增乳腺特异性表达载体功能区PCR方法扩增本实验室保存的乳腺特异性表达载体Blc14功能区，以获得大小为4200bp左右的基因片段，该片段包括CMV启动/增强子、hLFcDNA基因序列、SV40PolyA启动/增强子和NEO基因，PCR产物以1％凝胶电泳确定大小。(见图6)3.1.3乳腺特异性表达hLF基因打靶载体的构建PCR扩增出的BLG5’调控序列通过sacⅡ酶切回收1035bp大小片段与PCR方法扩增获得4200bp左右的乳腺特异性表达载体功能区片段连接，鉴定插入方向和大小的正确之后再与claⅠ和salⅠ双酶切回收的1826bpBLG3’调控序列连接，同时鉴定插入方向和大小的正确。经鉴定,其中5株转化的候选质粒大小方向正确，并且连接接头测序比对结果表明连接序列正确，分别为3#、7#、20#、31#和34#菌株，来自7#菌株的质粒命名为hLF表达载体BFN-7。将HSV-TK基因载体Porf-hsv1tk与BFN-7片段连接，转化大肠杆菌获得13个候选质粒大小符合预期的质粒菌株(13.6kb)。质粒DNA用ECORⅠ酶切鉴定，其中6个菌株与预期片段大小相符，得到3个片段酶切片段(7249、3223、和1792bp)，并且载体经测序证实其序列与载体设计序列一致，构建正确的载体命名为打靶BLTF-7-82。(见图7)三、基因打靶细胞系和基因打靶山羊的制备该部分将BLTF-7-82基因打靶载体与TALEN-L/R质粒共转染山羊胎儿成纤维细胞，经G418和GCV药物筛选，获得药物抗性胎儿成纤维细胞125株；经PCR检测，获得基因打靶细胞株4株，基因打靶效率为1.5×10-6，同源重组检测显示4株细胞均为hLFcDNA基因在单BLG基因位点定点整合。为提高生产基因打靶动物的效率，本发明通过再克隆(Recloning)方法生产基因打靶克隆山羊。以4株基因打靶细胞作为供核细胞进行体细胞核移植，制作重构胚胎，重构胚移植受体山羊，获得妊娠和基因打靶胎儿。1.试验材料1.1试验仪器除前述仪器外还需要：CO2培养箱、荧光倒置显微镜和显微操作仪、拉针仪、磨针仪、体视显微镜、。1.2试验器械常规手术器械，眼科剪，眼科镊，玻璃吸管，玻璃瓶皿，10mL玻璃离心管，细胞培养板(Nunc，丹麦)。1.3主要试剂LATaq酶、内切酶、修饰酶购自宝生物工程(大连)有限公司，胶回收试剂盒购自Qiagen公司；DMEM/F12细胞培养液购自Hyclone公司，胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO公司，G418购自Amesco公司，丙氧鸟苷(GCV)购自Sigma公司；M2、M16、透明质酸酶(hyaluronidase)、核荧光染料hochest33342、细胞松弛素B(cytochalasin,mionomycinB)、6-甲基氨基蝶呤(N-6dimethylaminoprine)购自美国sigma公司；FSH,LHRH-A3和PG购自宁波激素厂；其它未说明试剂均为购自美国Sigma公司。1.4试验动物Saanon奶山羊、白山羊、受体山羊来自江苏徐州和高邮地区的杂交山羊。2.试验方法2.1胎儿成纤维细胞的准备2.1.1原代山羊胎儿成纤维细胞的准备胎儿成纤维细胞0.25％胰蛋白酶37℃消化细胞10min，消化悬液离心收集细胞并细胞计数，细胞培养液(DMEM/F12+10％FBS)悬浮细胞密度至5×105个细胞/mL；细胞接种到175cm2细胞培养瓶中，37℃，5％CO2饱和湿度培养。24h后换新鲜培养液培养；细胞生长至80％汇合时进行细胞传代，细胞传代时首先用D-hank’s清洗细胞2次，然后用0.05％胰酶+0.04％EDTA消化回收细胞，1000r/min离心5min沉淀细胞，用新鲜细胞培养液悬浮细胞，调整细胞密度到5×105个细胞/mL，接种细胞到6孔板中，每2天换一次新鲜培养液。2.1.2原代胎儿成纤维细胞的冻存P1代胎儿成纤维细长至80％汇合时，进行细胞冷冻保存。首先，用D-hank’s清洗细胞后，0.05％胰酶+0.04％EDTA消化回收细胞，1000r/min离心5min沉淀细胞，用新鲜细胞培养液悬浮细胞，1000转离心5min沉淀细胞；4℃预冷的细胞冻存液(DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO)悬浮细胞，调整细胞密度度到1×106个细胞/mL，分装细胞到到冻存管中(1mL/管)；将冻存管放入冻存盒中，冻存盒经4℃放置30min，-20℃放置40min，-70℃放置过夜，第二天将冻存管放入液氮中保存。2.1.3山羊胎儿成纤维细胞性别鉴定胎儿的头、四肢和内脏团经蛋白酶K消化提取基因组DNA(提取方法参照《分子克隆》第三版)。根据已公布的山羊性别决定序列(SRY,AccessionNo.D58423.1)设计PCR引物sry1(5’-GAACGAAGACGAAAGGTGGC-3’)(SEQIDNO.16)/sry2(5’-GAACGAAGACGAAAGGTGGC-3’)(SEQIDNO.17)，雄性山羊可以扩增出337bp的条带。