本发明涉及免疫细胞技术领域，尤其涉及一种黑色素瘤抗原特异性CTL及其制备方法。
背景技术：
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)是通过免疫治疗技术获得的细胞，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。CTL的作用机理如下：
机体存在庞大的T淋巴细胞库，通过其表面表达不同的T淋巴细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有灭杀靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分为四个阶段：
1、抗原识别：APC(专职抗原递呈细胞，如DC细胞)通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤抗原多肽)；
2、抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；
3、T淋巴细胞激活(双信号学说)：APC与T淋巴细胞相遇，T淋巴细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T淋巴细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T淋巴细胞识别MHC-II-多肽复合物，T淋巴细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用，即CTL；
4、靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。
但是，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。然而，现有技术中并未提供体外制备的黑色素瘤抗原特异性CTL，进而无法通过回输患者而直接、快速杀伤人类黑色素瘤细胞。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，旨在获得黑色素瘤抗原特异性CTL，而直接、快速杀伤人类黑色素瘤细胞。
为实现上述目的，本发明提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，包括步骤如下：
获取外周血单核细胞；
制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；
从所述外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；
用所述负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激所述CD8+T淋巴细胞；
采用Tetramer技术标记刺激后的所述CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；
刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。
优选地，所述制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：
合成黑色素瘤抗原多肽；
从所述外周血单核细胞中获得未成熟DC细胞；
将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞；
共培养所述成熟DC细胞与所述黑色素瘤抗原多肽，而制得负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞。
优选地，所述将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：
向所述未成熟DC细胞中加入含人AB血清、GM-CSF、IL-4和TGF-β1的RPMI-1640完全培养基；
4～10天后，加入含GM-CSF、IL-4、TNF、IL-6、IL-1β和PGE2的新鲜培养基；
24～72h后，加入含人β2-微球蛋白的无血清完全培养基，刺激1～4h后，获得成熟DC细胞。
优选地，所述RPMI-1640完全培养基中，人AB血清的体积百分比为5～20％，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml和TGF-β1的浓度为2～10ng/ml；所述新鲜培养基中，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml，TNF的浓度为5～20ng/ml，IL-6的浓度为500～2000U/ml，IL-1β的浓度为5～20ng/ml，PGE2的浓度为0.5～5μg/ml；所述无血清完全培养基中，人β2-微球蛋白的浓度为2～20μg/ml。
优选地，所述未成熟DC细胞与从所述外周血单核细胞中获取的CD8+T淋巴细胞的数量比为1:(6～10)。
优选地，所述刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞过程中，包括步骤如下：
辐照处理部分所述外周血单核细胞、和人EB病毒转化的B淋巴细胞；
将淋巴细胞活化刺激剂、和辐照后的所述外周血单核细胞、人EB病毒转化的B淋巴细胞刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞。
优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性黑色素瘤抗原多肽。
优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性Melan-A抗原多肽。
