技术领域本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其检测试剂盒。
背景技术：
BRAF基因是Ras的下游基因，属于RAF基因家族，与RAS基因一起调控RAS–RAF–MEK–ERK–MAP激酶通路，以介导细胞对生长信号的反应，而该通路在大部分肿瘤里面都会通过RAS和RAF家族成员被激活(Davidetal.，2006)。BRAF蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在肿瘤中常常发生点突变，突变后的BRAF蛋白激酶活性增高，引起细胞异常增殖分化。在约66％的恶性黑色素细胞瘤中发现BRAF的体细胞错义突变，在其它种类的肿瘤如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突变(Helenetal.,2002)。所有的突变都集中在BRAF蛋白的激酶结构域，其中约80％的BRAF突变位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的第600位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸(BRAFV600E)(LiangWang，etal.，2013)。本发明是基于荧光定量PCR平台开发出的检测方法，还结合了扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)。ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，设计2条ARMS上游引物，共用1条下游引物构成PCR反应体系。当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测野生型与突变型等位基因的目的。
技术实现要素：
为了实现对人BRAF基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及检测试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、步骤简单、灵敏度高、特异性强的BRAF基因突变检测体系。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，包括以下步骤：(1)在BRAFV600EPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成BRAFV600E反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：所述BRAFV600EPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的BRAFV600E上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的BRAFV600E下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的BRAFV600E探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；(2)结果判断：根据人类基因组DNA在BRAFV600E反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，所述样品可以是利用各种肿瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包括：间变性少突胶质瘤、非小细胞肺癌肿瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌肿瘤、乳腺癌前体组织和垂体瘤组织及少量正常脑组织样本。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中BRAFV600E反应体系为：在16-20μlBRAFV600EPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为3-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlBRAFV600EPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述BRAFV600EPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述BRAFV600E上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述BRAFV600E下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述BRAFV600E探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，15个循环；95℃15s，60℃45s，25个循环，在60℃45s阶段收集荧光。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中结果判断步骤中Ct值进行分析为：当BRAFV600E反应体系中的内参检测信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线8≤Ct≤12时，可以判断待测样本BRAFV600E突变的阴性和阳性：当BRAFV600E反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct≤16时为BRAFV600E突变强阳性；当BRAFV600E反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线16＜Ct≤20时为BRAFV600E突变弱阳性；当BRAFV600E反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct>20时为BRAFV600E突变阴性。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中BRAFV600EPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为BRAFV600E突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有BRAFV600E突变的阳性质粒溶解在没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与BRAFV600E突变率10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的BRAFV600EPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的弱阳性对照液，形成BRAFV600E反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的BRAFV600EPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的空白对照液，形成V600E反应体系的空白对照反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。一种检测人BRAF基因突变的试剂盒，包括BRAFV600EPCR反应混合液，其中所述BRAFV600EPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的BRAFV600E上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的BRAFV600E下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的BRAFV600E探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。一种检测人BRAF基因突变的试剂盒，其中所述BRAFV600EPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述BRAFV600E上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述BRAFV600E下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述BRAFV600E探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。一种检测人BRAF基因突变的试剂盒，其中所述BRAFV600E反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。一种检测人BRAF基因突变的试剂盒，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液；其中所述弱阳性对照液为BRAFV600E突变率10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有BRAFV600E突变的阳性质粒溶解在没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有BRAFV600E突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与BRAFV600E突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。