技术领域：本发明涉及基因编辑技术领域，具体属于一种LmCas9基因与载体及其构建方法，以及LmCas9基因及载体在昆虫基因编辑中的应用。
背景技术：
：基因组编辑(Genomeediting)是近年来发展最快的分子生物学技术之一，它的出现和发展为基因组水平的功能研究提供了可能。采用基因组定点编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9)可以在基因组特定位置上造成双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)，进而通过控制DNA修复途径，实现对基因组的定点修饰。CRISPR/Cas9系统是新崛起的RNA介导的基因组编辑技术，打靶效率高，易于操作，不仅在哺乳动物和线虫等模式生物基因功能研究中广泛应用，也在果蝇、家蚕等昆虫中成功应用。CRISPR全称为成簇规律间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)。Cas9蛋白含有RuvC-like和HNH结构域，能够分别切割靶序列的两条链。由CRISPR转录后并经过剪切获得不同的crRNAs，而crRNA则与另外一种反式作用tracrRNA通过局部碱基配对形成嵌合体导向RNA，进而利用crRNA5’端的导向序列与靶位点序列的碱基互补配对介导Cas9蛋白对靶基因的识别和切割。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9基因编辑系统的重要组成部分，Cas9蛋白活性的高低直接影响编辑效率。由于Cas9基因来源于细菌DNA，目前使用较为广泛的人源化的Cas9，但是由于密码子使用的偏好性，同一DNA序列在不同的物种所表达的蛋白含量差异巨大。为了获得高效地可用于飞蝗的基因编辑工具，本申请通过生物信息学方法设计和合成飞蝗来源的LmCas9，构建其用于基因编辑的pAc-sgRNA-LmCas9载体和基因编辑操作与检测技术。以飞蝗LmCht5-1位点为例，通过构建其靶位点特异性的pAc-Cht5-1sgRNA-LmCas9载体，注射飞蝗受精卵并对其基因组进行编辑，验证飞蝗个体水平的基因编辑系统，并证明了LmCas9的有效性和高效性。该LmCas9基因可用于在飞蝗细胞水平和活体水平对其进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑，用于基因功能等研究。该LmCas9基因的合成与应用为昆虫基因功能研究提供工具和技术平台。
技术实现要素：
：本发明的目的在于提供一种用于昆虫基因编辑的LmCas9基因及载体的合成与应用。本发明提供的技术方案：一种LmCas9基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。一种pUC57-LmCas9载体，其含有LmCas9基因。一种pUC57-LmCas9载体的构建方法，包括如下步骤：利用人源化的huCas9序列作为参照，利用飞蝗种属的密码子偏好性，设计LmCas9序列，使得CAI＝0.89，FOP＝68，将LmCas9的理论密码子使用率优化至最佳。一种昆虫基因编辑载体pAc-sgRNA-LmCas9，含有LmCas9基因和导向sgRNA。一种昆虫基因编辑载体pAc-sgRNA-LmCas9的构建方法，包括如下步骤：利用酶切方法将原载体pAc-sgRNA-huCas9中的huCas9切除，同时用同样的内切酶切割pUC57-LmCas9，然后回收原载体的骨架和LmCas9，连接后构建pAc-sgRNA-LmCas9。载体pAc-sgRNA-LmCas9在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用。一种昆虫基因编辑的方法，包括如下步骤：将载体pAc-sgRNA-LmCas9中的sgRNA替换成为任意基因X的靶位点序列XsgRNA，获得pAc-XsgRNA-LmCas9载体，利用转染试剂转染昆虫细胞系或者注射昆虫受精卵，通过酶切或者测序检测来确定候选基因是否被基因编辑。以上所述的昆虫为飞蝗。本发明根据飞蝗密码子优化合成LmCas9基因，进一步构建的pAc-sgRNA-LmCas9载体，并用于基因编辑。