优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性gp100抗原多肽。
此外，为实现上述目的，本发明还提供一种如上所述的黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法所获得的黑色素瘤抗原特异性CTL。
本发明黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高达98％且杀伤人黑色素瘤细胞的杀伤效果好，在目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，高达到39％。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，包括步骤如下：
S1、获取外周血单核细胞；
S2、制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；
S3、从外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；
S4、用负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激CD8+T淋巴细胞；
S5、采用Tetramer技术标记刺激后的CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；
S6、刺激Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。
本发明黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法通过负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)，不仅供给T淋巴细胞活化的第一信号(黑色素瘤抗原)，而且DC细胞供给T淋巴细胞活化必须的第二信号(免疫共刺激分子CD40、CD80、CD83等)；然后，分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响；最后，经刺激增殖获得目标CTL；该制备方法制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高达98％且杀伤人黑色素瘤细胞的杀伤效果好，在目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，高达到39％。
需要说明的是，该外周血单核细胞通过自动单核细胞采集仪从采集的患者(已签署知情同意书)的外周血中分离得到，获得的外周血单核细胞至少分为三部分：部分用于制备DC细胞，部分用于分离出CTL前体细胞，部分用于辐照处理。该黑色素瘤抗原多肽可以为多种，由于均可被T淋巴细胞所识别，进而均可以刺激T淋巴细胞产生第一信号，同时也均可被DC细胞所抗原递呈而实现抗原多肽的负载，因此，该黑色素瘤抗原多肽可以选自下表1中的任意一种黑色素瘤抗原：
表1、T淋巴细胞识别的人黑色素瘤抗原
其中，Melan-A/MART-1(melanoma antigen recognized by T cell 1)为人黑色素瘤上第4个自身分化抗原，由含有5个外显子、长约18.5kb的基因编码。gp100又称黑色素细胞/黑色素瘤特异性蛋白Pmel17，免疫电镜证实gp100主要位于I、II期黑色素小体膜状、丝状基质中，其广泛表达于人黑色素瘤(50％)。进一步地，该黑色素瘤抗原多肽的抗原表位可以为HLA-A3、HLA-A68、HLA-A2或HLA-A24，进而均可与相应的T淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活T淋巴细胞，引起免疫应答；其中HLA-A2是最常见的HLA基因型，约50％的白种人、亚洲人和西班牙人及33％的非洲人和美洲人具有这种表型，我国是HLA-A2的高阳性地区，约50％左右的人表达HLA-A2抗原，加之HLA-A2基因型与黑色素瘤密切相关，所以HLA-A2限制性CTL表位更具针对性，也更有现实意义。
进一步地，步骤S2具体包括步骤如下：
S20、合成黑色素瘤抗原多肽；
S21、从外周血单核细胞中获得未成熟DC细胞；
S22、将未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞；
S23、共培养成熟DC细胞与黑色素瘤抗原多肽，而制得负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞。
通过成熟DC细胞与黑色素瘤抗原多肽的共培养，DC细胞识别并捕获抗原多肽，抗原多肽经DC细胞消化、裂解成多肽分子，后者与DC细胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至DC细胞表面，而实现成熟DC细胞的抗原负载，进而可以刺激T淋巴细胞活化；而且，成熟DC细胞制备简捷、时间短、效率高。
进一步地，步骤S22具体包括步骤如下：
S220、向未成熟DC细胞中加入含人AB血清、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-4和TGF-β1(转化生长因子-β1)的RPMI-1640完全培养基；
S221、4～10天后，加入含GM-CSF、IL-4、TNF(肿瘤坏死因子)、IL-6、IL-1β和PGE2(前列腺素E2)的新鲜培养基；
S222、24～72h后，加入含人β2-微球蛋白(micro-globulin)的无血清完全培养基，刺激1～4h后，获得成熟DC细胞。