本发明中所述BRAFV600E上游引物序列为SEQIDNo.1：gtaaaaataggtgattttggtctagctacagA，其中gtaaaaataggtgattttggtctagctacagA中大写的A为腺嘌呤对应的LNA核苷酸(锁核酸)；所述BRAFV600E下游引物序列为SEQIDNo.2：GTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAG，其中大写的A、T、C、G分别为腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤对应的LNA核苷酸(锁核酸)；所述BRAFV600E探针序列SEQIDNo.3：aacTcaGcaGcaTctcagg，其中大写的T和G分别为胸腺嘧啶、鸟嘌呤对应的LNA核苷酸(锁核酸)；BRAFV600E探针序列探针序列5’端连接有荧光报告基团，优选为FAM，BRAFV600E探针序列3’端连接有淬灭基团，优选为BHQ1；所述内参上游引物序列为SEQIDNo.4：taggcactgactctctc；所述内参下游引物序列为SEQIDNo.5：catcaggagtggacag；所述内参探针序列SEQIDNo.6：acccttggacccagaggttctttg；内参探针序列5’端连接有荧光报告基团，该荧光报告基团与BRAFV600E探针序列所连接的不同，优选为ROX，内参探针序列3’端连接有淬灭基团，该淬灭基团与BRAFV600E探针序列所连接的不同，优选为BHQ2。本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs和稳定剂。如：thermoUniversalMasterMixII，KAPAPROBEFASTMasterMix(2×)，TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、检测速度快，定量准确：本申请检测方法一步加样，一次性闭管检测，无需产物后处理，不需要测序验证结果，短时间(1-2小时)内即可完成检测，显著缩短了检测时间(直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周)，定量准确；2、灵敏度高：本发明在BRAFV600E探针序列中设计了LNA核苷酸，本发明中LNA核苷酸是对脱氧核糖核苷酸的戊糖进行了改变，其将糖限制为在A-DNA中见到的N-类型的构象，这种限制是通过1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-别呋喃糖中的2′-氧，4′-碳亚甲基键来实现，即它包含了2'-氧-4'碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和稳定性；含有LNA核苷酸的Taqman探针的灵敏度更高：本发明中的Taqman探针法检测V600E突变时均可以检测出浓度为2ng/μL、突变率为1％甚至含量更低的突变样本，优于直接测序法20％的灵敏度；将V600E突变序列克隆到T载体上，转化大肠杆菌，随后将该突变质粒DNA连续10倍梯度稀释后测得Taqman探针法检测下限约为5～10拷贝；3、本申请还在试剂盒中引入了dUTP-UNG防污染体系，能有效的防止PCR产物的气溶胶污染；附图说明图1是本发明BRAFV600E突变比例50％和突变比例1％的样品的检测结果。具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例1试剂盒的组成本发明试剂盒是用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括：BRAFV600EPCR反应混合液、弱阳性对照液和空白对照液，其中：(1)BRAFV600EPCR反应混合液是在反应预混液TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)中加入如下浓度的各种物质：BRAFV600E上游引物3μMBRAFV600E下游引物3μMBRAFV600E探针3μM内参上游引物2μM内参下游引物2μM内参探针2μMdUTP0.2μM尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)0.01U/μl所述BRAFV600E上游引物序列为：gtaaaaataggtgattttggtctagctacagA(大写的A为腺嘌呤对应的LNA核苷酸)；所述BRAFV600E下游引物序列为：GTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAG(大写的A、T、C、G分别为腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤对应的LNA核苷酸)；所述BRAFV600E探针序列：FAM-aacTcaGcaGcaTctcagg-BHQ1(大写的T和G分别为胸腺嘧啶、鸟嘌呤对应的LNA核苷酸)；所述内参上游引物序列为：taggcactgactctctc；所述内参下游引物序列为：catcaggagtggacag；所述内参探针序列：ROX-acccttggacccagaggttctttg-BHQ2。(2)弱阳性对照液是浓度是按照如下方法制备的：含有V600E突变的阳性质粒溶解在没有V600E突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有V600E突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为10ng/μl；所得水溶液与V600E突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。(3)空白对照液为TE缓冲液。检测方法：(1)临床患者样本基因组DNA提取：利用实体瘤(恶性黑色素细胞瘤)术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取；(2)稀释基因组DNA：将所提基因组DNA溶于Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)中，经NANODROP2000检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)调整基因组DNA浓度到10ng/μL作为PCR模板；(3)加样进行PCR反应扩增：取2μL、10ng/μL的PCR模板加入18μlBRAFV600EPCR反应混合液中获得20μL的反应体系；每次检测均有阳性质控及空白对照，剩余DNA溶液分装后贮存于-20℃；BRAFV600E反应体系及其阳性质控反应体系、空白对照反应体系如下表所列：(4)实时荧光定量PCR仪器检测通道的选择：选择的荧光为FAM和ROX；(5)PCR反应条件为：(6)检测结果分析：本发明中Ct值是指反应体系中的荧光信号到达设定的基线值时所经历的循环数，扩增曲线基线值设定为相对荧光单位120，并在此设定条件下确定Ct值；ROX信号检测内参扩增情况，FAM信号检测PCR模板、阳性质控和空白对照的扩增情况；当BRAFV600E反应体系中的ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线8≤Ct≤12时，可以判断待测样本BRAFV600E突变的阴性和阳性：当BRAFV600E反应体系中的FAM信号Ct≤16时为BRAFV600E突变强阳性；当BRAFV600E反应体系中的FAM信号16＜Ct≤20时为BRAFV600E突变弱阳性；当BRAFV600E反应体系中的FAM信号Ct>20时为BRAFV600E突变阴性。BRAFV600E反应体系中内参ROX信号的作用：当BRAFV600E反应体系中的内参扩增曲线的Ct＞12表示加入的基因组DNA模板有PCR抑制物或浓度不足，需要重新提取基因组DNA或增加DNA用量后重复实验；内参扩增曲线的Ct＜8，提示加入的样品DNA过量，建议稀释DNA后重新进行实验；空白对照反应体系的作用：空白对照反应体系中的FAM信号应不出现“S”扩增曲线或Ct≥24，若FAM信号的Ct＜24，则此实验结果视为无效，同时建议重复试验；弱阳性反应体系的作用：弱阳性反应用于指示PCR反应体系是否有效及反应程序是否正确设置。弱阳性对照中，ROX扩增曲线应8≤Ct≤12，FAM扩增曲线应16＜Ct≤20。如果ROX和FAM扩增曲线不在此范围，则提示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。灵敏度分析：取定量后浓度为10ng/μL的V600E1％突变样本基因组DNA进行稀释，使其浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL，按实施例1中的检测方法进行检测，每个V600E反应体系设置5个平行，结果表明，本发明灵敏度可以检测到2ng/μL的V600E1％突变样本，如图1所示。以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。