一种利用乳糖培养基高效表达家蚕重组抗菌肽的方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种利用乳糖培养基高效表达家蚕抗菌肽的方法，所述抗菌肽包括BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin。
背景技术：
：抗菌肽存在于大量昆虫细胞中，在正常组织中含量很低，分离纯化难度大，化学合成的成本十分昂贵。因此，通过基因工程技术获得的抗菌肽成为首选方法。现有技术通常采用异丙基-β-D-巯基半乳糖苷（IPTG）诱导表达外源重组蛋白和多肽，但由于IPTG具有潜在的毒性，对菌体生长有一定的抑制作用，且价格昂贵，而且表达的重组蛋白和多肽含量低，目前国内外已有研究用乳糖代替IPTG作为乳糖启动子的诱导剂诱导重组蛋白的表达，但在家蚕抗菌肽的表达方面未见报道，目前，在家蚕中已有40余种抗菌肽基因被发现，其中BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin具有极强广谱的抗菌性，能够杀灭大多数的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌及真菌，预示这些家蚕抗菌肽具有广泛的应用前景。现有技术应用IPTG作为诱导剂诱导的重组蛋白表达产率一般不超过30%，原因在于IPTG具有潜在毒性，对细菌的生长具有一定的抑制作用，而且该方法中细菌繁殖效率低，从而造成重组蛋白表达产率低。目前，人们还没有研发出如何提高IPTG作为诱导剂诱导的重组蛋白表达产率的技术，仅仅通过调整IPTG浓度、诱导时间、诱导温度来提高重组蛋白表达产率，但效果不佳。技术实现要素：本发明的目的就是针对上述问题提出一种利用乳糖培养基高效表达家蚕重组抗菌肽的方法，该方法能够明显提升BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin重组蛋白表达产率，为家蚕抗菌肽的纯化、活性鉴定及在食品、化妆品等领域的应用提供新的技术选择。本发明的上述目的通过如下手段实现：一种利用乳糖培养基高效表达家蚕抗菌肽的方法，其特在于：（1）家蚕BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆以五龄七天家蚕中肠组织总RNA为模板，分别针对三种抗菌肽基因设计三对特异性引物，引物序列如下表一所示：表一合成抗菌肽基因的引物序列基因名称上游引物（5'→3'）下游引物（5'→3'）产物大小（bp）BmcecropinB6CATGCCATGGTTAGGTGGAAGATCTTCAAGGACCCTCGAGTCAGATAGCTTTAGCCGAACCAAGG192BmcecropinDCAGTCCATGGGCAACTTCTTCAAGGATCCCGCTCGAGTCATTGTCCGAGAGCTTTTGCTTTTG114BmmoricinCATGCCATGGCAAAAATACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTACCGCTCGAGTCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCAAGAAATTGAAAACATC201上游引物下划线处为NcoⅠ限制性内切酶位点，下游引物下划线处为XhoⅠ限制性内切酶位点，利用RT-PCR技术扩增BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因，PCR反应条件为：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用胶回收试剂盒纯化PCR产物；（2）pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表达载体的构建采用NcoⅠ/XhoⅠ限制性核酸内切酶分别双酶切BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因和pET32a表达载体，得到BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段和pET32a载体大片段，利用T4DNA连接酶分别连接双酶切后的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin和pET32a，构建pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表达载体，转化BL21感受态细胞，在含100μg/ml氨苄青霉素的固体LB平板上挑取单菌落，置含氨苄青霉素的的液体LB培养液中37℃摇床培养过夜，将菌液PCR鉴定为阳性的三种菌液送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；（3）抗菌肽BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin的表达将测序正确的三种阳性菌液分别分为两份，一份按1%的接种量接种到10ml含有100μg/mlAmp的乳糖培养基，其组成为：50mmol/LNa2HPO4,50mmol/LKH2PO4,50mmol/LNH4Cl,5mmol/LNa2SO4,2mmol/LMgSO4,0.2×金属离子,0.50%甘油,0.06%葡萄糖,0.20%乳糖，将10ml将含菌液的乳糖培养基置于大容量，空气密度大的250ml容量三角瓶中，于37℃、220rpm培养12,14,16,18,20,22h，各收集1ml菌液；另一份10ml在37℃200rpm摇床培养至OD600=0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达重组蛋白，分别收集诱导0h-6h的菌液1ml，将收集的菌液10000rpm离心1min，弃上清，沉淀用5×蛋白上样缓冲液和1×PBS悬浮，总体积100μL，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况，分析比较乳糖培养基诱导的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重组蛋白与IPTG诱导的重组蛋白表达产率差异。