通过不同培养基的刺激，加速了DC细胞的成熟，同时促进DC细胞的增殖，进而极大缩短制备时间，提高制备效率。
进一步地，RPMI-1640完全培养基中，人AB血清的体积百分比为5～20％，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml和TGF-β1的浓度为2～10ng/ml。新鲜培养基中，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml，TNF的浓度为5～20ng/ml，IL-6的浓度为500～2000U/ml，IL-1β的浓度为5～20ng/ml，PGE2的浓度为0.5～5μg/ml。无血清完全培养基中，人β2-微球蛋白的浓度为2～20μg/ml。
在上述用量范围内的细胞生长因子可以为DC细胞的成熟提供足够的刺激，且有利于DC细胞的快速成熟以及增殖。
进一步地，未成熟DC细胞与从外周血单核细胞中获取的CD8+T淋巴细胞的数量比为1:(6～10)。
在该细胞数量的比值范围之内，通过未成熟DC细胞转化的负载抗原多肽的成熟DC细胞可以为CD8+T淋巴细胞提供足够的刺激作用，进而促使CD8+T淋巴细胞产生目标CTL。
进一步地，步骤S5具体为：采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术再一次纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞，剔除非特异性扩增的T淋巴细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响。
进一步地，在步骤S6中，刺激Tetramer+CD8+T淋巴细胞的过程具体包括步骤如下：
S60、辐照处理部分外周血单核细胞、和人EB病毒转化的B淋巴细胞；
S61、将淋巴细胞活化刺激剂、和辐照后的外周血单核细胞、人EB病毒转化的B淋巴细胞刺激Tetramer+CD8+T淋巴细胞。
通过淋巴细胞活化刺激剂、和辐照后的外周血单核细胞、人EB病毒转化的B淋巴细胞的刺激，促进T淋巴细胞的增殖，加快细胞的生长，且PBMC表面表达大量共刺激分子并分泌多种细胞因子提供CTL良好的生长环境，且经辐照后不会增殖而干扰CTL的生长，从而保证CTL的高效扩增。
本发明还提供一种上述黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法所制备的黑色素瘤抗原特异性CTL，其杀伤人黑色素瘤细胞的效果好，在目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，高达到39％。
现通过实施例对本发明黑色素瘤抗原特异性CTL及其制备方法做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。
实施例1
Melan-A抗原特异性CTL的制备
一、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的获取
PBMCs的采集及纯化：用单采仪采集患者的外周血单核细胞，经Ficoll密度梯度离心法后纯化PBMCs。纯化后的PBMCs部分用于DC细胞诱导，部分用于CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)的富集与纯化，部分经γ射线照射并冻存于-80℃。
二、负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞的制备
1、HLA-A2限制性Melan-A抗原多肽的合成
HLA-A2限制性Melan-A抗原多肽，位点为26～35，序列为ELAGIGILTV10肽(以下简称Melan-A26～35多肽)，化学合成(南京肽业生物科技有限公司)，以无菌双蒸水充分溶解，Melan-A26～35多肽浓度为5mg/ml，分装保存于-80℃；其中，Melan-A26～35多肽片段为Melan-A26～35peptide(ELAGIGILTV)；
2、未成熟DC细胞的制备
DC细胞的贴壁法制备：将纯化后的部分PBMCs悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为3×106/ml，接种于75cm2培养瓶中，并于5％CO2，37℃培养箱内孵育90分钟，用预温生理盐水轻轻洗涤2～3次，形成贴壁细胞，即未成熟DC细胞；
3、未成熟DC细胞的诱导
于盛有贴壁细胞的培养瓶中加入30ml的DC诱导培养基，该DC诱导培养基为含10％(V/V)的人AB血清、浓度800U/ml的GM-CSF、浓度500U/ml的IL-4和浓度5ng/ml的TGF-β1的RPMI-1640完全培养基；第6天，加入含浓度800U/ml的GM-CSF、浓度500U/ml的IL-4、浓度10ng/ml的TNF、浓度1000U/ml的IL-6、浓度10ng/ml的IL-1β和浓度1μg/ml的PGE2的新鲜培养基，继续培养48h后，加入含浓度10μg/ml的人β2-微球蛋白的无血清完全培养基，在37℃条件下刺激2h，获得成熟DC细胞；
4、成熟DC细胞的抗原负载
成熟DC细胞负载Melan-A26～35多肽：将收获的成熟DC细胞悬浮于RPMI-1640培养基中，细胞密度为1×106/ml，并接种于细胞培养6孔板内，每孔3ml，于孔内加入Melan-A26～35多肽至终浓度为30μg/ml，放置于37℃，5％CO2培养箱内共育2小时后收获负载Melan-A26～35多肽的成熟DC细胞；收获的细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，再用RPMI-1640培养基重悬，细胞密度为1×106/ml，用于CTL前体细胞的刺激。