取胎儿基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性40s，62℃退火35s，72℃延伸30s，重复33个循环；72℃孵育1min，结束反应。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析扩增条带。2.2打靶载体与TALENS转染胎儿成纤维细胞2.2.1打靶载体与TALENS的准备基因打靶载体BLTF-7-82经ApaLⅠ酶切，线性化打靶载体。TALENS与基因打靶载体经试剂盒纯化回收所需片段(QIAEXGelExtrationKit,QIAGEN)，操作按试剂盒说明书进行。2.2.2胎儿成纤维细胞的转染P2代胎儿成纤维细长至80％汇合时，转染打靶载体。0.05％胰酶+0.04％EDTA消化回收细胞，D-hank’s清洗细胞2次，离心后用低渗电转染液(HypoosmolarBuffer,Eppendorf)清洗细胞并细胞计数；用低渗电转染液悬浮细胞至细胞密度至3×106个细胞/mL，分别加入纯化的线性化的打靶载体BLTF-7-82片段和TALEN-L/R质粒，使其每种载体基因DNA终浓度为20μg/mL，将混合基因的细胞悬液加入转染杯中(electroporationcuvette,2mm)；于Multiporator(Eppendorf)中进行电转染。条件如下：电击后，细胞悬浮液在转染杯中室温条件下静置6min；将细胞悬浮液用DMEM/F12+15％FBS培养液稀释到5×103个细胞/mL，每孔200μL接种到48孔细胞培养板中；置CO2培养箱，37℃、5％CO2、饱和湿度下静置培养。2.2.3转染细胞的筛选胎儿成纤维细胞转染后36h，换正负筛选培养液(DMEM/F12+10％FBS+800μg/mLG418+10μg/mLGCV)进行正负筛选；筛选7-10天左右后换DMEM/F12+10％FBS+400μg/mLG418+5μg/mLGCV维持筛选，生长状态良好的细胞株，经24、12、6孔细胞培养板逐级扩大培养；待细胞在6孔板中生长汇合时，一半细胞冻存(冻存方法同上)，另一半细胞继续扩大培养用于提取基因组DNA用于同源重组检测。2.3细胞株PCR检测待抗性细胞株长满6孔板2个孔时，收集细胞，细胞经蛋白酶K消化后提取细胞基因组(细胞基因组DNA提取方法参照《分子克隆》第三版)。提取的抗性细胞株基因组DNA经3步进行同源重组鉴定。2.3.1基因整合检测筛选获得的单克隆细胞株基因组DNA，用PCR引物cmv-1/cmv-2对人乳铁蛋白基因进行整合检测(表1)，PCR扩增区域为CMV和hLFcDNA接合区，产物大小775bp。取细胞基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸50s，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。PCR产物经测序验证序列的正确性。2.3.2同源重组检测筛选获得的单克隆细胞株基因组DNA，用引物5farcmv-1/l5farcmv-2对阳性细胞株进行检测(表5)；PCR扩增区域为BLG5’基因外侧到CMV基因序列，产物大小1703bp(见图4,6)，如能扩增出该片段则说明获得的细胞为定点整合BLG基因的阳性细胞。取细胞基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸2min，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带，PCR产物经测序验证序列的正确性。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。PCR产物经测序验证序列的正确性。表5.基因检测用PCR引物2.4体细胞核移植制作基因打靶山羊胎儿2.4.1供核细胞准备BLTF-7-82打靶细胞作核移植供体细胞，DMEM/F12+0.5％FBS饥饿培养72h，核移植半小时前，0.25％胰酶消化收集细胞，适量M2悬浮细胞使细胞密度为1×106个细胞/mL；细胞悬液放入指形管中，37℃孵育待用。2.4.2体细胞核移植及胚胎融合、激活受核卵母细胞来自超排的白山羊，注射LHRH-A3之后28h，通过外科手术方法从供体母山羊输卵管中回收；回收的卵母细胞含1mg/mL透明质酸酶(hyaluronidase)的M2中消化去除颗粒细胞，去除颗粒细胞的卵母细胞在M2培养液中洗涤6次，移入M16+10％FBS，38℃，5％CO2中孵育待用。在去核前，用M2+10％FBS+7.5μg/mLcytochalasinB+2mg/mLHoechst33342处理30min，处理完成后用M2培养液清洗卵母细胞6～8次，20～30枚卵母细胞为一组与供核细胞一起移至载玻片上的M2液滴中进行核移植；在荧光倒置显微镜下，用去核针(DM:30μm)去除卵母细胞中的MⅡ期细胞核和极体，将胎儿成纤维细胞放置到透明带下的卵间隙中，并使其紧贴卵母细胞细胞膜。一组细胞核移植完成后，在M16培养液中简单洗涤核移植的卵母细胞，并移入M16中短暂培养，等待胚胎融合。重构胚在M16中孵育30min孵育后，进行电融合。