本发明采用大容量三角瓶和乳糖培养基替代IPTG进行BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的诱导表达，该培养基中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，在氧气充足的情况下，葡萄糖耗尽后乳糖才被利用，目的蛋白开始表达。采用乳糖培养基诱导表达的最终菌体密度大，蛋白产量高，而且没有毒性，适于重组蛋白的高效表达。该系统减少了菌液浓度测定和IPTG浓度对细胞毒性的影响，凝胶成像系统分析显示，应用IPTG作为诱导剂诱导的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽表达产率分别为22%，24%，23%，而应用乳糖培养基诱导的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽表达产率高达41%，38%和34%，表达产率分别提高了19%，14%，11%，为BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽的高效表达和应用奠定了基础。本发明应用乳糖培养基代替IPTG，一方面减少了IPTG对细菌的毒性，另一方面采用大容量瓶和乳糖培养基来培养细菌，该系统中氧气充分，依据大肠杆菌对培养基中的碳源和能源的利用机制建立，即在自乳糖培养基中加入含有成比例的葡萄糖和乳糖时，在氧气供应充分的条件下，大肠杆菌会优先选择葡萄糖供应能量，待葡萄糖消耗完成之后，就开始摄取乳糖，乳糖经β-半乳糖苷酶作用生产中间代谢产物异乳糖，异乳糖就相当于IPTG，从而启动T7RNA聚合酶的表达，既而启动目的基因的表达，该方法减少了IPTG的毒性和不稳定性，使目的基因能高效表达，表达产率远远高于IPTG诱导水平。附图说明图1是pET32a原核表达载体的图谱图，pET32a大小5900bp，含有NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点。图2是本发明BmcecropinB6抗菌肽在大肠杆菌细胞中重组表达的SDS-PAGE图谱图。图3是本发明BmcecropinD抗菌肽在大肠杆菌细胞中重组表达的SDS-PAGE图谱图。图4是本发明Bmmoricin抗菌肽在大肠杆菌细胞中重组表达的SDS-PAGE图谱图。图2中，SDS-PAGE检测家蚕重组抗菌肽BmcecropinB6表达产率M:Proteinmarker1:含pET32a空质粒的菌液2-8:IPTG分别诱导0,1,2,3,4,5,6h重组抗菌肽BmcecropinB6的表达9-14:乳糖培养基诱导12,14,16,18,20,22h重组抗菌肽BmcecropinB6的表达。图3中，SDS-PAGE检测家蚕重组抗菌肽BmcecropinD表达产率，M:Proteinmarker1:含pET32a空质粒的菌液2-8:IPTG分别诱导0,1,2,3,4,5,6h重组抗菌肽BmcecropinD的表达9-14:乳糖培养基诱导12,14,16,18,20,22h重组抗菌肽BmcecropinD的表达。图4中，SDS-PAGE检测家蚕重组抗菌肽Bmmoricin表达产率M:Proteinmarker1:含pET32a空质粒的菌液2-8:IPTG分别诱导0,1,2,3,4,5,6h重组抗菌肽Bmmoricin的表达9-14:乳糖培养基诱导12,14,16,18,20,22h重组抗菌肽Bmmoricin的表达。具体实施方式下面用实例进一步说明本发明实施过程和有益技术效果。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：大肠杆菌表达系统原核表达抗菌肽BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin的方法主要包括：（1）家蚕BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆①取五龄七天家蚕中肠组织约1g，用DEPC水清洗干净，将中肠组织转至处理好的研钵中，加液氮后研磨成粉末，然后按50-100mg组织/mLTRIzolReagent，直至样品与TRIzol混匀，室温放置5min后，加入1/5体积的三氯甲烷。充分震荡混匀，4°C，12,000rpm离心15min。小心将上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，4°C，12,000rpm离心10min。弃上清，用70%乙醇洗涤RNA沉淀，4°C，8,000rpm离心10min。弃上清，室温放置待酒精完全挥发，将晾干后的RNA溶于适当体积的DEPC水。