以飞蝗LmCht5-1位点为例，通过构建其靶位点特异性的pAc-Cht5-1sgRNA-LmCas9载体，注射飞蝗受精卵并对其基因组进行编辑，建立了在飞蝗个体水平的基因编辑系统，证明了LmCas9的有效性和高效性。本发明不仅为飞蝗个体水平的基因编辑提供了工具，也为其他物种的基因编辑工作提供了技术方法。附图说明：图1：LmCas9结构图图2：pUC57-LmCas9酶切验证图，图中：M.DNAMarker；1.pUC57-LmCas9载体XhoI和EcoRI双酶切结果；2.pUC57-LmCas9原载体图3：pAc-sgRNA-LmCas9载体结构图图4：T7核酸内切酶切割图，图中：M.DL500C.wt1-5.为注射后收集虫卵的不同虫卵样品，6为发育出壳的飞蝗幼虫样品。具体实施方式：实施例1：飞蝗LmCas9的合成、靶基因Cht5-1基因编辑载体构建及飞蝗活体基因编辑验证一、飞蝗LmCas9的合成1.利用密码子偏好性设计和合成LmCas9以人源的huCas9为参照，按照网站http://www.kazusa.or.jp飞蝗密码子偏好性表，按照其基因结构(图1)设计其DNA序列，使其包含ATG起始位点，3个NLS核定位信号，1个HA标签蛋白。利用软件对设计的DNA序列分析发现，其CAI＝0.89，FOP＝68，已将LmCas9的理论密码子使用率优化至最佳，在其两端分别添加EcoRI和XhoI酶切位点，以便后续克隆时需要。然后，委托武汉隶科生物科技有限公司对此4974bp长度的DNA序列，进行人工合成。合成后将其克隆在pUC-57载体中，利用EcoRI和XhoI酶切，可得到约5000bp的目的条带和4000bp的载体骨架(图2)，说明LmCas9的携带载体构建成功。送华大公司测序后发现，合成的LmCas9序列与原设计相似度为100％，表示LmCas9合成成功。2.基因编辑载体pAc-sgRNA-LmCas9构建及结构预测(1)LmCas9片段和pAc-sgRNA骨架获得表1片段及骨架载体的双酶切体系在0.2mLEP管中分别进行pUC57-LmCas9和pAc-sgRNA-huCas9双酶切反应，反应体系参照EcoRI、XhoI说明书(NEB)进行，见表1。37℃水浴2h，分别取50μL上述样品与Loadingbuffer按5：1比例混匀后点样至1％琼脂糖凝胶上，电压调至120V电泳40min左右，检测目的条带并回收。(2)目的基因LmCas9片段和pAc-sgRNA的连接将含目的基因LmCas9的胶回收产物连接到载体骨架pAc-sgRNA上，在离心管中建立如下反应体系(表2)：表2目的片段LmCas9和骨架载体pAc-sgRNA的连接体系轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于16℃过夜连接。(3)转化及检测取5μL上述连接产物转化在100μLT1PhageResistant感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上30min；42℃水浴热激60s，然后快速将管置于冰上，冰浴5min；加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养。挑取白色单菌落置于4mLLB液体培养基(含有0.1％氨苄)37℃200rpm振荡培养8h；采用Omega公司质粒提取试剂盒提取对应的重组质粒，质粒图谱(见图3)，操作严格按照说明书进行，后采用测序方法鉴定所得载体为含有LmCas9的载体而非HuCas9。二、飞蝗靶基因Cht5-1基因编辑载体构建1.LmCht5-1靶位点预测飞蝗几丁质酶5LmCht5-1的cDNA全长为1650bp，其中5’和3’非编码序列分别为670bp和188bp，开放阅读框为1515bp，编码505个氨基酸。LmCht5-1含有1个信号肽，1个几丁质酶催化区和1个LmCht5-1有几丁质结合域。利用http://crispr.mit.edu/网站提供的分析软件，对LmCht5-1催化域和结合域在线筛选sgRNA靶位点，结合软件分析的脱靶位点，选择评分高、脱靶位点少且PAM前六个碱基高GC的序列(表3)最后选取48349位点为靶位点，通过武汉昆泰瑞公司合成(表4)。表3LmCht5-1靶标序列表4sgRNA引物序列2.sgRNA合成与pAc-sgRNA-LmCas9载体酶切将表4中引物序列成对排布后，按照表5体系混合，然后在PCR仪中进行98℃15min，自然冷却，使得引物互相结合，最后形成黏性末端。