三、CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)的分离与纯化
于负载Melan-A26～35多肽的成熟DC细胞收获当天，解冻复苏纯化后的部分PBMCs，并用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤PBMCs 2次，并重悬PBMC细胞，调整PBMC细胞密度为2×107/ml，于PBMCs细胞中加入临床级CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠(Miltenyi CliniMACS)，共育30分钟后过柱，收集流出的CD8+T淋巴细胞；用预冷的RPMI-1640培养基洗涤2次，将CD8+T淋巴细胞重悬于含10％灭活的混合正常人AB血清的RPMI-1640完全培养基中，CD8+T淋巴细胞的密度为1×106/ml，而获得纯化后的CD8+T淋巴细胞。其中，纯化后用于扩增的CTL前体细胞与未成熟DC细胞的数量比为8:1。
四、CTL前体细胞的扩增(负载抗原多肽的成熟DC细胞刺激CTL前体细胞)
将纯化后的CD8+T淋巴细胞接种于细胞培养96孔板中，加入负载Melan-A26～35多肽的成熟DC细胞，每周刺激一次，轻轻混匀后放入5％CO2，37℃细胞培养箱内培育；每日观察细胞的生长状态，每周补充两次含3％的T淋巴细胞生长因子(TCGF)的完全培养基；细胞密度过大时进行扩瓶，细胞增殖到一定量后可移至75cm2培养瓶中继续扩增培育；其中，TCGF完全培养基包括：10ng/ml的重组人细胞因子、800U/ml的GM-CSF、500U/ml的IL-4、5ng/ml的TGF-β1、10ng/ml的IL-1β、1000U/ml的IL-6、10ng/ml的TNF、2000U/ml的interferon-γ(IFN-γ)和1μg/ml的PGE2。
五、扩增后的CTL前体细胞的分选纯化
负载Melan-A26～35多肽的DC细胞与CD8+T淋巴细胞共育12～14天后，收获细胞，用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，于细胞悬液中加入PE标记的HLA-A2+Melan-A26～35 Tetramer和FITC标记的CD8mAb，轻轻混匀后，于4℃冰箱中共育20分钟；用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，将细胞进行流式分选，收获CD8+Tetramer+T淋巴细胞，离心后弃上清，用含10％灭活的混合正常人AB血清的RPMI-1640完全培养基重悬CD8+Tetramer+T淋巴细胞，细胞密度为2×106/ml。
六、CD8+Tetramer+T淋巴细胞的扩增
以辐照的同种异体的人EB病毒转化的B淋巴细胞、辐照的同种异体PBMCs和淋巴细胞活化刺激剂PHA-L(1mg/ml)重复刺激CD8+Tetramer+T淋巴细胞，而进行扩增；其中，辐照的同种异体PBMCs是通过下述方法制备得到的：
留取部分步骤一中获得的PBMCs，经30～50GY(平均40GY)的γ射线辐照后于保存液中保存；其中，保存温度为-80℃超低温保存，保存液为含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液。
七、目标CTL的收获与表型检测
CD8+Tetramer+T淋巴细胞扩增10天左右，收获目标CTL，然后，用生理盐水洗涤2次，重悬于100ml生理盐水中，细胞密度为107/ml左右，用于免疫治疗。
八、目标CTL的杀伤能力
将制备的目标CTL分别与负载Melan-A26～35多肽的HLA-A2+T2细胞株、HLA-A2+T2空载细胞株及K562(NK敏感细胞株)三种靶细胞按照效靶比3：1、10：1和30：1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本实施例1制备的目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，达到35.5％。
本发明实施例1中各步骤操作后细胞数量和表型特征见如下表2：
表2
实施例2
gp100抗原特异性CTL的制备
一、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的获取
PBMCs的采集及纯化：用单采仪采集患者的外周血单核细胞，经Ficoll密度梯度离心法后纯化PBMCs。纯化后的PBMCs部分用于DC细胞诱导，部分用于CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)的富集与纯化，部分经γ射线照射并冻存于-80℃。
二、负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞的制备
1、HLA-A2限制性gp100抗原多肽的合成
HLA-A2限制性gp100抗原多肽，位点为209～217，序列为ITDQVPFSV 9肽(以下简称gp100209～217多肽)，化学合成(南京肽业生物科技有限公司)，以无菌双蒸水充分溶解，gp100209～217多肽浓度为5mg/ml，分装保存于-80℃。其中，HLA-A2限制性抗gp100抗原多肽片段为gp100209～217(ITDQVPFSV)。
2、未成熟DC细胞的制备
DC细胞的贴壁法制备：将纯化后的部分PBMCs悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为3×106/ml，接种于75cm2培养瓶中，并于5％CO2，37℃培养箱内孵育90分钟，用预温生理盐水轻轻洗涤2～3次，形成贴壁细胞，即未成熟DC细胞；