用1%琼脂糖TAE凝胶电泳检测RNA质量，同时用紫外分光光度计检测RNA溶液的浓度和纯度，最后将总RNA提取液样品于-80°C下保存。②cDNA第一链合成反转录体系组成如下：总RNA1ng-1μgOligo（dT）12-18Primer（50μM/L）1μLRNasefreeddH2Oupto6μL上述反应体系在70°C保温10min后迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。在上述离心管中配制下列反转录反应液：上述模板RNA/引物的变性溶液6μL5×M-MLVBuffer2μLdNTP(各10mM/L)0.5μLRNaseInhibitor(40U/μL)0.25μLRNaseM-MLV（RnaseH-）（200U/μL）0.25-1μLRNasefreeddH2Oupto10μL反转录条件为：42°C反应1h，70°C保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液直接用于家蚕抗菌肽基因克隆。③引物根据GenBank上公布的BmcecropinB6（NM_001043566），BmcecropinD（NM_001043368），Bmmoricinm（AB006915）RNA序列，应用PrimerPrimer5.0引物设计软件设计三对特异性引物如表一，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。④PCR反应用合成的特异性引物，以反转录得到的家蚕cDNA第一链为模板，分别扩增出两端含有NcoⅠ和XhoⅠ位点的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricinm基因，以灭菌的双蒸水作为阴性对照。PCR反应体系如下：10×Buffer（含Mg2＋）5μL4×dNTPs（2.5mM）4μLUpstreamprimer（10μM/L）2μLDownstreamprimer（10μM/L）2μLcDNAFirst-strand1μLTaq（0.5u/μL）5μLddH2O31μLTotalVolume50μLPCR反应参数为：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞。用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在60-80伏的电压下进行电泳，25-30分钟后在UVP凝胶成像系统上观察并记录结果。⑤PCR产物纯化用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，具体步骤如下：估算PCR反应产物的体积，转移到一个干净的1.5mLEppendorf管，加入4-5倍体积的NCPBuffer；将样品转移到2mLHiBindminiprepcolum纯化柱上，10,000rpm离心1min，弃掉滤液；加700μLSPWBuffer（已加无水乙醇），10,000rpm离心1min，弃掉滤液；重复上一个步骤；弃废液，将空管用10,000rpm离心1min；将HiBindminiprepcolum纯化柱放到新的1.5mLEppendorf管中，加30-50μL去离子水或TEBuffer，10,000rpm，离心1min进行洗脱。纯化的DNA贮存于-20°C备用。(2)pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表达载体的构建①pET-32a质粒的抽提将含有质粒pET-32a的大肠杆菌BL21菌株分别接种于5mL含Amp（100μg/mL）的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。质粒的抽提采用E.Z.N.A.PlasmidMiniperpsKit，按说明书进行，具体操作步骤如下：在室温下，取1mL菌液于1.5mL离心管，以10,000rpm离心1min；倒去上清液，加250μL溶液Ⅰ/RNaseA，充分悬浮菌体；加250μL溶液Ⅱ，温和地上下颠倒4-6次，室温放置2min，使细菌完全裂解；加350μL溶液Ⅲ，温和地上下颠倒数次，10,000rpm离心10min；小心吸取上清液，加到放在2mL收集管的蓝色HiBind柱上，以10,000rpm离心1min；倒掉液体，加500μLBufferHB，以10,000rpm离心1min；弃掉滤液，加750μL含乙醇的Washbuffer，以10,000rpm离心1min；以含乙醇的Washbuffer重复洗柱子1次；以10,000rpm离心1min，使柱子甩干；将柱子放于1.5mL离心管中，加50-100μL去离子水或TEbuffer（pH8.0），以10,000rpm离心1min洗脱DNA。抽提得到的质粒，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20°C保存备用。②pET-32a质粒和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因的双酶切pET-32a和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因用NcoⅠ和XhoⅠ分别进行双酶切，其反应总体积均为50μL，各组分如下：NcoⅠ(10U/µL)2μLXhoⅠ(10U/µL)2μL10×Buffer5μL0.1%BSA5μL表达载体质粒或目的片段15μLddH2O21μLTotalVolume50μL混匀后，点动离心，置于37°C水浴3h。