首先重构胚在融合液(0.3molmannitol,0.1mmolMgSO4,0.05mmolCaCl2,0.5mmolHEPESand3mg/mLBSA)中简短平衡后，在电融合仪(KeFa,InstituteofDevelopmentalBiology,Beijing,China)，2个直流脉冲(1.7kV/cm，40ms)进行溶合。融合处理后的卵放回M16培养液中孵育，30min后检查融合，未融合卵再进行一次融合。融合的重构胚在M16培养液中孵育5h后进行重构胚激活。将重构胚放入M16+7.5μg/mLcytochalasinB+5mmolionomycin，38℃5min；用M16+7.5mg/mLcytochalasinB+2mmolN-6dimethylaminopurine洗涤之后，放入M16+7.5mg/mLcytochalasinB+2mmolN-6dimethylaminopurine中培养5h；最后将激活卵移入正常M16中培养直至胚胎移植。2.4.3胚胎移植及妊娠检查在重构胚激活后10～12h移植到同期发情的受体山羊的输卵管中，每侧输卵管移植6～8枚胚胎。在胚胎移植后35天对受体山羊进行B超检查妊娠情况。2.4.4克隆胎儿及胎儿成纤维细胞培养克隆胎儿基因组DNA用于同源重组检测；同时培养胎儿成纤维细胞(培养方法同第三部分)，细胞经扩大培养后，在P2代冻存细胞，保持于液氮中。2.4.5克隆胎儿PCR同源重组检测2.4.5.1PCR基因整合检测克隆胎儿头、四肢和内脏团用组织裂解液裂解后提取基因组DNA(方法参照《分子克隆》第三版)。克隆胎儿基因组DNA用PCR引物Pcmv-laa/Pcmv-lab对hα-LA基因进行整合检测，PCR扩增区域为CMV和hLF接合区，产物大小600bp。克隆胎儿基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸50s，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。2.4.5.2PCR打靶整合检测克隆胎儿基因组DNA，用PCR引物5farcmv-1/5farcmv-2对胎儿基因打靶时间进行检测，引物扩增区域为5’调控序列到CMV基因组序列，产物大小1703bp。取细胞基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸50s，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。2.5再克隆制作克隆山羊2.5.1供核细胞的处理PCR检测为打靶阳性克隆胎儿的成纤维细胞用作供核细胞，进行第二轮体细胞核移植。冻存的克隆胎儿成纤维细胞复苏后，生长至80％汇合时细胞进行血清饥饿(DMEM/F12+0.5％FBS)培养72h，在细胞核移植半小时前，0.25％胰酶消化收集细胞，M2悬浮细胞调整细胞密度至1×106个细胞/mL；细胞悬液放入指形管中，37℃孵育待核移植时使用。2.5.2细胞核移植与胚胎移植第二轮细胞核移植、重构胚融合、激活和受体胚胎移植方法同上。胚胎移植后，分别在30、60天B超诊断受体妊娠情况。2.5.3出生克隆山羊同源重组检测2.5.3.1PCR基因整合检测克隆山羊脐带用蛋白酶K消化后提取基因组DNA(方法参照《分子克隆》第三版)。克隆山羊基因组DNA用PCR引物cmv-1/cmv-2对CMV和LTF基因进行整合检测，PCR扩增区域为CMV和LTF接合区，产物大小775bp。克隆胎儿基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸50s，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。2.5.3.2PCR打靶检测克隆胎儿基因组DNA，用PCR引物5farcmv-1/l5farcmv-2对胎儿基因打靶时间进行检测，引物扩增区域为5’调控序列到CMV基因组序列，产物大小1703bp。取细胞基因组DNA按下列体系进行PCR检测：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火45s，72℃延伸2min，重复33个循环；72℃孵育10min，结束反应。PCR产物经1％凝胶电泳分析扩增条带。2.5.3.3单克隆阳性细胞株的CMV和LTF的整合检测转染BLTF-7-82片段和TALEN-L/R质粒的抗性细胞株，用引物cmv-1/cmv-2对人乳铁蛋白和CMV基因进行整合检测PCR产物大小为775bp，整合的细胞株为83株其他未扩增获得目标扩增片段的细胞株，全部为阴性细胞株(见图10)。2.5.3.4单克隆阳性细胞株的定点整合检测确定整合人乳铁蛋白cDNA基因和CMV基因的单克隆细胞株基因组，用引物5farcmv-1/5farcmv-2对其是否在BLG基因位点定点插入hLFcDNA基因进行整合检测，PCR产物大小为1703bp，PCR产物分析(见图11)与序列比对(见图12)确定4株细胞为在BLG基因位点定点整合hLFcDNA基因的阳性克隆细胞株，其余全部细胞株为阴性。