同时，按照表6体系对pAc-sgRNA-LmCas9进行酶切，反应条件为50℃2h，并利用1％琼脂糖凝胶进行分离和回收。表5sgRNA拟合体系表6pAc-sgRNA-LmCas9酶切体系3.构建靶位点特异性pAc-sgRNA-LmCas9载体将含有黏性末端的拟合产物与酶切的pAc-sgRNA-LmCas9载体按表7体系进行连接，条件为16℃过夜。取5μL上述连接产物转化在100μLT1PhageResistant感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上30min；42℃水浴热激60s，然后快速将管置于冰上，冰浴5min；加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养。挑取白色单菌落置于4mLLB液体培养基(含有0.1％氨苄)37℃200rpm振荡培养8h；采用Omega公司质粒提取试剂盒提取对应的重组质粒，通过测序反应保证插入的sgRNA序列为靶标的sgRNA序列。构建好的载体为pAc-Cht5-1sgNRA-LmCas9。表7sgRNA和骨架载体pAc-sgRNA-LmCas9的连接体系三、飞蝗活体基因编辑验证1.显微注射将pAc-Cht5-1sgNRA-LmCas9浓度调整为100ng/μL，溶液为HBSS。同时收集飞蝗产卵1h内的受精卵作为研究对象，先进行清洗和剥离，然后0.01％次氯酸钠消毒5min。利用Nano-injectII仪器将混合质粒50.6nL注射入飞蝗受精卵腹面距离头部1/3的位置。最后在30℃培养箱中进行培养，在培养7d后，收集发育的卵。2.基因组DNA提取将收集的卵切成小块后置于1.5mL离心管中，加入180μLBufferGTL。加入20μLProteinaseK，涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。加入200μLBufferGL，涡旋震荡充分混匀，70℃水浴10min。短暂离心后加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心，将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube)的吸附柱(SpinColumnDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500μLBufferGW1，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500μLBufferGW2，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μL灭菌水，室温放置2-5min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。3.候选基因扩增及T7核酸酶酶切根据飞蝗Cht5-1的基因组序列，在48349位置的5‘和3’端分别设计上下游引物，Cht5-148349JF：GCTTTCGTGCTGTACGTGTCC和Cht5-148349JR：TGAGCAGTGTAGATCCTGAGG，其以飞蝗基因组为模板的扩增产物为469bp。在离心管中建立50μL的反应体系，如下：10*Taqbuffer，5μL；2.5mMdNTPs，4μL；10μM的Cht5-148349JF和Cht5-148349JR各1μL；模板(飞蝗基因组)，1μL；Taq酶:pfu酶1:1，0.5μL；ddH2O，37.5μL。将上述体系混匀，瞬时离心。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。取50μL上述PCR产物与Loadingbuffer按5：1比例混匀后点样至1％琼脂糖凝胶上，电压调至120V电泳40min左右，紫外下观察目的条带并进行胶回收。将胶回收的产物利用T7核酸内切酶进行酶切，酶切体系如下：表8T7核酸内切酶酶切体系反应在37℃进行2h，然后2％琼脂糖凝胶上，电压调至120V电泳60min左右，紫外下观察目的条带(图4)，针对于48349位点，1号样和2号样均检测到的条带为469bp，311bp和158bp，说明CRISPR/Cas9系统在飞蝗活体中操作成功。