③pET-32a质粒和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因酶切产物的回收经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的质粒pET-32a和目的基因的酶切产物分别用0.8%和2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳时采用新配制的0.5×TBE电泳缓冲液。电泳结束后，将凝胶放在紫外灯下，用刀片切割出含有目的片段的凝胶，从凝胶中回收纯化pET-32a片段和目的片段，具体操作步骤如下：将切下的凝胶装入离心管，按1mLBindingbuffer/g的比例加入Bindingbuffer，经50°C温育10min后，将溶液转移至放在2mL收集管的蓝色HiBind柱上，10,000rpm离心1min，弃滤液。加入500µLQGbuffer，离心后用750µLPEbuffer洗涤两次。将HiBind柱放入1.5mL离心管中，用EBbuffer溶解，13,000rpm离心2min，收集纯化的目的片段，置于-20°C贮存备用。④BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因和pET32a的连接将酶切回收得到的BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段和已经线性化了的pET32a载体进行连接，连接反应体系如下：酶切后的BmCecropinB6或BmcecropinD或Bmmoricin基因6μL酶切后的pET32a2μLT4连接酶buffer1μLT4ligase1μL总体积10μL混匀，离心数秒后，于16°C连接过夜。连接产物用于转化。⑤连接产物的转化及阳性克隆的鉴定将制备好的10μL连接产物加入到装有200μL大肠杆菌BL21感受态细胞的聚丙烯管中，轻轻旋转混匀内容物，冰上放置30min；另外取一管加入1μL的空载体质粒作为转化对照；将离心管放入预加温至42°C的水浴中，热击90s，期间不要摇动离心管；快速将离心管转移到冰浴中使细胞冷却2min；每管加入1mL的37°C预热LB培养基，37°C摇床上间应温和摇动（<100rpm）60min；取200µL菌液涂布于含有AMP的LB平板上，37°C培养过夜。同时将空载体pET-32a也转化至大肠杆菌BL21。从上述过夜培养的平板中挑取单个的菌落，接种于3mL含有AMP（100μg/mL）的LB液体培养基中，37°C培养过夜，直接以菌液作为模板进行PCR鉴定。采用T7和T7T通用引物和各目的基因的特异引物对菌液进行PCR鉴定。T7和T7T通用引物为：T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’T7T：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCG-3’PCR鉴定的反应体系及反应参数：菌液1µL上游引物（10μM/L）1μL下游引物（10μM/L）1μLdNTPs（2.5mM/L）2µL10×PCRreactionbuffer2µLTaq酶（0.5U/µL）2µLddH2O11µLTotalVolume：20µL将上述反应体系混匀，离心。PCR反应条件为：94°C×5min→（94°C×1min→50-55°C×30s→72°C×1min）×30cycles→72°C×10min→4°C×∞。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统记录结果。经PCR鉴定，插入片断符合预期大小的克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。（3）抗菌肽BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的表达①重组蛋白的IPTG诱导表达37°C培养过夜的分别含有pET-32a-BmCecropinB6，pET-32a-BmcecropinD，pET-32a-Bmmoricin重组质粒的大肠杆菌BL21，按1:100比例接种到含有LB液体培养基（含100μg/mLAmp）中，37°C下250r/min振荡培养至OD600约为0.6-0.8时加入IPTG至其终浓度为1.0mM以诱导目的基因的表达，收集诱导培养0-6h的菌液1mL制样进行SDS-PAGE电泳检测。②重组蛋白的高效表达分别挑取含有pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin重组质粒的单菌落，接种到4ml含有100μg/mlAmp的LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，再按1%的接种量接种到10ml含有100μg/mlAmp的乳糖培养基（50mmol/LNa2HPO4,50mmol/LKH2PO4,50mmol/LNH4Cl,5mmol/LNa2SO4,2mmol/LMgSO4,0.2×金属离子,0.50%甘油,0.06%葡萄糖,0.20%乳糖）中，将该10ml含菌液的乳糖培养基置于250ml三角瓶中，37℃、220rpm培养12,14,16,18,20,22h，收集菌液，分别与IPTG诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳分析，凝胶成像系统比较两种方法诱导的重组蛋白表达产率差异。1.