3、未成熟DC细胞的诱导
于盛有贴壁细胞的培养瓶中加入30ml的DC诱导培养基，该DC诱导培养基为含10％(V/V)的人AB血清、浓度800U/ml的GM-CSF、浓度500U/ml的IL-4和浓度5ng/ml的TGF-β1的RPMI-1640完全培养基；第6天，加入含浓度800U/ml的GM-CSF、浓度500U/ml的IL-4、浓度10ng/ml的TNF、浓度1000U/ml的IL-6、浓度10ng/ml的IL-1β和浓度1μg/ml的PGE2的新鲜培养基，继续培养48h后，加入含浓度10μg/ml的人β2-微球蛋白的无血清完全培养基，在37℃条件下刺激2h，获得成熟DC细胞；
4、成熟DC细胞的抗原负载
成熟DC细胞负载gp100209～217多肽：将收获的成熟DC细胞悬浮于RPMI-1640培养基中，细胞密度为1×106/ml，并接种于细胞培养6孔板内，每孔3ml，于孔内加入gp100209～217多肽至终浓度为30μg/ml，放置于37℃，5％CO2培养箱内共育2小时后收获负载gp100209～217多肽的成熟DC细胞；收获的细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，再用RPMI-1640培养基重悬，细胞密度为1×106/ml，用于CTL前体细胞的刺激。
三、CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)的分离与纯化
于负载gp100209～217多肽的成熟DC细胞收获当天，解冻复苏纯化后的部分PBMCs，并用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤PBMCs 2次，并重悬PBMC细胞，调整PBMC细胞密度为2×107/ml，于PBMCs细胞中加入临床级CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠(Miltenyi CliniMACS)，共育30分钟后过柱，收集流出的CD8+T淋巴细胞；用预冷的RPMI-1640培养基洗涤2次，将CD8+T淋巴细胞重悬于含10％灭活的混合正常人AB血清的RPMI-1640完全培养基中，CD8+T淋巴细胞的密度为1×106/ml，而获得纯化后的CD8+T淋巴细胞。其中，纯化后用于扩增的CTL前体细胞与未成熟DC细胞的数量比为8:1。
四、CTL前体细胞的扩增(负载抗原多肽的成熟DC细胞刺激CTL前体细胞)
将纯化后的CD8+T淋巴细胞接种于细胞培养96孔板中，加入负载gp100209～217多肽的成熟DC细胞，每周刺激一次，轻轻混匀后放入5％CO2，37℃细胞培养箱内培育；每日观察细胞的生长状态，每周补充两次含3％的T淋巴细胞生长因子(TCGF)的完全培养基；细胞密度过大时进行扩瓶，细胞增殖到一定量后可移至75cm2培养瓶中继续扩增培育；其中，TCGF完全培养基包括：10ng/ml的重组人细胞因子、800U/ml的GM-CSF、500U/ml的IL-4、5ng/ml的TGF-β1、10ng/ml的IL-1β、1000U/ml的IL-6、10ng/ml的TNF、2000U/ml的interferon-γ(IFN-γ)和1μg/ml的PGE2。
五、扩增后的CTL前体细胞的分选纯化
负载gp100209～217多肽的DC细胞与CD8+T淋巴细胞共育12～14天后，收获细胞，用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，于细胞悬液中加入PE标记的HLA-A2+gp100209～217Tetramer和FITC标记的CD8mAb，轻轻混匀后，于4℃冰箱中共育20分钟；用预冷的含2％灭活的混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，将细胞进行流式分选，收获CD8+Tetramer+T淋巴细胞，离心后弃上清，用含10％灭活的混合正常人AB血清的RPMI-1640完全培养基重悬CD8+Tetramer+T淋巴细胞，细胞密度为2×106/ml。
六、CD8+Tetramer+T淋巴细胞的扩增
以辐照的同种异体的人EB病毒转化的B淋巴细胞、辐照的同种异体PBMCs和淋巴细胞活化刺激剂PHA-L(1mg/ml)重复刺激CD8+Tetramer+T淋巴细胞，而进行扩增；其中，辐照的同种异体PBMCs是通过下述方法制备得到的：
留取部分步骤一中获得的PBMCs，经30～50GY(平均40GY)的γ射线辐照后于保存液中保存；其中，保存温度为-80℃超低温保存，保存液为含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液。
七、目标CTL的收获与表型检测
CD8+Tetramer+T淋巴细胞扩增10天左右，收获目标CTL，然后，用生理盐水洗涤2次，重悬于100ml生理盐水中，细胞密度为107/ml左右，用于免疫治疗。
八、目标CTL的杀伤能力
将制备的目标CTL分别与负载gp100209～217多肽的HLA-A2+T2细胞株、HLA-A2+T2空载细胞株及K562(NK敏感细胞株)三种靶细胞按照效靶比3：1、10：1和30：1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本实施例1制备的目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，达到39.1％。
本发明实施例2中各步骤操作后细胞数量和表型特征见如下表3：
表3
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。