材料：RT-PCR扩增试剂盒购于上海生物工程有限公司，pET32a原核表达载体为Novagen公司产品，图谱见图1。胶回收试剂盒，小量质粒提取试剂盒购自AxyGen公司。2.工作流程：2.1本发明应用乳糖培养基高效表达家蚕重组抗菌肽的方法包括如下部分：(1)家蚕BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆：以五龄七天家蚕（即披露表中所填青松×皓月）中肠组织总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增得到抗菌肽CecropinB6基因。该RT-PCR扩增的具体方法如下：其中，PCR扩增所用的引物设计见表一，上游引物含有NcoⅠ酶切位点，下游引物含有XhoⅠ酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞，然后，利用2.5％琼脂糖凝胶电泳对得到的抗菌肽BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因进行PCR产物分析，并用胶回收试剂盒纯化。(2)pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表达载体的构建：用限制性内切酶NcoⅠ/XhoⅠ酶切BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段，然后分别将BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段克隆入美国Novagen公司的表达载体pET32a，得到pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin重组表达载体。(3)抗菌肽BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的表达：使用乳糖培养基和大容量三角瓶，37℃、220rpm摇床培养12,14,16,18,20,22h，收集菌液，与IPTG诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳分析，比较两者重组蛋白表达产率的差异。结果表明抗菌肽BmCecropinB6核苷酸大小192bp，编码63个氨基酸，氨基酸序列为MNFAKILSFVFALVLALSMTSAAPEPRWKIFKKIEKMGRNIRDGIVKAGPAIEVLGSAKAVGK；BmcecropinD核苷酸大小186bp，编码61个氨基酸，氨基酸序列为MKFSKIFVFVFAIVFATASVSAAPGNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQG；Bmmoricin核苷酸大小201bp，编码66个氨基酸，氨基酸序列为MNILKFFFVFIVAMSLVSCSTAAPAKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKH；载体pET32a为原核表达载体，大小5900bp，含有T7启动子和His-Tag标签，设计扩增抗菌肽BmCecropinB6,BmcecropinD,Bmmoricin基因的特异性引物含NcoI和XhoI限制性内切酶位点。图2,图3，图4中标记为M的是蛋白质标准分子量，1为转化pET32a空质粒的菌液，2-8为IPTG诱导0-6h后BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重组蛋白的表达情况，9-14为乳糖培养基诱导12,14,16,18,20,22h后BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重组蛋白的表达情况，箭头所示的条带即为BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin，其分子量大小为14kDa，13kDa，17kDa，与预测的大小一致。序列表：BmcecropinB6核苷酸序列Atgaatttcgcaaagatcctatccttcgtcttcgctctggtgctggctttgagcatgaccagcgctgctcccgagcctaggtggaagatcttcaagaaaatagagaaaatgggcaggaatattcgtgacggcatcgtcaaagcgggcccagcgatcgaggtccttggttcggctaaagctgtcggaaaatga。BmcecropinD核苷酸序列Atgaaattctcgaaaattttcgttttcgtgttcgctattgttttcgccacggcttcggtctcggcagctcccggcaacttcttcaaggatcttgaaaaaatgggtcagagggttcgagacgccgtcatcagcgcggctccagcagtcgacaccctggcaaaagcaaaagctctcggacaaggatag。Bmmoricin核苷酸序列Atgaatattttaaaatttttctttgtttttattgtggcaatgtctctggtgtcatgtagtacagccgctccagcaaaaatacctatcaaggccattaagactgtaggaaaggcagtcggtaaaggtctaagagccatcaatatcgccagtacagccaacgatgttttcaatttcttgaaaccgaagaaaagaaagcattaa。当前第1页1 2 3